一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法
阅读说明：本技术 一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法 (Method for detecting CRISPR/Cas-induced gene mutation and gene editing frequency based on ddPCR ) 是由 彭城 徐俊锋 丁霖 陈笑芸 汪小福 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法。所述方法包括根据CRISPR/Cas靶序列的突变位置,设计一对变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针,以及一对内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针；其中,所述变异位点特异性探针设置在突变位点区域,并且探针的5’端位于PAM区且连接有第一荧光基团,3’端连接有第一淬灭基团；所述内源参考基因特异性探针的5’端连接有第二荧光基团,3’端连接有第二淬灭基团。所述方法对于基因突变检测灵敏度高,对基因编辑频率的检测下限(LOD)更低,更接近预期的编辑频率值。(The invention provides a method for detecting CRISPR/Cas-induced gene mutation and gene editing frequency based on ddPCR. The method comprises the steps of designing a pair of mutation site specific PCR amplification primers and a mutation site specific probe, and a pair of endogenous reference gene specific PCR amplification primers and an endogenous reference gene specific probe according to mutation positions of a CRISPR/Cas target sequence; the mutation site specific probe is arranged in a mutation site region, the 5 'end of the probe is positioned in a PAM region and is connected with a first fluorescent group, and the 3' end of the probe is connected with a first quenching group; the 5 'end of the endogenous reference gene specific probe is connected with a second fluorescent group, and the 3' end of the endogenous reference gene specific probe is connected with a second quenching group. The method has high sensitivity for detecting gene mutation, has lower limit of detection (LOD) on gene editing frequency, and is closer to expected editing frequency value.)
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法。
背景技术
CRISPR/Cas系统已被广泛应用于生物体基因组编辑和其他靶向修饰。与传统的农杆菌介导的T-DNA转基因方法相比，农杆菌介导法依赖于植物的随机重组或整合，由Cas核酸酶产生的位置特异性双链断裂(double-strand break,DSB)，主要通过容易出错的非同源末端连接(NHEJ)机械进行修复。修复的结果是可能导致各种替换、插入或缺失(indels)突变，最常见的是只有1bp变异的缺失突变。
目前已报道了几种检测CRISPR/Cas系统诱导的靶基因突变的方法，包括基于聚合酶链反应(PCR)的检测、T7核酸内切酶I识别切割、高分辨率熔融曲线分析(high-resolution melting，HRM)和基于NGS的方法。但这些方法都是半定量的，很难检测到含有低初始浓度DNA的加工食品样品中的变异，而且也难以精确量化基因编辑频率。此外，对于复杂的多倍体植物基因组中非常低频率的突变，现有的方法也难以很好地检测。
微滴式数字PCR(ddPCR)是一项突破性的技术，它依赖于将单个扩增分为不同的隔间，并检测其末端扩增产物。它提供超灵敏和绝对的核酸定量，没有标准曲线。到目前为止，几乎很少有关于ddPCR技术检测基因编辑植物及其衍生的加工食品相关报道。
鉴于，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法。解决了现有技术难以定量检测CRISPR/Cas诱导的植物基因突变以及难以准确量化植物基因编辑频率的技术问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变的方法，所述方法包括：
根据CRISPR/Cas靶序列的突变位置，设计一对变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针，以及一对内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针；
其中，所述变异位点特异性探针设置在突变位点区域，并且探针的5’端位于PAM区且连接有第一荧光基团，3’端连接有第一淬灭基团；所述内源参考基因特异性探针的5’端连接有第二荧光基团，3’端连接有第二淬灭基团。所述第一荧光基团和所述第二荧光基团不同。
变异位点特异性PCR扩增引物设计跨越突变位点。使用普通PCR筛选引物，确定可以扩增单一的，片段大小正确的产物。CRISPR/Cas9诱导的突变是可预测的，大多数突变发生在原间隔基序邻接基序(PAM)5’端上游的3个碱基处。变异位点特异性探针应位于PAM区。为了保持探针对突变的敏感性，最好将PAM区标记为探针的5’端。
内源性参考基因是已验证的参考基因，内源性参考基因的检测区域不含基因编辑的突变位点，所选择的内源性参考基因拷贝数需要与所编辑的目标基因拷贝数在该植物样本中相同。基因编辑引起的突变将会导致变异位点特异性探针无法与目标序列结合，但不会影响内源性参考基因探针的结合，变异位点特异性探针主要用来评估突变基因的数量，而内源性参考基因特异性探针主要用来分析样本中的等位基因总数量。
在一个实施方案中，所述方法还包括：采用所述的变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针以及内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针进行ddPCR反应；
依据荧光微滴的荧光信号得出结果：第一荧光和第二荧光两种荧光信号均为阳性的微滴为野生型微滴，第二荧光信号阳性但第一荧光信号阴性的微滴为突变型微滴。
野生型微滴和纯合突变型微滴可以通过ddPCR分析的二维视图明确区分。
一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因编辑频率的方法，所述方法在根据前述的方法获得荧光微滴的荧光信号结果的基础上，计算突变型微滴拷贝数与野生型微滴拷贝数的比值来计算基因编辑突变频率。
在一个实施方案中，在上述基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法中，所述第一淬灭基团选自BHQ或MGB；所述第一荧光基团和所述第二荧光基团选自FAM、HEX和TEX中的任一种；优选地，所述第一荧光基团为FAM，所述第二荧光基团为HEX。
内源参考基因探针为5’端HEX标记，突变位点特异性探针为5’端FAM标记。
在一个实施方案中，所述CRISPR/Cas靶序列为水稻TGW6基因(Os06g0623700)的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在一个实施方案中，所述变异位点特异性PCR扩增引物的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述变异位点特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
在一个实施方案中，所述内源参考基因特异性PCR扩增引物的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述内源参考基因特异性探针的序列如SEQ IDNO.6所示。
用于ddPCR技术检测CRISPR/Cas诱导的水稻TGW6基因突变和基因编辑频率的引物对和探针，所述引物对由上述变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针以及内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针的序列组成。
在一个实施方案中，所述方法还包括提取植物模板DNA，然后将所述模板DNA与所述的变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针以及内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针一起制备反应混合物，使用所述反应混合物进行ddPCR反应。
在一个实施方案中，所述ddPCR反应体系中，植物模板DNA的量为0.116-10ng/μL。
在一个实施方案中，所述ddPCR反应中，引物的浓度为400-600nM，优选地，引物的浓度为450-500nM；探针的浓度为200-400nM；优选地，探针的浓度为250-300nM。
在一个具体的实施方案中，所述ddPCR反应中，引物的浓度为450nM；探针的浓度为250nM。
在一个实施方案中，所述ddPCR反应体系中，还包含ddPCR SuperMix和无菌水。将PCR反应液放入微滴生成卡中，加入微滴生成油在微滴发生器中生成微滴。将微滴转移到96孔PCR板上进行PCR反应。
在一个实施方案中，所述ddPCR反应的程序为93℃-96℃5-15min，93℃-95℃5-15s，58℃或68℃退火和延伸50-70s，35-40个循环，95-100℃下8-12min终止反应。
在一个具体的实施方案中，所述ddPCR反应的程序为95℃10min，94℃10s，58℃或68℃退火和延伸60s，40个循环，98℃下10min终止反应，冷却至4℃。
在一个实施方案中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)提取基因编辑植物DNA，获得DNA模板；
(2)将杂合子基因编辑DNA样本稀释为不同的浓度梯度，优选地，DNA浓度分别为10、5、0.4、0.08、0.016ng/μL；
(3)根据突变位点，设计变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针；探针的5’端位于PAM区且连接有第一荧光基团(优选FAM)，3’端连接有第一淬灭基团；选择内源参考基因的特异性引物和探针，探针的5’端连接有第二淬灭基团(优选HEX)；
(4)进行微滴式数字PCR并进行数据分析，分析了突变型微滴和野生型微滴的浓度并确定阈值以区分阳性微滴和阴性微滴；
(5)通过突变型微滴(如只有HEX阳性微滴)与野生型微滴(如HEX/FAM双阳性微滴)的比值确定基因编辑的突变频率。
有益效果：
本发明提供的基于微滴式数字PCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法，对于基因编辑技术诱导的不同类型基因突变，该方法灵敏性较高。与基于qPCR和NGS的方法相比，ddPCR方法对编辑频率的检测下限(LOD)更低，更接近预期的编辑频率值。
基于微滴式数字PCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变具有更高的准确度和精密度，可以准确检测基因编辑突变体的突变频率，将成为检测和评价植物基因编辑频率的有力工具。
本发明提供的方法可以检测到含有低初始浓度DNA的加工食品样品中的基因突变，同时适用于检测复杂的多倍体植物基因组中低频率的基因突变，具有更低的错误率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的引物和探针设计原理图以及通过ddPCR检测野生型水稻样本、纯合型和杂合型基因突变的液滴二维分布图；
图2为本发明实施例提供的利用ddPCR检测经Sanger测序验证的不同突变类型纯合子水稻样品的结果图；
图3为本发明实施例提供的ddPCR法检测相同基因编辑样本不同初始DNA浓度的灵敏性测定结果图；
图4为本发明实施例提供的不同方法(ddPCR、qPCR和NGS)分析基因编辑频率的检测结果比较；
图5为ddPCR法验证多倍体生物(甘蓝型油菜)中的基因编辑频率的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1.植物材料
CRISPR/Cas9基因编辑水稻突变体，来源于发明人团队利用CRISPR/Cas9基因编辑，自主研发创制产生的突变株系编号为1-8。
利用网络工具CRISPR-P设计sgRNA，其靶位点区域核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示
(CCTCGTGCTGCTCTCGCCGTCCCCTACTGCCGCCGCCACAGCCACAACGAGAATGTTCAA，其中TCC为PAM位点)。
基因编辑油菜株系(S1-14，S1-18，S1-24，S1-53，S1-104)为CRISPR/Cas9基因编辑作物，其靶位点区域核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示(GGCCACTTGCCCATGCTGGCTAAGTACGGCCCTGAC，其中CCA为PAM位点)。由中国农科院油料所郑明博士提供。
2.DNA提取
利用天根试剂盒提取植物DNA，利用NanoDrop 1000测定DNA的浓度，琼脂糖凝胶电泳进一步鉴定DNA提取的完整性。所有DNA模板均稀释至10ng/μL，所有的DNA模板均在-20℃冰箱里保存。
3.样品制备
为了分析低初始浓度的DNA，杂合子基因编辑DNA样本用水稀释，并使用2.0(美国生命技术公司)测量，DNA浓度分别为10、5、0.4、0.08、0.016ng/μL。
4.引物和探针设计
CRISPR/Cas9诱导的大多数突变发生在原间隔基序邻接基序(PAM)5'端上游的3个碱基处。在微滴式数字PCR系统中，设计两对引物(针对内源性参考基因的引物对和针对突变位点特异性基因的引物对)和各自的检测探针(内源性参考基因的探针和突变位点特异性探针)(见图1中A图)：其中一对引物，扩增区域包含突变位点，探针位于突变位点区域并由突变位点特异探针(FAM修饰)进行检测；另一对引物和探针可以选择已被验证的内源性参考基因(HEX修饰)，该检测区域不含基因编辑的突变位点。所选择的内源性参考基因拷贝数需要与所编辑的目标基因拷贝数在该植物样本中相同。利用突变型微滴(只有FAM阳性液滴)拷贝数与野生型微滴(HEX/FAM双阳性微滴)拷贝数的比值来计算基因编辑的突变频率。
使用Primer Express软件3.0设计突变位置的引物和探针。设计还要遵循以下原则：(1)引物跨越突变位点，(2)探针应位于PAM区，(3)为了保持探针对突变的敏感性，PAM区域标记为探针的5'端。使用普通PCR筛选引物，确定可以扩增单一的，片段大小正确的产物。
参考基因探针为5′端HEX标记，突变位点特异性探针为5′端FAM标记。
下表1列出了本研究中使用的引物和探针。
表1 ddPCR中所用的引物及荧光探针
a用MGB修饰的探针，*作为内参基因
5.微滴式数字PCR
液滴式数字PCR检测包括以下成分：
20μL总反应体系中：10μL ddPCR SuperMix(无dUTP)(Bio-Rad)，每个引物对450nM(引物对包括：针对内源性参考基因的引物对和针对突变位点特异性基因的引物对)，每个探针250nM(探针包括：内源性参考基因的探针和突变位点特异性探针)，加无菌水调节最终体积至19μL，然后加入1μL DNA模板。
将20μL混合物放入BioRad DG8的微滴生成卡中，并加入70μL微滴生成油。将微滴生成卡放入QX200微滴发生器(Bio-Rad)中以生成微滴。将微滴转移到96孔PCR板上。在用铝箔密封热封后，将PCR板置于7500实时PCR系统中，并在以下循环条件下进行扩增：95℃10min，40个循环94℃10s，58或68℃退火和延伸60s，在98℃下10min终止反应，并冷却至4℃。扩增后，将96孔PCR板放入QX200微滴阅读器(Bio-Rad)中进行数据分析。
野生型和纯合突变型可以通过ddPCR分析的二维视图明确区分。
利用Bio-Rad QuantaSoftTM分析了突变型微滴和野生型微滴的浓度并确定阈值以区分阳性微滴和阴性微滴。基因编辑的突变频率通过突变微滴(只有HEX阳性微滴)与野生型微滴(HEX/FAM双阳性微滴)的比值确定。
6.实时定量PCR
根据说明，使用FastStart Universal Probe Master(Roche)和ROX参考染料，在7500实时PCR仪(Life Technologies AB)上进行定量实时PCR。
7.基于NGS的测序
设计PCR引物(表2)用于使用套式PCR方法扩增目标突变位点两侧的产物，并在PCR产物上附加独特的样本特异性条形码。高通量测序由中国北京诺和基因生物信息研究所使用Illumina HiSeq平台(美国Illumina)进行。最初使用2.0(Life Technologies，美国)测量库的浓度。利用hitom程序对高通量突变序列解码进行基因编辑突变频率进行分析(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)。
表2本发明中NGS所用的引物
结果分析：
1、基于ddPCR检测基因编辑水稻
用水稻样本(水稻TGW6野生型基因、CRISPR-Cas9基因编辑诱导的纯合子突变型和CRISPR-Cas9基因编辑诱导的杂合子突变型)对基于ddPCR的基因编辑植物突变检测方法的性能进行了评价。
使用表1中所设计的针对水稻(Oryza sativa)TGW6基因(Os06g0623700)突变位点设计的突变位点特异性基因的引物对(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)以及突变位点特异性探针(SEQ ID NO.3)以及表1中所设计的针对水稻(Oryza sativa)内源性参考基因(LOC_Os2g42314)的引物对(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)以及针对内源性参考基因的探针(SEQID NO.6)进行了ddPCR检测，结果显示，三个水稻样本能够通过ddPCR分析的二维视图清晰地区分(图1中B图所示)。
在ddPCR分析的二维视图中，含有两种荧光信号的微滴是野生型扩增子，而含有HEX阳性但FAM阴性信号的微滴是突变型扩增子。杂合子突变的扩增包含突变微滴或野生型微滴。
2、ddPCR平台能有效地识别基因编辑诱导的不同突变类型
鉴于Cas产生的突变通常是只有1bp变异，因此新开发的方法能够有效地检测这些微小的基因突变显得尤为非常重要。
为了验证ddPCR方法是否能对不同类型的突变(如单核苷酸指数)敏感，我们利用ddPCR平台检测了经测序证实的不同类型纯合子突变的CRISPR/Cas9基因编辑的TGW6水稻样品。这些突变不仅包含单核苷酸的缺失，而且包含单核苷酸突变(图2中A图)。
ddPCR结果表明，在所有这些样品中，微滴含有HEX阳性信号，而FAM阴性信号，并且当有数千个HEX阳性微滴时，FAM阳性微滴的数量几乎为零(图2中B、C图)。因此，基于ddPCR的检测方法可以有效地识别基因编辑引起的各种突变。
3、基因编辑样本的灵敏性测定
为了评价ddPCR检测基因编辑样本的灵敏性，我们使用低初始浓度的DNA样本，甚至是加工过的食品样本来评估ddPCR的性能。
制备了一系列DNA浓度的杂合子样品(10、5、0.4、0.08、0.016ng/μL)使用ddPCR进行检测。
结果表明，ddPCR法可准确检测低至0.08ng/μL的样本，而0.016ng/μL的DNA样本由于背景噪音太大而无法识别。对于加工食品样品，ddPCR方法也表现出良好的检测性能(图3中A图)，说明ddPCR具有广泛的应用前景。
为了确定ddPCR方法突变频率的检测限(LOD)，我们将突变模板(纯合突变DNA)和野生型模板以不同的比例混合(突变DNA在50％-0.1％之间)。随着突变模板含量的减少，混合样品中突变微滴的浓度逐渐降低，而野生型微滴的浓度基本保持不变(图3中B图)。
结果表明，基于ddPCR检测方法可以在0.1％的突变频率下检测到突变模板。因此，ddPCR是一种超灵敏的基因编辑检测和评价方法，可用于检测低初始浓度DNA的样品，如加工食品样品。
4、ddPCR与qPCR和NGS方法的比较
目前，基于qPCR和NGS的方法已经被证明可以用于定量检测由基因编辑诱导的植物突变频率。我们进一步使用qPCR和NGS方法检测和分析相同的混合样品。
与ddPCR方法相比，基于qPCR和NGS的方法的结果显示，当突变模板率低于5％(图4中A-C，表3)时，没有任何阳性信号，表明qPCR和基于NGS的方法的LOD约为5％(图4中B-C)。ddPCR方法检测到的结果与预期编辑频率呈线性关系(R2>0.999)，而基于qPCR和基于NGS的方法分别为R2＝0.982和0.998。此外，通过使用基于NGS的方法，我们发现一些混合样本(表3)的编辑目标区域存在意外的不匹配(T->C)，这可能是由NGS样本制备引起的。总之，与其他方法相比，ddPCR为基因编辑频率的检测和评估提供了一种更准确、更定量的方法。
表3.NGS法检测基因编辑频率
5、利用ddPCR平台检测同源四倍体油菜基因编辑突变
为了进一步证实ddPCR法是否能准确检测多倍体生物中的基因编辑频率，选择了甘蓝型油菜(Brassica napus L.，AACC，2n＝38)样品进行分析。我们根据先前已建立的基因编辑油菜，在不同染色体上有基因编辑靶点，其中一个靶点是杂合子(A基因组或C基因组)，而另一个是Sanger测序的纯合突变或野生型(图5中A图)，理论上这些样本，一个基因组纯合突变，另一个杂合子突变的编辑频率应为75％或一个基因组纯合野生型，另一个杂合子突变的编辑频率为25％。当使用ddPCR分析，正如预期的那样，S1-14(Aacc)、S1-18(aaCc)和S1-24(Aacc)的编辑频率为75％，S1-53(AaCC)和S1-104(AACc)的编辑频率为25％，这与之前的结果一致(图5中B图)，这表明我们的ddPCR方法在检测多倍体生物突变方面的稳定性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法
<130> PA20034568
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