一种从生物体代谢物中筛选靶蛋白配体的方法
阅读说明：本技术 一种从生物体代谢物中筛选靶蛋白配体的方法 (Method for screening target protein ligand from organism metabolite ) 是由 许国旺 王博弘 石先哲 秦倩 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于动态体积排阻色谱(KSEC)-质谱联用技术从生物体代谢物中筛选靶蛋白内源性配体的方法。采用间隔进样模式依次将代谢物提取物和目标蛋白上样到体积排阻色谱柱中,由于蛋白分子尺寸远大于代谢物因此拥有更快的柱内迁移速度,故而目标蛋白会穿越代谢物提取物区段首先从柱内洗脱。通过固定代谢物提取物浓度不断提高目标蛋白浓度,利用非靶向代谢组学分析手段可从代谢物提取物中高通量筛选出与目标蛋白具有相互作用的代谢物。该方法不需要对蛋白质或代谢物进行额外标记或固载,将体积排阻色谱与质谱直接串联使得前处理流程更为简单,全过程不使用有机试剂从而提高对亲水性配体代谢物的筛选效果,是一种可靠的代谢物-蛋白质相互作用高通量研究手段。(The invention discloses a method for screening endogenous ligands of target proteins from metabolites of organisms based on a dynamic size exclusion chromatography (KSEC) -mass spectrometry combined technology. The metabolite extract and the target protein are sequentially loaded into the size exclusion chromatographic column by adopting an interval sample injection mode, and the target protein can pass through the metabolite extract section and is firstly eluted from the column because the protein molecule size is far larger than that of the metabolite and has a faster migration speed in the column. The concentration of the target protein is continuously improved by fixing the concentration of the metabolite extract, and the metabolite which has interaction with the target protein can be screened out from the metabolite extract at high flux by using a non-targeted metabonomics analysis means. The method does not need to carry out additional marking or immobilization on protein or metabolite, directly connects the size exclusion chromatography and the mass spectrum in series to ensure that the pretreatment process is simpler, does not use an organic reagent in the whole process, thereby improving the screening effect of the hydrophilic ligand metabolite, and is a reliable metabolite-protein interaction high-throughput research means.)
技术领域
本发明涉及分析化学和生物化学领域，是一种基于动态体积排阻色谱-质谱联用技术从生物体代谢物中筛选靶蛋白内源性配体的方法。
背景技术
在生物体内，代谢物除了在代谢转化过程中充当中间物外，还作为反应信号直接或间接的触发适应性反应，参与了如脂质合成、糖酵解途径、脂质分解、蛋白分解、三羧酸循环等生理过程。细胞的营养状态、外界压力及生态条件影响着细胞内成千上万种代谢物的水平，这些分子介导的信号是通过包括代谢物-蛋白质功能性相互作用在内的一系列分子事件进行传递。因而，深入研究内源性代谢物与蛋白质间相互作用，将有助于我们准确描述特定生物事件的内在机理并预测其生物学后果，更能为生物医药研发和农业发展中揭示新型分子实体
虽然代谢物-蛋白质相互作用研究具有极为重要的生物学意义，但基于代谢体系的复杂性以及缺乏系统性的研究手段，仅有一小部分相互作用网络得到了较为深入的研究。常见的代谢物-蛋白质相互作用研究策略包括放射性同位素标记法、荧光光谱法、等离子体表面共振、核磁共振法等，这些技术手段大多需要对蛋白质或相关配体进行标记、固载或其它额外前处理，这样难免会导致假阳性结果的发生，故而开发一种无标记、无固载的高通量代谢物-蛋白质相互作用筛选方法十分必要。
体积排阻色谱(SEC)是一种基于分子尺寸差异对被分析物进行分离的色谱分析手段。虽然其分辨率偏低，但由于柱内分子拥挤效应的存在，使其成为了代谢物-蛋白质相互作用研究的有利手段，尤其将其与质谱联用更扩展其研究通量。Muckenschnabel等人将蛋白质与小分子混合物孵育后，利用SEC去除未结合的小分子而对蛋白质区段馏分进行LC-MS分析，从而定性与蛋白具有相互作用的小分子，但受限于当时SEC的分辨率及组学发展的落后，其分析结果的准确度和分析通量尚待提高。Krylov等人开发了一种动态体积排阻方法将其应用于小分子-蛋白质相互作用(1对1体系)的动力学研究，具有较好的分析效果，但其分析通量较低，并未将组学思维渗入其中。
发明内容
本发明针对现有方法不足，建立了一种基于动态体积排阻色谱-质谱联用技术从生物体代谢物中筛选靶蛋白内源性配体的方法。该方法不需要对蛋白质或代谢物进行额外标记或固载，将体积排阻色谱与质谱直接串联使得前处理流程更为简单，全过程不使用有机试剂从而提高对亲水性配体代谢物的筛选效果，是一种可靠的代谢物-蛋白质相互作用高通量研究手段。
本发明采用的技术路线如下：
第一步：采用间隔进样模式将代谢物提取物及空白的流动相先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；
第二步：采用间隔进样模式将代谢物提取物及目标靶蛋白先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；固定代谢物提取物上样量使其与步骤(1)相同；
第三步：采用间隔进样模式将代谢物提取物及目标靶蛋白先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；固定代谢物提取物上样量使其与步骤(1)相同，并使靶蛋白浓度高于步骤(2)。
第四步：重复步骤(3)3次，并分别利用质谱进行在线分析。
液相色谱条件：正负离子模式下均采用Agilent Technologies公司所产的Advanced Bio SEC(PL1580-5350,2.7μm，4.6×300mm)色谱柱。柱温为25℃。全程均采用等度洗脱模式，洗脱流动相为含有30mM甲酸铵水溶液(pH 7.2)。
第一步间隔进样模式为：首先进样5μL血清代谢物提取物到体积排阻色谱柱内，再进样5μL空白流动相到体积排阻柱内，两次进样间隔为0.25min。随后进行时长为35min的体积排阻分离。
第二-四步间隔进样模式为：首先进样5μL血清代谢物提取物到体积排阻色谱柱内，再进样含有靶蛋白浓度为5μM，25μM，125μM，250μM，500μM的30mM甲酸铵溶液上样到体积排阻色谱柱内，两次进样间隔为0.25min。随后进行时长为35min的分离过程。
质谱条件：质谱数据采集工作均由Q Exactive HF质谱仪完成(Thermo FisherScientific，Rockford，IL，USA)。质谱在正离子及负离子模式下的喷雾电压分别为3.5kV及3.0kV。离子传输管及离子化辅助气温度分别为300℃和350℃。鞘气和辅助气流速分别为45和10(in arbitrary units)。S-lens RF值设定为50.0。质谱数据采集模式为全扫描+自动触发二级质谱扫描(Full Scan+ddMS2)。一级质谱扫描离子范围为133-2000Da，选取一级谱中信号最高的10个离子进行碎裂，而后进行二级质谱扫描。归一化碰撞能(NCE)被分别设定为25，35，45eV。设定一级质谱扫描分辨率为120000，二级质谱扫描分辨率为30000。二级质谱扫描激发条件自动增益控制目标(AGC，automatic gain control)设定为1×106和1×105，最大离子注入时间为100ms和50ms。
第五步：利用非靶向代谢组学分析方法分别将步骤(2)-(4)与步骤(1)的质谱数据进行比较，找出色谱峰发生位移及强度发生变化的物质，筛选出代谢物提取物中保留形式及相对丰度变化与目标蛋白浓度变化成正比的代谢物作为目标蛋白的潜在内源性配体。
由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：该方法不需要对蛋白质或代谢物进行额外标记或固载，将体积排阻色谱与质谱直接串联使得前处理流程更为简单，全过程不使用有机试剂从而提高对亲水性配体代谢物的筛选效果，是一种可靠的代谢物-蛋白质相互作用高通量研究手段。
附图说明
图1动态体积排阻色谱概念图。T1时刻将血清代谢物提取物与蛋白质连续进样到体积排阻色谱柱，不同种类分子由于其流速差异在体积排阻色谱柱内的迁移模式随时间变化图(A)。T3时刻游离蛋白、配体代谢物及代谢物-蛋白质复合物相关浓度及质谱信号示意图(B)。T3游离蛋白、非配体代谢物相关浓度及质谱信号示意图(C)。
图2乙酰唑胺提取离子色谱随碳酸酐酶蛋白浓度变化图。
图3乙酰唑胺的实测二级谱图(a)及人类代谢组学数据库中二级图谱(b)。
图4 3,4,5-三甲氧基肉桂酸的提取离子色谱随HSA蛋白浓度变化图。
具体实施方式
通过具体实例对本发明的基于动态体积排阻色谱-质谱联用技术从生物体代谢物中筛选靶蛋白内源性配体方法及其应用进行细致阐述。
实施例1.基于动态体积排阻色谱-质谱联用技术从生物体代谢物中筛选碳酸酐酶内源性配体。
第一步采用间隔进样模式将5μL加标血清代谢物提取物(加入碳酸酐酶已知配体乙酰唑胺)及5μL空白的流动相先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；
第二步采用间隔进样模式将5μL加标血清代谢物提取物(加入碳酸酐酶已知配体乙酰唑胺)及5μL浓度为5μM碳酸酐酶先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；固定加标血清代谢物提取物上样量使其与步骤(1)相同；
第三步采用间隔进样模式将5μL加标血清代谢物提取物(加入碳酸酐酶已知配体乙酰唑胺)及5μL浓度25μM为碳酸酐酶先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；固定加标血清代谢物提取物上样量使其与步骤(1)相同；
第四步 固定其他条件，分别以浓度为125μM，250μM，500μM的碳酸酐酶重复该实验并利用质谱进行在线检测。
加标血清代谢物提取物的制备方法：向血清中按照1:4的体积比加入甲醇并涡旋30s,而后将其置于14000rpm转速下离心取上清，作为血清代谢物提取物备用。向血清代谢物提取物中加入乙酰唑胺使其浓度为80μM作为加标血清代谢物提取物备用。
液相色谱条件：正负离子模式下均采用Agilent Technologies公司所产的Advanced Bio SEC(PL1580-5350，2.7μm，4.6×300mm)色谱柱。柱温为25℃。全程均采用等度洗脱模式，洗脱流动相为含有30mM甲酸铵水溶液(pH 7.2)。色谱流速维持在0.3mLmin-1。
步骤(1)间隔进样模式为：首先进样5μL加标血清代谢物提取物到体积排阻色谱柱内，再进样5μL空白流动相(30mM甲酸铵)到体积排阻柱内，两次进样间隔为1min。随后进行时长为35min的体积排阻分离。
步骤(2)-(4)的间隔进样模式为：首先进样5μL加标血清代谢物提取物到体积排阻色谱柱内，再进样5μL含有碳酸酐酶浓度为5μM，25μM，125μM，250μM，500μM的30mM甲酸铵溶液上样到体积排阻色谱柱内，两次进样间隔为1min。随后进行时长为35min的分离过程。
质谱条件：质谱数据采集工作均由配备有常规加热电喷雾离子源的OrbitrapEliteTM质谱仪完成。质谱在正离子及负离子模式下的喷雾电压分别为4.5kV及3.0kV。离子传输管为320℃，源加热温度为100℃。鞘气和辅助气流速分别为为45和10(inarbitrary units)。质谱数据采集模式为全范围离子扫描+二级质谱扫描(Full Scan+ddMS2)。一级质谱扫描离子范围为70-1500Da，选取一级质谱中信号最高的10个离子进行碎裂，而后进行二级质谱扫描。常规碰撞能(NCE)设定为35eV。
第五步利用非靶向代谢组学分析手段对步骤(2)-(4)与步骤(1)的质谱数据进行比较，筛选加标代谢物提取物中色谱峰发生位移且强度发生变化的物质。并以加标代谢物提取物中保留形式及相对丰度变化与碳酸酐酶浓度变化成正比的代谢物作为碳酸酐酶的潜在内源性配体。结果显示，分子量为220.9784的物质满足该筛选条件，利用一级及二级质谱数据确定该物质为碳酸酐酶已知配体乙酰唑胺。其提取离子流图及二级质谱图如图2和图3所示。且并未筛选定性出其他碳酸酐酶内源性配体，证明该方法具有良好的筛选效果。
实施例2.基于动态体积排阻色谱-质谱联用技术从生物体代谢物中筛选人血清白蛋白内源性配体。
第一步采用间隔进样模式将5μL血清代谢物提取物及5μL空白的流动相先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；
第二步采用间隔进样模式将5μL血清代谢物提取物及5μL浓度为5μM人血清白蛋白先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；固定加标血清代谢物提取物上样量使其与步骤(1)相同；
第三步采用间隔进样模式将5μL血清代谢物提取物及5μL浓度25μM为人血清白蛋白先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；固定加标血清代谢物提取物上样量使其与步骤(1)相同；
第四步 固定其他条件，分别以浓度为125μM，250μM，500μM的人血清白蛋白重复该实验并利用质谱进行在线检测。
血清代谢物提取物的制备方法：向血清中按照1:4的体积比加入甲醇并涡旋30s,而后将其置于14000rpm转速下离心取上清，作为血清代谢物提取物备用。
液相色谱条件：正负离子模式下均采用Agilent Technologies公司所产的Advanced Bio SEC(PL1580-5350，2.7μm，4.6×300mm)色谱柱。柱温为25℃。全程均采用等度洗脱模式，洗脱流动相为含有30mM甲酸铵水溶液(pH 7.2)。色谱流速维持在0.35mL min-1。
步骤(1)间隔进样模式为：首先进样5μL血清代谢物提取物到体积排阻色谱柱内，再进样5μL空白流动相(30mM甲酸铵)到体积排阻柱内，两次进样间隔为15s。随后进行时长为35min的体积排阻分离。
步骤(2)-(4)的间隔进样模式为：首先进样5μL血清代谢物提取物到体积排阻色谱柱内，再进样5μL含有靶蛋白浓度为5μM，25μM，125μM，250μM的30mM甲酸铵溶液上样到体积排阻色谱柱内，两次进样间隔为15s。随后进行时长为35min的分离过程。
质谱条件：质谱数据采集工作均由配备有常规加热电喷雾离子源的OrbitrapEliteTM质谱仪完成。质谱在正离子及负离子模式下的喷雾电压分别为4.5kV及3.0kV。离子传输管为320℃，源加热温度为100℃。鞘气和辅助气流速分别为为45和10(inarbitrary units)。质谱数据采集模式为全范围离子扫描+二级质谱扫描(Full Scan+ddMS2)。一级质谱扫描离子范围为70-1500Da，选取一级质谱中信号最高的10个离子进行碎裂，而后进行二级质谱扫描。常规碰撞能(NCE)设定为35eV。
第五步利用非靶向代谢组学分析手段对步骤(2)-(4)与步骤(1)的质谱数据进行比较，筛选代谢物提取物中色谱峰发生位移且强度发生变化的物质。并以代谢物提取物中保留形式及相对丰度变化与人血清白蛋白浓度变化成正比的代谢物作为靶蛋白的潜在内源性配体。结果显示，成功从血清提取物中筛选定性出多种已报道的与血清白蛋白具有相互作用的内源性配体，例如3,4,5-三甲氧基肉桂酸胆酸、甲基吲哚3-乙酸等。其中3,4,5-三甲氧基肉桂酸的提取色谱图随蛋白浓度变化如图4所示。