一种果胶-阿霉素轭合物及其中间体的制备方法
阅读说明：本技术 一种果胶-阿霉素轭合物及其中间体的制备方法 (Preparation method of pectin-adriamycin conjugate and intermediate thereof ) 是由 唐小海 陈锞 于 2020-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种果胶-阿霉素轭合物及其中间体的制备方法。本发明的技术方案通过对果胶-阿霉素轭合物重要中间体的合成的整体路线进行重新设计,提高了合成该中间体小分子化合物的纯度和总收率,具有收率高、后处理简便易纯化的优点；同时节约了两个昂贵的重要原料Fmoc-NH-PEG-8-COOH与阿霉素的用量,减少了其它试剂的耗费,大大降低了成本,提高效率,减少了废料的生成,利于环保,适合大规模生产。(The invention relates to a pectin-adriamycin conjugate and a preparation method of an intermediate thereof. The technical scheme of the invention improves the purity and the total yield of the intermediate micromolecule compound by redesigning the integral route of the synthesis of the important intermediate of the pectin-adriamycin conjugate, and has the advantages of high yield, simple and convenient post-treatment and easy purification; saves two expensive important raw materials of Fmoc-NH-PEG 8 The consumption of the-COOH and the adriamycin reduces the consumption of other reagents, greatly reduces the cost, improves the efficiency, reduces the generation of waste materials, is beneficial to environmental protection and is suitable for large-scale production.)
技术领域
本发明涉及药物制备方法领域，特别是涉及一种果胶-阿霉素轭合物及其中间体的制备方法。
背景技术
“果胶-阿霉素轭合物”靶向药物递送系统(PAC)是在大量前期工作和文献研究的基础上，选定果胶作为高分子抗癌前药的载体，并通过对果胶的结构进行修饰，使其可以与多肽-阿霉素共价结合形成水溶性的具有高载药量的果胶-阿霉素轭合物。
PAC是高分子轭合物，粒径在200nm左右，注射后进入循环系统的部分药物可以利用肿瘤组织对大分子物质具有的增强通透和潴留效应(EPR)而蓄积于肿瘤组织中，达到被动靶向的目的。PAC在肿瘤组织中逐渐被肿瘤细胞吞噬，在溶酶体中水解释放出阿霉素，发挥杀伤肿瘤的作用。申请号为CN201910524576.0的专利申请中公开了一种果胶-阿霉素轭合物，克服了果胶和阿霉素直接通过酰胺键键合或酰腙键键合难溶于水而导致的抗肿瘤疗效不佳的问题，但其公开的生产工艺存在诸多问题，例如总收率较低、后处理困难、放大生产存在极大障碍等。上述生产工艺采用的是先将阿霉素接在Fmoc-Val-Ala-PABC(实际上为Fmoc-Val-Ala-PABC-PNPO)中间体上，得到重要中间体Fmoc-Val-Ala-PABC-DOX，再脱除芴甲氧羰酰保护基，得到的Val-Ala-PABC-DOX与Fmoc-NH-PEG8-COOH缩合得到Fmoc--NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-DOX。在这个过程中会遇到两个难度大，且工艺存在严重缺陷的问题：1)脱除芴甲氧羰酰保护基(Fmoc)不易放大，脱掉保护基后的碱性氨基易与阿霉素反应，过程难以控制，产品不易纯化；2)Val-Ala-PABC-DOX与Fmoc-NH-PEG8-COOH缩合的反应转化率不高，副产物生成较多，在处理纯化过程中必须采用柱层析(通过正相体系柱层析几乎无法解决存在的吸附拖尾)，且分离困难，收率低。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种收率高、后处理简便、生产成本低、利于环保、适合大规模生产的果胶-阿霉素轭合物及其中间体的制备方法。
本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种果胶-阿霉素轭合物中间体的制备方法，所述果胶-阿霉素轭合物中间体具有如式(I)所示结构：
b-c-d-e(I)
式(I)中，b的主体结构为PEGn，c为酶促裂解集团、多肽或多肽衍生物，d为自降解基团，e为阿霉素DOX；
所述果胶-阿霉素轭合物药物，具有结构：聚合物-肽连接子-阿霉素偶联药物a-b-c-d-e，其中聚合物a优选果胶；
基于聚合物的阿霉素偶联药物的肽连接子中间体b-c-d-e经优化的制备方法的具体步骤如下：
1)由Fmoc-b-c-d制备Fmoc-b-c-d-e；
2)在非亲核碱性试剂存在下脱去Fmoc保护基得到b-c-d-e。
进一步地，式(I)中，n为1-20的整数，c为二肽、二肽衍生物、三肽、三肽衍生物、四肽或四肽衍生物中的任意一种；
进一步地，n为6-12的整数；再优选的，n为8；
进一步地，c为Val-Ala；
进一步地，d在直接与e连接的情况下表示自降解基团氨基苄氧羰基；
进一步地，d在未与e连接的情况下可表示与保护基连接的自降解集团氨基苄氧羰基；再优选的，所述氨基苄氧羰基为对氨基苄氧羰基，即PABC。
进一步地，所述非亲核碱性试剂为DBU；
进一步地，b通过羰基与c形成酰胺键相连接；再优选的，PEG8通过额外的羰基与c形成酰胺键相连接；
进一步地，b通过氨基与Fmoc形成酰胺键相连接；再优选的，PEG8通过额外的氨基与Fmoc形成酰胺键相连接；
再进一步地，b为NH2-PEGn-CO-。
进一步地，具体步骤如下：
1)由Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC不经过或经过Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-PNPO制备-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-DOX，PNPO表示对硝基苯氧基；
2)在DBU存在下Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-DOX脱去保护基得到NH2-PEGn-CO-Val-Ala-PABC-DOX。
进一步地，由Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABOH与DPNP在DIEA存在下反应制得Fmoc-NH-PEG8-CO-Ala-PABC-PNPO，DPNP为二(对硝基苯)碳酸酯。
进一步地，由Val-Ala-PABOH与Fmoc-NH-PEG8-COOH反应制得Fmo-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABOH。
进一步地，由Fmoc-Val-Ala-PABOH在DEA存在下脱Fmoc保护基制得Val-Ala-PABOH。
进一步地，具体步骤如下：
进一步地，所述Fmoc-NH-PEG8-COOH结构如下所示：
本发明还提供了一种果胶-阿霉素轭合物的制备方法，将式(13)化合物与前述制备方法制备得到的NH2-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-DOX在碱性试剂存在的条件下反应制备果胶-阿霉素轭合物，
式(13)中，a为选自2-4的整数，m为1-60KD。
本发明的优点和效果：
1)该路线基本解决了之前存在的大量问题，可以把相关步骤的合成工艺做到可行可控，首先，通过对合成小分子化合物的整体路线进行重新设计，将合成小分子化合物的总收率从1.9％提高到20.1％，基本解决了之前通过正相体系柱层析几乎无法解决存在的吸附拖尾等未能解决的工艺问题；其次，采用DBU这种优良的非亲核碱性有机试剂来脱除Fmoc，取得了较好的效果，较之前的工艺有了重大突破，成功从一次性制备得到毫克级的量放大到克级规模，更利于大规模生产。
2)该路线解决了旧工艺路线中收率低，后处理困难的重大问题。同时节约了两个昂贵的重要原料Fmoc-NH-PEG8-COOH与阿霉素的用量，并且减少了其它溶剂试剂的耗费，大大降低了成本，提高效率，减少了废料的生成，利于环保，更加接近生产工艺。
附图说明
图1为制备NH2-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-DOX的工艺路线图。
具体实施方式
以下通过实施例，对本发明作进一步的具体说明，但这些实施例不对本发明有任何限制。
实施例1
将化合物1(100g，0.2946mol)溶于1LTHF中，依次加入NHS(37.2g，0.3231mol)，DCC(86g，0.4175mol)，室温搅拌4小时反应完毕。过滤除去白色固体，滤饼用THF(100ml*4)洗涤，收集滤液，将滤液真空浓缩得黄色胶状粗品，粗品用200ml石油醚打浆，析出白色固体，待固体完全分散，抽滤，滤饼石油醚(50ml*4)洗涤，得到134g白色固体化合物，收率98％。
实施例2
将化合物Fmoc-Val-OSu(134g，0.307mol)溶于1.35L THF，依次加入L-丙氨酸(29.2g，0.3277mol)、NaHCO3(27.3g，0.3277mol)、425ml H2O。室温搅拌27h，监控反应完毕。真空浓缩除去THF，溶液成胶状，加水(2L)稀释，用HCl溶液(2mol/ml)调节PH至3，析出固体，打浆过夜，抽滤，滤饼用H2O(100ml*4)洗涤后得粗品S3。粗品S3用EA:PE＝1:3(1.45L)打浆1h，抽滤，滤饼EA:PE 1:3(200ml*4)洗涤。得到114.5g白色固体化合物(Fmoc-Val-Ala-OH)，收率91％。
实施例3
将化合物Fmoc-Val-Ala-OH(82.52g，0.2015mol)加入反应瓶中，加入982ml DCM成悬浊液，依次加入4-氨基苄醇(30.24g，0.24555mol)、EEDQ(74.27g，0.30033mol)、最后加入512ml甲醇直到溶液澄清，室温反应5小时，抽滤得到白色固体，固体用DCM(100ml*3)洗涤。收集滤液，减压旋除DCM，剩余固体打浆2次，用DCM(50ml*3)洗涤，得到白色固体。合并两次白色固体，用DCM(200ml*2)洗涤，过滤后常温真空干燥，得到60.1g白色固体产品(Fmoc-Val-ALa-PABOH)，收率57％。
实施例4
将化合物Fmoc-Val-Ala-PABOH(20g，0.03879mol)加入反应瓶，用50ml DMF溶解后加入20ml DCM，加入DEA(3.9959ml，0.03879mol)，室温下反应2小时。用石油醚：二氯甲烷(10：1)的溶液萃取反应液8次后得到纯品黄色胶体化合物Val-Ala-PABCOH。将产物用40mlMeOH：DCM(1：1)溶解转移至圆底烧瓶，40℃真空旋蒸除去剩余的二乙胺。得到10.5g黄色胶体化合物(Val-Ala-PABOH)，收率92％。
实施例5
称取Fmoc-NH-PEG8-COOH(1.738g，2.6214mmol),用8ml DCM溶解到反应瓶中，加入HATU(1.396g，3.6715mmol)，将Val-Ala-PABOH(1g，3.4088mmol)用DCM 7ml溶解后加入反应瓶中，冰浴10分钟后加入DIPEA(685ul，3.9328mmol)，冰浴搅拌10分钟后恢复室温反应6小时。将反应液过滤，用DCM(5ml*3)洗涤，收集滤液。滤液用PH＝3的盐酸溶液(30ml*3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，固体用DCM (10ml*3)洗涤。30℃下减压除去溶剂，后用油泵真空干燥，得到2.678g黄色胶体化合物(Fmoc-PEG8-CO-Val-Ala-PABOH)，收率84％。
实施例6
将Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABOH(15.66g，0.01668mol)用110ml DCM溶解到反应管中，冰水浴10分钟后加入二(对硝基苯)碳酸酯(7.3g，0.02668mol)，接着加入DIPEA(6.54ml，0.04169mol)，冰浴搅拌10分钟后恢复室温反应过夜。将反应液用PH＝9(100ml*3)的碳酸钠水溶液洗涤，再用PH＝3的盐酸水溶液(100ml*3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，固体用DCM(10ml*3)洗涤。20°c真空旋蒸得到粗品，将粗品用40ml DCM溶解，滴入400ml快速搅拌下的甲基叔丁基醚中，过滤得到第一批次固体产品Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC和母液。将母液用20℃真空旋蒸得到粗品，将粗品用10ml DCM溶解，滴入100ml快速搅拌下的甲基叔丁基醚中过滤得到第二批次固体产品Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC，合并两批次得到14.3g黄色胶体产品(Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC)，收率78％。
实施例7
将Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC(552.3mg，0.5mmol)用3ml DMF溶解于反应管，冰浴10分钟后(外温5度左右)，加入DOX(阿霉素274.2mg，0.5112mmol)，
接着加入DIPEA(196ul，1.2822mmol)，冰浴下过夜反应。将反应液倒入搅拌下的甲基叔丁基醚:水1:1(30ml)中，得到红色胶状固体。红色胶状固体用DMF2ml溶解，甲基叔丁基醚:水1:1(20ml)重结晶，得到粗品1。粗品1用DCM 2ml溶解，倒入搅拌下的甲基叔丁基醚(20ml)中结晶，得到分散的暗红色固体，抽滤，固体用甲基叔丁基醚(5ml*3)洗涤，真空常温旋蒸，油泵干燥，得到505mg暗红色固体(Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-DOX)，收率67％。
实施例8
将Fmoc-NH-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-DOX(1g，0.663mmol)溶解于10ml DMF中，将DBU(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)(364mg，2.39mmol)用少量溶剂溶解后加入反应液中，反应45秒。将反应液倒入搅拌下的加入乳酸(480mg)的甲基叔丁基醚(100ml)中，得到红色胶状粗品1。粗品1用甲醇10ml溶解，倒入搅拌下的甲基叔丁基醚(100ml)中结晶，得到粗品2红色固体。粗品2用DCM:MeOH＝4:1(10ml)溶解，加入到100ml甲基叔丁基醚中结晶，得到900mg红色粉状固体(NH2-PEG8-CO-Val-Ala-PABC-DOX)，收率98％。
实施例9
称取如式13所示化合物(制备方法可参考CN201910524576.0)将其完全溶于DMF与DMSO的混合溶液中，加入式9所示化合物，搅拌均匀后加入DIEA，室温反应24h，然后将溶液直接用DMSO-水梯度透析，HPLC检测至无阿霉素及其衍生物，透析完成后冻干得果胶-阿霉素轭合物。
果胶-阿霉素轭合物的确认：
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm:14.04(s，1H)，13.27(s，1H)，9.88-9.90(s，1H)，8.33-6.81(m,10H)，5.47-3.39(m)，1.95-0.85(m).
果胶-阿霉素轭合物具有如下结构：
对照实施例
按照CN201910524576.0中记载的方法合成式9所示化合物：
具体收率如下所示：
化合物编号
2
3
4
5
6
7
8
9
总收率
收率
95％
94％
53％
25％
78％
66％
35％
90％
1.9％
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明及合成路线优化的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
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