具体实施方式

本发明提供了GYY4137在制备抑制血管内皮细胞活性降低、抑制血管内皮细胞焦亡关键蛋白表达上调、抑制血管内皮细胞焦亡关键酶Caspase-1活性、抑制血管内皮细胞焦亡或修复血管内皮细胞炎性损伤的药物中的应用。

在本发明中，所述GYY4137是具有血管扩张和抗高血压活性的H₂S的小分子释放剂，为缓释型H₂S供体，GYY4137所释放的硫化氢可以直接作为有效成分发挥作用；所述GYY4137来源于常规市售，优选的购自于美国Sigma-Aldrich公司(货号：SML0100)；所述GYY4137在使用过程中配置溶液时采用的试剂优选为二甲基亚砜(DMSO)和水；所述GYY4137在水中的溶解度为1～30mg/mL。

在本发明中，所述的血管内皮细胞活性降低、血管内皮细胞焦亡关键酶Caspase-1活性升高、血管内皮细胞焦亡关键蛋白表达上调、血管内皮细胞焦亡或血管内皮细胞炎性损伤优选的由心血管疾病致病因素引起。

在本发明中，所述心血管疾病致病因素优选的包括第一因素和/或第二因素；所述第一因素为oxLDL；所述第二因素为Hcy和LPS。

在本发明中，所述血管内皮细胞焦亡关键酶优选的包括Caspase-1。

在本发明中，所述血管内皮细胞焦亡关键蛋白优选的包括NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N和IL-18中的一种或几种。

在本发明中，所述血管内皮细胞优选的包括人脐静脉内皮细胞。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1材料

1.1细胞 人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)购自美国American Type Culture Collection(ATCC)实验室。

1.2药物和试剂 内皮细胞专用培养液和胎牛血清购自美国Sciencell公司；氧化低密度脂蛋白(oxLDL)购自广州奕源生物科技有限公司，同型半胱氨酸(Hcy)、脂多糖(LPS)、H₂S供体GYY4137及内源性H₂S合成酶抑制剂DL-炔丙基甘氨酸(D,L-propargylglycine,PAG)购自美国Sigma-Aldrich公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司；Hoechst33342/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双染试剂盒和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)细胞毒性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Caspase-1活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞蛋白抽提试剂盒和脱脂奶粉均购自北京索莱宝科技有限公司；NLRP3兔多克隆抗体、Pro-Caspase-1兔单克隆抗体、Caspase-1(P20亚单位)兔多克隆抗体、GSDMD兔单克隆抗体、GSDMD-N兔单克隆抗体末端片段抗体购自英国Abcam公司，IL-18兔单克隆抗体购自武汉三鹰公司，GAPDH鼠单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记二抗(HRP山羊抗兔或HRP山羊抗小鼠)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫印迹化学发光底物试剂盒购自美国Millipore公司。

1.3主要仪器 CO₂培养箱(Thermo Fisher Scientific公司)；高速低温冷冻离心机(Eppendorf公司)；自动酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)；倒置荧光显微镜(SANYO公司)；电泳仪和转膜仪(北京六一生物科技有限公司)。

2方法

2.1细胞培养 将冻存复苏的HUVECs以2×10⁶细胞/L接种于25cm²细胞培养瓶中，使用内皮细胞专用培养液(含5％胎牛血清、1％双抗和1％内皮生长因子)在细胞培养箱(37℃、5％CO₂及饱和湿度)中培养，根据细胞生长速度，每隔2～3天更换细胞培养液并传代，取2～4代处于对数生长期的HUVECs进行内皮细胞鉴定(内皮细胞特异性标记CD31阳性率≥95％)及后续研究，根据不同实验目的，调整接种时的细胞密度为1×10⁶～5×10⁶细胞/mL。

2.2药物干预与分组

2.2.1药物干预浓度筛选 药物干预之前将处于对数生长期(汇合率为80％～90％)的HUVECs接种于含5％胎牛血清培养液的96孔培养板(接种密度为8×10³细胞/孔)中贴壁4h，之后更换为无血清培养液饥饿培养12h，最后使用不同药物对其进行处理。采用不同浓度的oxLDL(25、50、100mg/L)、Hcy(50、100、250、500μmol/L)+LPS(1、10μg/mL)、PAG(1、5、10mmol/L)和GYY4137(50、100、200μmol/L)以及指定药物组合(GYY4137(50、100、200μmol/L)预处理4h，再加入100mg/L oxLDL或Hcy(500μmol/L)+LPS(10μg/mL)或Hcy(500μmol/L)+LPS(10μg/mL)+PAG(5mmol/L)继续培养24h)于含1％血清完全培养液中处理HUVECs24h，再采用CCK-8法(参见2.3细胞活性检测)检测不同浓度的oxLDL、Hcy+LPS、PAG、GYY4137对HUVECs细胞活性、Caspase-1酶活性、细胞焦亡及其信号通路关键标志蛋白表达的影响，并从中筛选出oxLDL、Hcy+LPS、PAG与GYY4137的最佳干预浓度。

2.2.2实验分组 药物干预之前将处于对数生长期(汇合率为80％～90％)的HUVECs接种于含血清培养液的6孔培养板(接种密度为1×10⁶细胞/孔)中贴壁4h，之后更换为无血清培养液饥饿培养12h，最后使用不同药物对其进行处理，并分为以下9组：

(1)空白对照组：以含1％血清完全培养液培养HUVECs 24h；

(2)GYY4137干预组：用终浓度为200μmol/L GYY4137处理HUVECs 24h；

(3)PAG干预组：用终浓度为5mmol/L的PAG处理HUVECs 24h；

(4)oxLDL处理组：用终浓度为100mg/L oxLDL处理细胞24h；

(5)Hcy(500μmol/L)+LPS(10μg/mL)处理组：用500μmol/L Hcy+10μg/mL LPS处理细胞24h；

(6)Hcy+LPS+PAG干预组：用500μmol/L Hcy+10μg/mL LPS+5mmol/LPAG处理细胞24h；

(7)oxLDL+GYY4137干预组：50、100、200μmol/L GYY4137预处理HUVECs 4h，再加入终浓度为100mg/L的oxLDL处理细胞24h；

(8)Hcy+LPS+GYY4137干预组：200μmol/L GYY4137预处理HUVECs 4h，再加入500μmol/L Hcy+10μg/mL LPS处理细胞24h；

(9)Hcy+LPS+PAG+GYY4137干预组：200μmol/L GYY4137预处理HUVECs 4h，再加入500μmol/L Hcy+10μg/mL LPS+5mmol/L PAG处理细胞24h。

2.3细胞活性检测 待HUVECs汇合度为80％～90％左右时，用0.05％胰蛋白酶消化收集HUVECs，并将细胞接种于96孔板，用含血清培养液于细胞培养箱中培养4h，待细胞贴壁后更换为无血清培养液饥饿培养12h。之后加入上述不同药物干预24h。干预后弃去原培养液并用PBS漂洗，之后向每孔加入含10％CCK-8试剂的培养液100μL，另设空白孔(不含细胞，只含10％CCK-8的培养液)。在细胞培养箱中孵育2h后，使用酶标仪于450nm波长处检测各孔的吸光度(absorbance,A)。实验每组设置6个复孔，重复5次。

细胞相对活力(％)＝(样品平均A值-空白孔平均A值)/(空白对照组平均A值-空白孔平均A值)×100％。

2.4 Hoechst33342/PI双染检测细胞焦亡 上述各组细胞经不同药物干预处理24h后，向含有细胞的6孔板中加入10μL Hoechst33342(5mg/L)染色液于37℃条件下避光孵育10min，之后再向细胞中加入5μL PI(2mg/L)于37℃条件下避光孵育15min，PBS溶液漂洗2次后使用倒置荧光显微镜观察拍照，随机选取3个不同视野，计算每个视野中的细胞总数及红色荧光细胞数，参照文献【唐标,唐文静,戴姿薇,等.三七总皂苷抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的SH-SY5Y细胞焦亡[J].中国病理生理杂志,2020,36(7):1178-1184.(TANG Biao,TANGWen-jing,DAI Zi-wei,et al.Panax notoginseng saponins suppress oxygen-glucosedeprivation/reoxy-genation-induced pyroptosis of SH-SY5Y cells[J].ChineseJournal ofPathophysiology,2020,36(7):1178-1184.)】，计算PI⁺细胞比例(％)＝红色荧光细胞数/细胞总数×100％。以上实验重复3次。

2.5乳酸脱氢酶(LDH)释放率检测 各组细胞接种于96孔板中，经不同药物干预处理24h后，首先将各组细胞培养液上清(25μL)收集于96孔板中，之后向无血清培养液对照及含有25μL培养液上清的96孔板中加入25μL反应底物，并于37℃条件下孵育15min，之后再向上述反应样品中加入25μL 2,4-二硝基苯肼，并于37℃条件下孵育15min进行显色反应，最后向反应样品中加入250μL反应终止液于室温下孵育5min终止反应，最后于490nm波长处测定A值，根据公式：LDH释放率(％)＝(处理样品吸光度-对照样品吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-对照样品吸光度)×100％，计算出各组细胞培养液上清中的LDH含量。以上实验重复4次。

2.6 H₂S含量测定 各组细胞经不同指定浓度药物干预处理24h后，胰酶消化收集各组细胞并向其中加入500μL预冷的磷酸缓冲液(50mM，pH＝6.8)裂解匀浆，取部分细胞裂解液测定各组细胞裂解液中的总蛋白浓度；向含有430μL细胞裂解液的离心管中加入含有2mmol/L磷酸吡哆醛、10mmol/L L-半胱氨酸的磷酸缓冲液(pH＝7.4)，封口膜密封离心管后将其置于37℃水浴锅中孵育30min；然后使用注射器通过离心管管盖向上述密封离心管中注入250μL 1％醋酸锌，混匀后继续将上述反应混合物置于37℃水浴锅中孵育90min；随后向离心管中依次加入250μL三氯乙酸(10％,w/v)、133μLN,N-二甲基对苯二胺(20mmol/L)和133μL三氯化铁(30mmol/L)，充分混匀后于4℃、12000×g条件下离心10min；随后吸取200μL各组上清及标准品反应液(NaHS,0-250μmol/L)加入96孔酶标板中，使用酶标仪于670nm波长测定各待测样品及标准品的A值。最后根据蛋白浓度计算各组细胞中的H₂S含量(单位：nmol/10⁶cell)。以上实验重复3次。

2.7 Caspase-1酶活性测定

各组HUVECs经不同药物干预24h后，经0.25％胰酶消化、4℃低速离心收集细胞，并向细胞中加入100μL裂解液冰浴裂解15min。随后将细胞裂解液在4℃、16,000×g条件下离心15min，并吸取少量上清使用BCA试剂盒测定细胞中的蛋白浓度。之后向新的离心管中依次分别加入Caspase-1活性检测试剂盒中的检测缓冲液、待测样品(含50μg蛋白)及Caspase-1反应底物Ac-YVAD-pNA(2mM)，充分混匀后于37℃条件下孵育60～120min。最后使用酶标仪于405nm波长处检测各样品的吸光值，并根据标准品对硝基苯胺(p-nitroaniline,pNA)绘制的标准曲线计算各组细胞中的Caspase-1酶活性。

2.8免疫印迹实验 将处于对数生长期的HUVECs接种于6孔板(1×10⁶细胞/孔)后使用不同药物对其进行处理24h。收集各组细胞，按照试剂盒操作说明提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，置于-80℃保存备用。取50μg蛋白等量上样，在8％或12％SDS-PAGE凝胶上电泳恒压分离。之后采用湿转法将总蛋白转移至PVDF膜上，并将PVDF膜置于5％脱脂奶粉溶液中于室温下封闭1～2h；在室温下用1×TBST缓冲液漂洗封闭后的PVDF膜，并将其放入含有抗NLRP3(1:1000)、抗Pro-Caspase-1(1:1000)、抗Caspase-1(1:1000)、抗GSDMD(1:1000)、抗GSDMD-N(1:1000)、抗IL-18(1:1000)和抗GAPDH(1:1000)抗体溶液中，于4℃条件下孵育过夜；用TBST缓冲液将膜上的多余一抗漂洗干净后，将其放入二抗溶液(1:10000)中室温孵育1～2h。洗膜，显色，曝光压片，观察结果并进行分析。以上实验重复3次。

3统计学处理

采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析和柱状图绘制。本研究所有实验数据统计结果以平均值±标准差表示。2组间数据比较采用t检验，3组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05和P<0.01为差异有统计学意义。

结果

1.GYY4137抑制oxLDL或Hcy+LPS诱导HUVECs活性的降低

为筛选并优化所使用药物的最佳浓度，首先采用CCK-8法评估oxLDL、Hcy+LPS、PAG或/和H₂S缓释型供体GYY4137对HUVECs活性的影响。实验结果如图1、图2、图3所示。与空白对照组相比，低浓度oxLDL(25mg/L)、Hcy(50μmol/L)、PAG(1mmol/L)及中、高浓度的GYY4137(50和100μmol/L)对HUVECs活性无显著影响(P>0.05)，中高浓度的oxLDL(50mg/L和100mg/L)、Hcy(100、250、500μmol/L)+LPS(1、10μg/mL)及PAG(5、10mmol/L)可使HUVECs活性显著降低(P<0.05和P<0.01)，见图1中的A、图2和图3；而200μmol/L GYY4137则可使HUVECs活性显著增加(P<0.05)，见图1中的B。此外，与oxLDL处理组及Hcy+LPS处理组相比，GYY4137还可使oxLDL或Hcy+LPS处理的HUVECs的活性显著升高(P<0.05)，见图1中的C和图3中的A。

2.oxLDL或Hcy+LPS诱导的HUVECs细胞焦亡模型的建立

为进一步证实oxLDL或Hcy+LPS对血管内皮细胞焦亡的促进作用，通过LDH活性测定、Hoechst33342/PI染色及免疫印迹分析了oxLDL或Hcy+LPS对HUVECs细胞焦亡及焦亡关键蛋白表达的影响。结果显示，与空白对照组相比，低浓度oxLDL(25mg/L)对HUVECs中LDH释放率、PI⁺染色的细胞比例及焦亡关键蛋白的表达无显著影响(P>0.05)，而50mg/L和100mg/LoxLDL、Hcy(100、250、500μmol/L)+LPS(10μg/mL)则可使HUVECs的PI⁺染色比例及LDH释放率显著升高(P<0.05和P<0.01)，见图4和图5；此外，与空白对照组相比，50mg/L和100mg/LoxLDL或Hcy(100、250、500μmol/L)+LPS(10μg/mL)可显著上调HUVECs中细胞焦亡关键标志蛋白NLRP3、Caspase-1(具有活性的P20亚单位)、GSDMD、GSDMD-N末端片段及细胞因子IL-18的表达(P<0.05或P<0.01)，但oxLDL对Pro-Caspase-1的表达及Hcy+LPS对GSDMD的表达较空白对照组则无显著影响(P>0.05)，见图6和图7。

3.GYY4137抑制oxLDL或Hcy+LPS诱导的HUVECs焦亡、Caspase-1酶活性升高及细胞焦亡关键标志蛋白的表达

为阐明GYY4137对oxLDL或Hcy+LPS诱导的HUVECs焦亡的抑制作用及其可能调控机制，选取100mg/LoxLDL、Hcy(500μmol/L)+LPS(10μg/mL)、PAG(5mmol/L)、Hcy(500μmol/L)+LPS(10μg/mL)+PAG(5mmol/L)和200μmol/L GYY4137单独或联合干预HUVECs，并检测了各组细胞中的H₂S水平、PI⁺染色的细胞比例、LDH释放率、Caspase-1活性以及细胞焦亡关键标志蛋白的表达。

结果显示，与空白对照组相比，oxLDL、Hcy+LPS、PAG、Hcy+LPS+PAG处理后可显著抑制HUVECs中H₂S的合成(P<0.05)，且oxLDL、Hcy+LPS、Hcy+LPS+PAG处理可显著上调细胞LDH释放率、PI⁺染色的细胞比例(P<0.05和P<0.01)、Caspase-1酶活性(P<0.01和P<0.001)以及焦亡信号通路关键蛋白(NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1(P20)、GSDMD、GSDMD-N及IL-18)的表达(P<0.05和P<0.01)；而与oxLDL组、Hcy+LPS组及Hcy+LPS+PAG组相比，GYY4137和oxLDL/Hcy+LPS/Hcy+LPS+PAG联合干预则可显著提高HUVECs中的H₂S含量(P<0.05)，并使PI⁺染色细胞比例、LDH释放率和Caspase-1酶活性显著下降(P＜0.05和P<0.01)，且GYY4137还可显著抑制oxLDL或Hcy+LPS诱导的细胞焦亡关键蛋白(NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1(P20)、GSDMD、GSDMD-N及IL-18)的表达上调(P<0.05和P<0.01)，见图8、9、10、11、12、13。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。