半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法
阅读说明：本技术 半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法 (Method for culturing pichia pastoris engineering bacteria through semi-continuous fermentation ) 是由 赵枭阳 柴丹丹 李婷 李新乐 张晓雷 徐延伟 赵巧辉 李桂林 付光宇 吴学炜 杨 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物工程领域,具体涉及半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法。该方法以BSM为基础培养基,甲醇为诱导剂,进行毕赤酵母工程菌的连续发酵及外源蛋白的连续表达,接种后菌体重复利用,连续性强,工艺流程较批次发酵有了简化,大大减少了工作强度及工作量,外源蛋白收率较批式发酵提升了40％,本发明流程简单,成本较低,适用于工业化生产。(The invention relates to the field of bioengineering, in particular to a method for culturing pichia pastoris engineering bacteria through semi-continuous fermentation. The method uses BSM as a basic culture medium and methanol as an inducer to perform continuous fermentation of pichia pastoris engineering bacteria and continuous expression of foreign protein, the inoculated bacteria are recycled, the continuity is strong, the process flow is simplified compared with batch fermentation, the working intensity and the working amount are greatly reduced, the yield of the foreign protein is improved by 40% compared with batch fermentation, the process is simple, the cost is low, and the method is suitable for industrial production.)
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法。
背景技术
发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，一般分为批次发酵、补料批次发酵、连续发酵等。
八十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白(SCP)，有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX，其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
利用重组毕赤酵母进行发酵，生产外源蛋白，是一套非常完善的表达系统，已有上千种蛋白在该系统中成功表达，在制药领域已有胰岛素、白蛋白、乙肝抗原等多种蛋白使用毕赤酵母表达系统并实现商品化，因此高效的、工业化的发酵工艺研究一直是发酵人努力的方向。而毕赤酵母属于诱导型发酵，纵观行业现状，均以分批或补料分批的发酵形式为主，人、物力消耗巨大，每批发酵都要进行稀配、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，生产效率低下，因此，如何设计一种发酵效率高的发酵模式是本领域亟需解决的技术点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法。本发明将半连续发酵技术应用到毕赤酵母工程菌的培养当中，通过放掉部分发酵液、补充新鲜培养基的方式来补充新的营养物质、稀释代谢废物、缓解产物抑制，同时减少灭菌、接种、清洗等操作工序，提升生产效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法，包括如下步骤：
步骤1：制备种子液；
步骤2：上罐发酵；将步骤1制得的所述种子液接种至发酵培养基，经第一轮发酵，流加含PTM1的甘油，调节流加速率使溶氧不低于20％，取样获得湿重；流加甲醇诱导外源蛋白表达，根据溶氧调节流加速率，保证溶氧不低于20％；
步骤3：连续发酵；收集步骤2获得的部分发酵液，补加不含甘油的发酵培养基至诱导前的所述湿重，经第二轮发酵；
步骤4：重复步骤3，直至外源蛋白表达量不达标。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述种子液的制备方法为：取毕赤酵母菌接种到种子液培养基，30℃、230rpm培养至OD:5.0～8.0；
所述种子液培养基(BMGY)包括：Yeast extract 1％、Peptone 2％、磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L、YNB 1.34％、Biotin(4×10-5)％、Glycerol 1％。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述发酵培养基(BSM)包括：85％H3PO426.7ml/L、CaSO4·2H2O 0.93g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·2H2O 14.9g/L、KOH 4.13g/L、甘油40g/L，100％氨水调pH5.0，灭菌后添加PMT1 4.0ml/L；
所述PMT1包括：CuSO4·5H2O 6.0g/L、KI 0.088g/L、MnSO4·H2O 3.0g/L、Na2MoO4·2H2O 0.2g/L、H3BO3 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.5g/L、ZnCl2 20.0g/L、FeSO4·7H2O 65.0g/L、Biotin 0.2g/L、浓H2SO4 5.0ml。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述接种的接种量为5％，所述第一轮发酵具体为：温度30℃，搅拌转速300～600rpm，通气量1vvm，PH5.0，发酵至培养基养分耗尽。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第一轮发酵的时间为20h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述含PTM1的甘油为含12ml/L PTM1的体积浓度为50％甘油，所述含PTM1的甘油的流加量为每1L发酵培养基流加80ml所述含PTM1的甘油；所述流加含PTM1的甘油的时间为8h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述甲醇为含12ml/L PTM1的甲醇，所述流加甲醇的时间为120h。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述部分发酵液为50％v/v的发酵液。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中所述重复的次数至少为2次。
在本发明的一些具体实施方案中，所述毕赤酵母工程菌为毕赤酵母GS115。
本发明将半连续发酵技术应用到毕赤酵母工程菌的培养当中，通过放掉部分发酵液、补充新鲜培养基的方式来补充新的营养物质、稀释代谢废物、缓解产物抑制，所用补料培养基为BSM基础发酵培养基(不含甘油)，目的在于补料培养基不再以甘油作为碳源提升细胞密度，直接以甲醇进行诱导表达，意义在于维持半连续发酵的批次之间细胞生长状态及密度的相对稳定。同时减少灭菌、接种、清洗等操作工序，提升生产效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示半连续发酵阶段间湿重变化趋势对比；
图2示半连续发酵阶段间上清蛋白浓度变化趋势对比；
图3示半连续发酵阶段间目的蛋白量变化趋势对比。
具体实施方式
本发明公开了一种半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法。
本发明采用以下技术方案：
①种子液制备
将毕赤酵母菌接种到种子液培养基中，培养方法为：温度为30℃、搅拌转速为230rpm；种子液培养基组分(BMGY)：Yeast extract 1％、Peptone 2％、磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L、YNB 1.34％、Biotin(4×10-5)％、Glycerol 1％。
②上罐发酵
基础发酵培养基组分(BSM)：85％H3PO4 26.7ml/L、CaSO4·2H2O 0.93g/L、K2SO418.2g/L、MgSO4·2H2O 14.9g/L、KOH 4.13g/L、甘油40g/L，100％氨水调pH5.0，灭菌后添加PMT1 4.0ml/L。
PMT1组分：CuSO4·5H2O 6.0g/L、KI 0.088g/L、MnSO4·H2O 3.0g/L、Na2MoO4·2H2O0.2g/L、H3BO3 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.5g/L、ZnCl2 20.0g/L、FeSO4·7H2O 65.0g/L、Biotin 0.2g/L、浓H2SO4 5.0ml。
将步骤①所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量5％，培养方法为：温度30℃，搅拌转速300-600rpm，通气量1vvm，pH5.0，发酵至培养基养分耗尽，以溶氧快速上升为标志，过程需要约20小时，随后流加50％甘油(含12ml/L PTM1)，根据溶氧调节流加速率，保证溶氧不低于20％，50％的甘油流加量为80ml/L发酵培养基。当甘油流加完毕后，取样记录菌体湿重(诱导前湿重)，流加甲醇(含12ml/L PTM1)进行外源蛋白诱导表达，根据溶氧调节流加速率，保证溶氧不低于20％。
③连续发酵
发酵120小时后，放出50％的料液进行收获，向发酵罐中补加基础发酵培养基(不含甘油)至湿重等同于诱导前湿重，而后开始新一轮发酵，发酵条件相同，下一批次继续重复以上操作，直至外源蛋白表达量不达标。
甘油是碳源，培养阶段使用，起到提高细胞密度的作用，甲醇即是碳源又是诱导剂，在诱导阶段使用，主要作用在诱导外源蛋白表达，同时又可以作为碳源供细胞代谢，进行一次放补料，补充完成之后湿重处在培养阶段后、诱导阶段前这一节点，认为应该直接进行甲醇诱导，发酵液中应没有未被消耗的甘油，因此添加不含甘油的BSM。综上，所用补料培养基为BSM基础发酵培养基(不含甘油)，目的在于补料培养基不再以甘油作为碳源提升细胞密度，直接以甲醇进行诱导表达，意义在于维持半连续发酵的批次之间细胞生长状态及密度的相对稳定。
本发明提供的方法以BSM为基础培养基，甲醇为诱导剂，进行毕赤酵母工程菌的连续发酵及外源蛋白的连续表达，接种后菌体重复利用，连续性强，工艺流程较批次发酵有了简化，大大减少了工作强度及工作量，外源蛋白收率较批式发酵提升了40％，本发明流程简单，成本较低，适用于工业化生产。
本发明提供的半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
①采用30L发酵罐，按照5％的接种比例将500ml种子液接种于10LBSM培养基中，搅拌速度300rpm，通气量1vvm，罐压0.05MP，30℃、pH5.0培养至溶氧突升，培养过程中当溶氧将至20％以下时逐级提升转速至700rpm。
②流加50％甘油800ml(含12ml/L PTM1)，控制速率使溶氧不低于20％，完成后取样测定湿重约180g/L，整个过程约8小时。
③流加甲醇(含12ml/L PTM1)进行诱导，控制速率使溶氧不低于20％，持续进行120h。
④诱导120h后放出50％的料液进行收获，向发酵罐中补加无菌BSM基础发酵培养基(不含甘油)至湿重等同于诱导前湿重。
⑤再次流加甲醇(含12ml/L PTM1)进行诱导，控制速率使溶氧不低于20％，持续进行120h。
⑥诱导120h后放出50％的料液进行收获，向发酵罐中补加无菌BSM基础发酵培养基(不含甘油)至湿重等同于诱导前湿重。
⑦如此往复进行三次，此处将整个往复过程描述为四个阶段，第一个阶段指从开始流加甲醇至第一次放料前，第二个阶段指从第一次补料后至第二次放料前，第三个阶段指从第二次补料后至第三次放料前，第四个阶段指从第三次补料后至发酵结束，结果如下：
表1：半连续发酵结果梳理
实施例2
对发酵过程样品进行湿重、浓度、电泳分析。测定方法为：发酵罐取样口取发酵液30ml，用已知重量的离心管10000转离心10分钟，湿重：弃上清后称重，重量减去离心管重量即为湿重；浓度：取上清采用G250法测定蛋白浓度；电泳：采用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法进行电泳分析。结果如图1～图3、表2～表3所示。
由图1、图2、图3可知，4个阶段的菌体湿重、上清蛋白浓度、目的蛋白含量具有相同的变化趋势，通过连续循环三次发酵，从第二次发酵开始发酵时间比第一次发酵时间大大缩短，菌体湿重、上清蛋白浓度、目的蛋白含量具有相同的变化趋势，酵母活力没有明显呈现下降的趋势。
表2：半连续发酵阶段间湿重变化趋势对比数据
表3：半连续发酵阶段间上清蛋白浓度变化趋势对比数据
实施例3
发酵液收获之后，发酵上清使用镍柱纯化，结果如下：
表4：纯化结果梳理
半连续发酵与分批发酵生产效率对比：
表5
半连续发酵与分批发酵人工、能耗比：
表6
发酵类型
平均人工
平均能耗
平均水耗
半连续发酵
1.25人/天
25度/天
2.5L/天
分批发酵
1.8人/天
32度/天
10L/天
比值
0.69:1
0.78:1
0.25:1
结果表明，半连续发酵菌体重复利用，连续性强，工艺流程较批次发酵有了简化，大大减少了工作强度及工作量，除此之外半连续发酵生产效率较分批发酵，提高了40％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。