一种糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用
阅读说明：本技术 一种糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用 (Application of glucoside compound in preparation of medicine for preventing or/and treating liver injury ) 是由 王煜丹 赵京浩 程桂广 袁明龙 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种糖苷类化合物的新用途,即其在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用,属于医药技术领域；本发明从天然植物红香树的叶子中采用超声辅助提取方法,经硅胶柱层析法分离纯化获得本发明糖苷类化合物；细胞凋亡实验及小鼠动物实验结果显示该化合物能降低APAP造成的肝损伤的程度,改善肝组织病变和肝细胞损伤,对APAP诱导的炎症损伤有明显的预防和治疗作用,减少氧化应激和过度炎症造成的机体和细胞损伤,细胞毒性评价结果显示,在100μg/mL以下对细胞存活率无明显影响,该化合物在低浓度时不会对生物机体及细胞健康造成危害,本发明为传统天然植物红香树提供了新的药用途径。(The invention discloses a new application of a glucoside compound, namely the application of the glucoside compound in preparing a medicament for preventing or/and treating liver injury, belonging to the technical field of medicines; the glucoside compound is obtained by separating and purifying leaves of a natural plant, namely the red cedar by a silica gel column chromatography by adopting an ultrasonic-assisted extraction method; the apoptosis experiment and mouse animal experiment results show that the compound can reduce the degree of liver injury caused by APAP, improve liver tissue lesion and liver cell injury, has obvious prevention and treatment effects on APAP-induced inflammatory injury, reduces organism and cell injury caused by oxidative stress and excessive inflammation, and has no obvious influence on the survival rate of cells under 100 mu g/mL as shown by cytotoxicity evaluation results, and the compound does not cause harm to organism and cell health at low concentration.)
技术领域
本发明涉及一种糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用，属于医药
技术领域
。背景技术
对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)被认为是临床上治疗剂量下最常见的解热镇痛药，但许多治疗感冒的复方制剂中都含有APAP，这导致公众在购买感冒药治疗疾病时不知不觉地过度使用APAP，药物过量很容易引发肝损伤，如果肝损伤得不到及时合理的控制，就会导致肝纤维化、肝硬化，甚至肝功能衰竭等严重疾病。据调查，目前APAP仍是临床药物性肝损伤的主要来源。通常APAP给药后，大部分APAP将被代谢成无毒的葡萄糖醛酸加合物，并被肝脏Ⅱ相代谢酶硫酸化，然后通过尿液和粪便排泄。一小部分APAP(约5-15%)还被细胞色素P450酶代谢成活性代谢物N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI)，NAPQI可与肝细胞内的谷胱甘肽(GSH)结合而转化为无毒产物。虽然在正常情况下，肝细胞内还原型GSH可以中和NAPQI，但过量的APAP会产生过多的NAPQI，导致细胞内和线粒体GSH储备的耗竭，导致活性氧(ROS)的过量产生，从而导致氧化应激和线粒体功能障碍，导致肝细胞坏死和凋亡。
现在临床上常用的预防或治疗APAP肝损伤的可行方法是给药N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)或维生素C。但是，其治疗效果不尽人意，NAC可通过直接与GSH结合或增加GSH的合成来提高NAPQI的中和能力，从而降低APAP的肝毒性。但是，NAC治疗过程中所引发的副作用明显，对胃肠道、中枢神经系统和呼吸道都有刺激，易出现恶心、呕吐，头晕，支气管痉挛、咯血等不良反应。
天然植物中常见的抗氧化剂有黄酮、木脂素等。特别是含有多酚羟基的黄酮类化合物，在体内可通过抗脂质过氧化、清除活性自由基和作用于酶而发挥抗氧化活性，实验和临床实践证明，黄酮类化合物具有较强的保肝作用。临床上用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化和多种中毒性肝损伤。
目前尚未见本发明糖苷类化合物在药源性肝损伤保护中的应用报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种来源于红香树（Annesleafragrans Wall.）的糖苷类化合物的新用途，即结构式如下式所示的糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的用途：
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本发明预防或/和治疗肝损伤药物是以糖苷类化合物为活性成分，用于制备治疗肝损伤药物，还可以加入一种或多种药物制剂上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等；或者与其他活性成分复配发挥协同预治肝损伤的作用；可以制成药剂学上适宜的使用剂型，例如胶囊、丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
本发明所述糖苷类化合物Confusoside是以红香树树叶为原料，通过自然干燥粉碎，采用超声辅助提取的方法制得乙醇提取物，定量分析其含量达111.84±9.53mg/g乙醇提取物，将乙醇提取物经硅胶柱分离纯化得到的糖苷类化合物Confusoside。
本发明致力于该糖苷类化合物Confusoside对APAP造成的药源性肝损伤的预防和缓解作用的实验研究，经过对小鼠灌胃给药糖苷类化合物Confusoside后，腹腔注射APAP测试，可见肝损伤症状得到明显改善。
细胞毒性实验结果表明，人肝癌细胞（HepG2细胞）单次给药12.5、25、50、100和200μg/mL Confusoside，100μg/mL内未见细胞存活率降低；对小鼠20mg/kg、60mg/kgConfusoside给药，未见小鼠有包括抽搐、震颤、腹泻、嗜睡、呼吸困难和昏迷等行为；Confusoside在低浓度时不会对生物机体及细胞健康造成危害。
本发明对糖苷类化合物Confusoside预防和缓解APAP造成的肝损伤进行了研究，证实了Confusoside可以降低APAP造成的肝损伤的程度，改善肝组织病变和肝细胞损伤，降低脏器指数及评价肝损伤的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）指标，可以促进抗氧化、抑制炎症反应抑制细胞凋亡，减少氧化应激和过度炎症造成的机体和细胞损伤，因此可作为一种新的预防和治疗药源性肝损伤的药品开发。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明为传统天然植物红香树提供了新的药用途径；
2、本发明糖苷类化合物Confusoside在较低浓度时不会对生物体和细胞造成明显损伤，可显著降低肝损伤，安全性高；
3、本发明糖苷类化合物制备工艺简单，化合物在天然植物中含量丰富，适于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
图1为不同浓度Confusoside化合物给药HepG2细胞毒性实验的细胞存活率结果；
图2为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的Control组（正常对照组）结果；
图3为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的APAP组（APAP给药）结果；
图4为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的NAC+APAP组（对乙酰半胱氨酸（NAC，100μg/mL）与APAP（50μg/mL）联合给药）结果；
图5为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的Cf-L+APAP组（低浓度Confusoside（50μg/mL）与APAP联合给药（50μg/mL））结果；
图6为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的Cf-H+APAP组（高浓度Confusoside（100μg/mL）与APAP（50μg/mL）联合给药）结果；
图7为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，不同组HepG2细胞的凋亡率统计结果；图中NC为对照组，NAC为NAC+APAP组，Cf-L为Cf-L+APAP组，Cf-H为Cf-H+APAP组；
图2-7中数据以平均数±平均标准差(SEM)表示(每组5个)，# p<0.01 表示与Control组相比；* p<0.05 ，** p<0.01 表示与APAP组相比；
图8为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠肝脏形态学观察、H&E染色组织病理学观察结果示意图；
图9为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠实验中肝脏脏器指数结果；
图10为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠实验中生化指标ALT结果；
图11为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠实验中生化指标AST结果；
图12为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠实验中生化指标LDH结果；
图8-12中数据以SEM表示(每组6个)。# p<0.0 1 表示与 C组相比；* p<0.05 ，** p<0.01 表示与M组相比；C：正常对照组，M：APAP（400mg/kg）给药，Y：NAC（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf-L：低浓度Confusoside（20mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf：高浓度Confusoside（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药；
图13为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤实验中GSH含量结果；
图14为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤实验中超氧化物歧化酶（SOD）含量结果；
图15为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤实验中过氧化氢酶（CAT）含量结果；
图16为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤实验中丙二醛（MDA）含量结果；
图13-16中数据以SEM表示(每组6个)。# p<0.0 1 表示与 C组相比；* p<0.05 ，** p<0.01 表示与M组相比；C：正常对照组，M：APAP（400mg/kg）给药，Y：NAC（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf-L：低浓度Confusoside（20mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf：高浓度Confusoside（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药；
图17为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子TNF-α含量结果；
图18为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子IL-1β含量结果；
图19为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子IL-6含量结果；
图20为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤实验中NO含量结果；
图17-20中数据以SEM表示(每组6个)，# p<0.0 1 表示与 C组相比；* p<0.05 ，** p<0.01 表示与M组相比；C：正常对照组，M：APAP（400mg/kg）给药，Y：NAC（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf-L：低浓度Confusoside（20mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf：高浓度Confusoside（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药。
具体实施方式
下面结合实验数据和附图来进一步的阐述本发明。这些实验的事例仅用于说明本发明，不用于限制本发明的应用范围。在阅读了本发明的记载以后，本领域的科技人员对其等效的各种改动、修改和修饰，都属于本发明权利要求所限定的范围，实施例中使用的试剂，如无特殊说明，均为常规市售产品或按常规方法配制的试剂，实施例中方法如无特殊说明，均为常规实验方法。
实施例1：糖苷类化合物Confusoside的分离纯化
1）将从中国云南省临沧市永德县采集的红香树树叶自然干燥并粉碎；
2）按料液比g:mL为1:10的比例，将红香树叶粉末样品与用80% 乙醇水溶液混合后超声提取30min，过滤得提取液，滤渣重复提取3次后合并提取液，4000rpm下离心10min后取上清液，使用旋转蒸发仪进行减压蒸发浓缩，得浸膏状红香树叶提取物；
3）提取物浸膏进行预冻后经冷冻浓缩干燥机进行低温冻干，得到红香树叶乙醇提取物，置于样品干燥器内保存；
4）称取红香树叶乙醇提取物使用硅胶柱分离纯化，CHCl3-MeOH（体积比30:1）洗脱，收集洗脱液，浓缩后80%甲醇水溶解，结晶，即得到化合物Confusoside；
5）利用核磁共振（NMR）对化合物结构进行鉴定，鉴定结果如下：
Confusoside : 黄色无定型粉末；1H (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.50 (1H, s,OH-2′), 9.16 (1H, s, OH-4), 7.05 (2H, d, J = 8.3 Hz, H-2/H-6), 6.66 (2H, d, J= 8.3 Hz, H-3/H-5), 6.55 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-3′), 6.58 (1H, dd, J = 1.8,8.9 Hz, H-5′), 7.90 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-6′). 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ:130.9 (s, C-1), 129.2 (d, C-2/C-6), 115.0 (d, C-3/C-5), 155.5 (s, C-4), 114.4(s, C-1′), 163.3 (s, C-2′), 103.4 (d, C-3′), 163.5 (s, C-4′), 108.3 (d, C-5′), 132.6 (d, C-6′), 40.0 (t, C-α), 28.9 (t, C-β), 99.6 (d, C-1″), 73.1 (d,C-2″), 76.4 (d, C-3″), 69.5 (d, C-4″), 77.1 (d, C-5″), 60.5 (t, C-6″), 204.4(s, CO). HRESIMS （m/z）419.1363 [M - H]- (calcd. for C21H23O9, 419.1348)；
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实施例2：糖苷类化合物Confusoside的细胞毒性实验
使用人肝癌细胞（HepG2）通过MTT法测细胞活率来对化合物Confusoside进行细胞毒性评价，开展糖苷类化合物Confusoside对HepG2细胞的存活率的研究，具体方法如下：
从液氮罐中取出冻存的HepG2细胞，对细胞进行复苏后培养三代，进行MTT实验；HepG2细胞以3×104个/孔的密度接种于96孔板，孵育24h，孵育结束后对实验进行分组；空白组（NC）：200μL完全培养基处理HepG2细胞24h；样品组：分别选用浓度12.5、25、50、100、200μg/mL的Confusoside溶液200μL处理HepG2细胞24h。处理结束后，用0.5mg/mL的MTT溶液（150μL/孔）与细胞孵育4h，然后用150μL二甲基亚砜（DMSO）溶解，用SpectraMax M5微板仪在570nm处记录每孔的吸光度，并通过以下公式计算得到细胞存活率：
结果如图1所示，随着糖苷类化合物Confusoside浓度的增加，细胞存活率呈现剂量依赖性降低，且在浓度为200μg/mL时细胞活率低于90％，这说明Confusoside在200μg/mL时会抑制HepG2细胞的增殖，表现出一定的毒性作用，而Confusoside在100μg/mL以下浓度时不存在明显细胞毒性。
实施例3：糖苷类化合物Confusoside对乙酰氨基酚诱导的细胞凋亡的保护作用
用Annexin V-FITC (AV)/PI凋亡试剂盒检测化合物Confusoside对APAP诱导HepG2细胞凋亡的影响。
HepG2细胞在12孔板（细胞数量1.5×105个/孔）中预孵育12h，待细胞接近长满孔板时，对细胞进行给药，Control组：1mL DMEM完全培养液处理细胞；APAP组：1mL DMEM完全培养液处理细胞；NAC+APAP组：1mL 100μg/mL NAC处理细胞；Cf-L+APAP组：1mL 50μg/mLConfusoside处理细胞；Cf-H+APAP组：1mL 100μg/mL Confusoside处理细胞；24h后，弃去之前培养液，对细胞再进行给药处理，Control组：1mL DMEM完全培养液处理细胞，其余组别用1mL 50mM APAP处理细胞24h；处理结束后，将细胞收集于1.5mL离心管中，用冷的PBS洗涤3次细胞，加入100μL的结合缓冲液、5μL的Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）在室温下避光孵育10min，结束后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
结果如图2-7所示，通过流式细胞仪对细胞凋亡情况的检测，与Control组相比，APAP处理后显著诱导了细胞的凋亡（p<0.01），但是与APAP组相比较，3个给药组均显著抑制了APAP诱导的细胞凋亡（p<0.01），并且Confusoside样品组以剂量依赖的方式显著抑制。
实施例4：糖苷类化合物化合物Confusoside对APAP诱导的小鼠肝损伤的预防和治疗作用
1、实验方法
选取雄性昆明种小鼠30只，体重20~25g，所有小鼠在正式实验前适应性饲养7d，饲养环境为室温24±1℃，相对湿度50±10%，每12h进行一次明暗交替。用实验室标准饲料和双蒸水喂养小鼠。饲养适应实验环境7d后，将小鼠随机分为5组，每组6只：C组(对照组)、M组(APAP模型组)、Y组(NAC组)、Cf-L组(Confusoside低剂量组)、Cf-H组(Confusoside高剂量组)。对小鼠正常饲养，并分别对不同组别小鼠连续7d每天一次灌胃给药，每次灌药剂量0.2mL；
C组：蒸馏水；
M组：APAP（400mg/kg）给药；
Y组：60mg/kg（药物/鼠体重）NAC（N-乙酰-L-半胱氨酸）与APAP（400 mg/kg）联合给药；
Cf-L组：20mg/kg（药物/鼠体重）Confusoside与APAP（400mg/kg）联合给药；
Cf-H组：60mg/kg（药物/鼠体重）Confusoside与APAP（400mg/kg）联合给药；
连续给药7d后，小鼠禁食一夜，第8天早上，将APAP溶解于PBS中，采取腹腔注射的方法，对C组小鼠注射一定体积的PBS，对M组、Y组、Cf-L组、Cf-H组小鼠，注射溶有APAP的PBS（400mg/kg ，APAP/鼠体重）。
6h之后，对小鼠进行眼球取血，并实施安乐死；对小鼠进行解剖，观察、收集肝组织，用于分析。
观察肝脏的形态学变化、拍照，称每只小鼠的肝组织重量，计算肝脏脏器指数，随机将每组2份肝组织制作H&E染色切片。取小鼠血液，使用离心机1800×g、4℃离心10min，采集血浆；用相应试剂盒检测ALT、AST、LDH、NO、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)等生化指标。
取剩余小鼠肝组织与0.9%氯化钠溶液混合，超声细胞破碎机匀浆；组织匀浆在10000rpm和4℃下离心10min，收集上清液并储存在-80℃以备进一步使用；制备肝组织匀浆进行MDA、CAT、SOD、GSH等生化指标的测定。
观察H&E染色切片，对小鼠肝脏进行组织病理学评价。
2、结果
（1）不同浓度化合物Confusoside对APAP给药小鼠肝损伤的预防和治疗情况
由图8可知，C组正常小鼠肝脏呈红色，包膜光滑、有光泽、有弹性。反之，观察小鼠肝脏的形态学变化。M组肝脏颜色加深，出现灰黄色点状坏死，肝表面暗淡，质地硬化，个别肝脏可见明显的斑片状充血。与M组相比，Y组、Cf-L组和Cf-H组小鼠肝损伤明显改善，肝组织形态接近C组。
病理组织学评价与形态学观察结果一致。C组肝小叶结构清晰，肝细胞无坏死变性，无炎性细胞浸润，细胞核大而清晰，中心静脉周围肝索呈放射性排列，肝窦正常；M组小鼠肝小叶中心静脉周围均有不同程度的肝细胞变性坏死，坏死表现为凝固性、核固缩或溶解，并伴有中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞浸润。细胞索形态正常，中间带可见细胞空泡变性；与M组相比，Y组、Cf-L组和Cf-H组肝小叶结构更加完整，肝索排列趋于整齐，肝细胞形态明显改善，中心静脉附近的炎性浸润和变性坏死细胞明显减少；表明对过量APAP诱导的肝损伤有明显的改善作用。
由图9-12可知，直观评价肝损伤情况的肝脏脏器指数以及生化指标AST、ALT、LDH，与C组相比，M组水平均有显著增加（p<0.01）；与M组相比，Y组和Cf-L、Cf-H组指标水平均有明显下降；Cf-H组与Y组水平接近，与Cf-L组相比效果更加明显。
以上结果表明化合物Confusoside对APAP诱导的肝损伤有明显的预防和治疗作用。
（2）不同浓度化合物Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤情况
从图13-16可知，与C组相比，M组大鼠肝组织中SOD、CAT活性显著降低(p<0.01)，GSH含量也显著降低(p<0.01)；与M组相比，Y组、Cf-L组、Cf-H组SOD、CAT、GSH活性均升高，其中Cf-H组升高最为明显，接近Y组(p<0.01)，说明Cf能有效治疗APAP所致的肝组织氧化损伤，且剂量与作用呈正相关；此外，M组MDA水平显著升高(p<0.01)。与C组比较，提示肝组织存在脂质过氧化；Cf-L组与M组比较，Cf-L组降低MDA水平(p<0.05)，Cf-H组作用更明显，接近Y组(p<0.01)；CAT、SOD、GSH和MDA的活性是评价生物体内氧化应激情况的重要指标，由以上结果表明Confusoside对APAP诱导的氧化应激损伤有明显的预防和治疗作用。
（3）不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤情况
由图17-20可知，与C组比较，M组大鼠肝组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量明显升高(p<0.01)。与M组比较，Y组、Cf-L组、Cf-H组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量均低于M组，Cf-L组TNF-α含量下降，但变化不明显，Cf-H组显著降低(p<0.01)，与M组比较，Y组、Cf-L组、Cf-H组均有显著降低p<0.01)，Cf-L组与M组比较差异无显著性(p>0.05)。同样，Y组和Cf-H组IL-1β含量明显低于M组(p<0.01)，Cf-L组IL-6含量明显低于M组(p<0.0 5)，而Cf-H组与Y组接近(p<0.01)。Cf组NO含量明显低于M组(p<0.01)，Cf-L组和Cf-H组NO含量均显著低于M组(p<0.01)，Cf-L组和Cf-H组NO含量均显著低于M组(p<0.01)，Cf-L组和Cf-H组NO含量明显低于M组(p<0.01)。TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的活性是评价生物内炎症水平的关键性指标，因此，以上结果表明Confusoside对APAP诱导的炎症损伤有明显的预防和治疗作用。
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