阿帕替尼作为平滑肌表型转化抑制剂的用途
阅读说明：本技术 阿帕替尼作为平滑肌表型转化抑制剂的用途 (Use of apatinib as smooth muscle phenotype transformation inhibitor ) 是由 黄恺 陈敏 邵文超 梁明露 胡立志 李晓光 于 2020-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,涉及阿帕替尼作为平滑肌表型转化抑制剂的用途。本发明提出Apatinib对PDGFRβ有抑制作用,因此Apatinib可以抑制平滑肌表型转换,从而预防和/或治疗血管损伤后再狭窄。此外,Apatinib并无通常心血管药物或其他平滑肌表型转换抑制剂的细胞毒作用,因此可以预期其安全性。其可以作为治疗平滑肌参与的相关疾病如血管再狭窄、肿瘤等疾病的药物而广泛应用。(The invention belongs to the field of medicines, and relates to application of apatinib as a smooth muscle phenotype transformation inhibitor. Apatinib is proposed to have an inhibitory effect on PDGFR beta, so Apatinib can inhibit smooth muscle phenotype switching, thereby preventing and/or treating restenosis after vascular injury. Furthermore, Apatinib has no cytotoxic effect of common cardiovascular drugs or other inhibitors of smooth muscle phenotype switching, and therefore its safety can be expected. It can be widely used as a medicine for treating related diseases involving smooth muscle, such as vascular restenosis, tumor and the like.)
技术领域
本发明属于医药领域，尤其涉及阿帕替尼作为平滑肌表型转化抑制剂的用途。
背景技术
阿帕替尼，英文名称为Apatinib，别名为甲磺酸阿帕替尼；阿帕替尼甲磺酸盐；CS-1160；N-[4-(1-氰基环戊基)苯基]-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺；YN968D1；[阿帕替尼游离]；APATINIBFREEBASE(YN968D1FREEBASE)。其分子量为397.47232，分子式为C24H23N5O，CAS号为811803-05-1。结构式为
Apatinib在目前已有的研究中主要作为血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的抑制剂，即抑制VEGFR-2。Apatinib通过高度选择性竞争细胞内VEGFR-2的ATP结合位点，阻断下游信号转导，抑制酪氨酸激酶的生成从而抑制肿瘤组织新血管的生成，最终达到治疗肿瘤的目的。因此上述药物均被广泛应用于胃癌等肿瘤相关的研究中。
血管平滑肌细胞(VSMC)的表型可分为分化程度较高的收缩型和分化程度较低的分泌型，这两种表型代表了共存于血管壁内一系列不同表现型的两个极端类型，且表达不同的基因和蛋白。正常成人动脉血管的VSMC以收缩型为主，其主要功能是维持血管的弹性和收缩血管。收缩型VSMC增殖、迁移能力差或无，胞体呈梭形或带状，含大量肌丝和结构蛋白；而分泌型VSMC主要存在于胚胎中期血管和病理血管中，其主要功能是增殖、迁移入内膜以及合成细胞外基质蛋白。
VSMC从收缩型向分泌型转换的过程称为VSMC的表型转换。研究表明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PI-3-K、环一磷酸腺苷(cAMP)这三种信号传导途径参与VSMC的表型转换，通过的受体包括VEGFR、血小板源性生长因子受体(PDGFR)等。VSMC的异常增殖和迁移是高血压、肺动脉高压等血管疾病发生发展的共同病理特征，同时也是引起血管损伤后再狭窄的重要原因，而VSMC表型转化在VSMC增殖和迁移过程中发挥了重要作用。
根据VSMC两种表型表达蛋白的不同可以找到表型转换时相应的标志物。其中α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)在收缩型细胞中优势表达，是VSMC分化的早期特征性标志物。
目前应用于科研中的抑制血管损伤后再狭窄的药物有数种，其中最为常见的有：血管紧张素转换酶(简写为ACE)抑制剂螺普利和西拉普利，药物涂层支架(DES)使用的涂层药物[如抗栓剂(如肝素、水蛭素)、抗炎症药物、抗细胞增殖剂(如雷帕霉素、紫杉醇]等。已有的研究表明Apatinib可以通过促进细胞凋亡，在肿瘤疾病中发挥治疗作用，同时可能引起高血压。
发明内容
为改善上述技术问题，本发明提供一种PDGFRβ的磷酸化和PDGFRβ下游信号通路的抑制剂，其包括阿帕替尼。
根据本发明的实施方案，所述抑制剂用于抑制平滑肌表型转换。
根据本发明的实施方案，所述平滑肌表型转换包括由收缩型向分泌型转换。
根据本发明的实施方案，所述抑制剂用于预防和/或治疗血管损伤后再狭窄。
根据本发明的实施方案，所述血管损伤后再狭窄包括PCI再狭窄、支架内再狭窄、旁路移植后再狭窄等。
根据本发明的实施方案，所述抑制剂中阿帕替尼的浓度为50nM至200nM。
本发明还提供阿帕替尼在制备PDGFRβ的磷酸化和PDGFRβ下游信号通路的抑制剂中的用途。
本发明还提供一种抑制PDGFRβ的磷酸化和PDGFRβ下游信号通路的方法，包括将阿帕替尼施用于有此需要的个体。
根据本发明的实施方案，通过抑制PDGFRβ的磷酸化和PDGFRβ下游信号通路达到平滑肌表型转换抑制剂的作用，从而预防和/或治疗血管损伤后再狭窄。
本发明具有的有益效果：
发明人意外地发现Apatinib不仅可以作为VEGFR-2抑制剂，而且同时对PDGFRβ有抑制作用，因此Apatinib可以抑制平滑肌表型转换，从而预防和/或治疗血管损伤后再狭窄。
此外，Apatinib并无通常心血管药物或其他平滑肌表型转换抑制剂的细胞毒作用，因此可以预期其安全性。其可以作为治疗平滑肌参与的相关疾病如血管再狭窄、肿瘤等疾病的药物而广泛应用。
附图说明
图1中a为假手术+载体处理组，b为结扎+载体处理组，c为结扎+阿帕替尼处理组处理后，利用油红-苏木精(HE)染色实验检测小鼠颈动脉结扎后的血管形态。
图2为不同浓度的Apatinib和载体(DMSO)利用EdU实验检测VSMC细胞增殖情况。其中第一列为DAPI染色细胞核，第二列为EdU染色细胞核，第三列为前两列的融合图；而第一行为载体处理组，第二行为PDGF-BB和载体处理组，第三行为PDGF-BB和50nM的Apatinib处理组，第四行为PDGF-BB和100nM的Apatinib处理组，第五行为PDGF-BB和200nM的Apatinib处理组。
图3为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予Apatinib(50,100,200nM)和载体(DMSO)刺激。图中为不同浓度的Apatinib及载体后利用蛋白印迹实验检测细胞周期蛋白和抑癌蛋白的表达，VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，细胞周期蛋白表达上升，抑癌蛋白表达下降；给予Apatinib刺激后，细胞周期蛋白表达下降，抑癌蛋白表达上升。
图4为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予Apatinib(50,100,200nM)和载体(DMSO)刺激。图中为不同浓度的Apatinib及载体利用蛋白印迹实验检测细胞凋亡有关蛋白的表达，未见明显变化。
图5为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予Apatinib(50,100,200nM)和载体(DMSO)刺激。图中为不同浓度的Apatinib利用transwell实验检测细胞迁移情况。
图6为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予Apatinib(50,100,200nM)和载体(DMSO)刺激。图中为不同浓度的Apatinib利用划痕实验检测细胞增殖迁移情况。
图7中小鼠颈动脉结扎后，分别给予小鼠载体和10mg/kg·d Apatinib处理，图中为不同浓度的Apatinib利用免疫荧光实验检测收缩基因αSMA表达情况。
图8为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予Apatinib(50,100，200nM)和载体(DMSO)刺激。图中为不同浓度的Apatinib利用蛋白印迹实验检测PDGFRβ磷酸化水平情况。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
以下实施例应用细胞实验研究该药物对VSMC表型转换的抑制作用。
实施例1
本实施例测试使用的Apatinib购自MCE公司，型号HY-13342。分别采用下述步骤中的方法检测如下实验中VSMC的表型转换情况。
应用EdU细胞增殖实验检测VSMC细胞增殖情况，应用细胞划痕和transwell实验检测VSMC细胞迁移情况。检测方法参见Huang D,Wang Y,Wang L,Zhang F,Deng S,Wang R,Zhang Y,Huang K.Poly(ADP-ribose)polymerase 1is indispensable for transforminggrowth factor-βInduced Smad3 activation in vascular smooth muscle cell.PLoSOne.2011；6(10):e27123.具体过程如下：
EdU细胞增殖实验：将大鼠来源的原代细胞(VSMC)接种于96孔板中，分别使用不同浓度(50nM,100nM,200nM)的Apatinib和载体DMSO处理细胞4h。48h后，以上四组处理用PDGF-BB(30ng/ml)刺激48h(对照组为等体积的DSMO)，EdU的掺入分析按照制造商的说明进行，结果用Olympus cellSens Entry拍摄。
细胞划痕实验：将VSMC接种于6孔板中，培养至80％密度。细胞单层用1ml的移液管尖端划伤。细胞与不同浓度的Apatinib预孵育4h后，用PDGF-BB(30ng/ml)刺激48h(对照组为等体积的DSMO)，然后在含有体积浓度比为10％的胎牛血清的DMEM中培养。使用OlympuscellSens entry观察细胞，使用Image J程序测量伤口闭合率。
Transwell法测定细胞迁移：VSMC经过Apatinib预处理4h，播种到上气室，500μLDMEM和体积浓度比为10％的胎牛血清和PDGF-BB(30ng/ml)放置到下气室中。24h后，下气室用质量浓度为4％的甲醛固定细胞20分钟，质量浓度为0.1％的结晶紫染色20分钟。使用Olympus cellSens通道对迁移的细胞进行拍照。
实施例2
对C57BL/6小鼠行颈动脉结扎损伤或假手术损伤后，分别腹腔注射Apatinib(10mg/kg·d)和载体(DMSO)。14天后，老鼠被安乐死，对受伤的血管进行血管切除手术。用质量浓度为4％的甲醛固定石蜡包埋后，将血管切段。图1分别为假手术+载体处理组、结扎+载体处理组、结扎+阿帕替尼处理组处理后，利用油红-苏木精(HE)染色实验检测小鼠颈动脉结扎后的血管形态。结果如图1所示。其中图1从左至右(1a，1b，1c)分别为假手术+载体处理组、结扎+载体处理组、结扎+阿帕替尼处理组小鼠颈动脉平均厚度统计图。由图1可知，与假手术+载体处理组相比，小鼠行颈动脉结扎后，颈动脉厚度增长，即血管损伤导致血管内皮细胞过度增殖；而阿帕替尼可抑制血管损伤导致的血管内皮细胞过度增殖。
实施例3
VSMC细胞给予PDGF-BB(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的Apatinib(50nM,100nM,200nM)和载体DMSO刺激。图2为不同浓度的Apatinib利用EdU实验检测VSMC细胞增殖情况。图2中第一列为DAPI染色细胞核，第二列为EdU染色细胞核，第三列为前两列的融合图；而第一行为载体处理组，第二行为PDGF-BB和载体处理组，第三行为PDGF-BB和50nM的Apatinib处理组，第四行为PDGF-BB和100nM的Apatinib处理组，第五行为PDGF-BB和200nM的Apatinib处理组。由图2可知，PDGF-BB处理VSMC细胞后，EdU阳性的细胞增多，进一步用Apatinib处理后，EdU阳性的细胞减少，且随着Apatinib浓度增大，EdU阳性的细胞量减少。综上，PDGF-BB处理VSMC细胞后，可促进VSMC细胞的增殖，而Apatinib可抑制PDGF-BB引起的细胞增殖，且随着Apatinib的浓度增大，抑制作用增强。
实施例4
VSMC细胞给予PDGF-BB(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的Apatinib(50nM,100nM,200nM)和载体DMSO进行刺激，收集细胞，提取蛋白后，利用蛋白印迹实验检测细胞周期蛋白和抑癌蛋白的表达，结果如图3所示。VSMC细胞在不同处理下，细胞周期蛋白(PCNA、CyclinD1)和抑癌蛋白(P27、P21)的表达。由图3可知，给予PDGF-BB处理后，VSMC细胞中细胞周期蛋白表达上升，抑癌蛋白表达下降；给予Apatinib刺激后，细胞周期蛋白表达下降，抑癌蛋白表达上升；而细胞凋亡有关的蛋白表达量无明显变化。
实施例5
VSMC细胞给予PDGF-BB(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的Apatinib(50nM,100nM，200nM)和载体DMSO进行刺激，收集细胞，提取蛋白后，利用蛋白印迹实验检测细胞凋亡蛋白的表达(Caspase 3、剪切的Caspase 3、Bcl-2、Bax)，结果如图4所示。由图4可知，不同浓度的Apatinib对细胞凋亡有关蛋白的表达无明显影响。
实施例6
VSMC细胞给予PDGF-BB(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的Apatinib(50nM,100nM，200nM)和载体DMSO进行刺激，利用transwell实验检测细胞迁移情况。结果如图5所示。由图5可知，PDGF-BB促进细胞的迁移，而Apatinib抑制了细胞的迁移，且随着浓度的增加，抑制作用增强。
实施例7
VSMC细胞给予PDGF-BB处理后(30ng/ml)，分别给予不同浓度的Apatinib(50nM,100nM，200nM)和载体DMSO进行刺激，利用划痕实验检测细胞增殖迁移情况，结果如图6所示。由图6可知，PDGF-BB促进细胞划痕的闭合率，而Apatinib抑制了该促进作用，且随着Apatinib浓度的增加，对细胞划痕的闭合的抑制作用增强。
实施例8
分别对小鼠颈动脉结扎后，给予小鼠载体DMSO和10mg/kg·d Apatinib处理，利用免疫荧光实验检测收缩基因αSMA表达情况，组织切片用SMα-actin一抗(体积比为1：100)4℃孵育过夜，然后用FITC结合的荧光二抗37℃孵育2h。核酸用DAPI 37℃染色15min。切片最终用Olympus cellSens entry观察成像。观察颈动脉形态，结果如图7所示。图7中第一列为假手术加空载处理组，第二列为手术加空载处理组，第三列为手术加Apatinib处理组，而第一行为颈动脉αSMA的免疫荧光染色，第二行为DAPI对颈动脉的细胞核进行染色，第三行为前两行的融合图。由图7可知，小鼠行颈动脉结扎后，颈动脉壁加厚，而颈动脉中收缩基因αSMA的表达量下降；进一步用Apatinib处理后，颈动脉壁厚度下降，收缩基因αSMA的表达量上升。血管损伤后，血管壁增厚，收缩基因αSMA的表达量下降。
实施例9
VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予不同浓度的Apatinib(50nM,100nM,200nM)和载体DMSO进行刺激，利用蛋白印迹实验检测PDGFRβ磷酸化水平情况后，结果如图8所示。由图8可知VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，PDGFRβ磷酸化水平上升；进一步使用Apatinib处理后，PDGFRβ磷酸化水平下降，且随着Apatinib浓度的增加，PDGFRβ磷酸化水平下降。因此，PDGF-BB促进了PDGFRβ的磷酸化，而Apatinib抑制了PDGFRβ的磷酸化，且随着Apatinib浓度的增加，该抑制作用加强。
综上实验结果可知，Apatinib能够直接抑制VSMC的表型转换。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。