一种检测食品中稻曲菌素a或稻曲菌素b的方法
阅读说明：本技术 一种检测食品中稻曲菌素a或稻曲菌素b的方法 (Method for detecting ustilagin A or ustilagin B in food ) 是由 刘春生 孙倩 孔任 于 2020-12-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于分析化学领域,公开了一种检测食品中稻曲菌素A或稻曲菌素B的方法。该方法的步骤包括：待测样品冷冻干燥并粉碎过筛,加入超纯水溶液超声提取,提取液加入二氯甲烷涡旋离心,收集的上清液采用WAX固相萃取柱净化。净化后的待测样品借助超高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪分析稻曲菌素A和稻曲菌素B的含量。本方法可同时实现对大米、谷糠、米粉、青贮饲料等多种稻谷制品中UA和UB的定性定量检测,回收率高可达到87%-96%,检出限可低至40 ng/kg,在食品及饲料中毒素残留分析方面具有较大的应用前景。(The invention belongs to the field of analytical chemistry, and discloses a method for detecting ustilaginoidin A or ustilaginoidin B in food. The method comprises the following steps: freeze-drying, pulverizing, sieving, adding ultrapure water solution, ultrasonic extracting, adding dichloromethane into the extractive solution, centrifuging, and purifying the collected supernatant with WAX solid phase extraction column. And analyzing the contents of the ustilaginoidin A and the ustilaginoidin B in the purified sample to be detected by means of an ultra-high performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometer. The method can simultaneously realize qualitative and quantitative detection of UA and UB in various rice products such as rice, bran coat, rice flour, silage and the like, has high recovery rate of 87-96 percent and detection limit as low as 40ng/kg, and has wide application prospect in the aspect of toxin residue analysis in food and feed.)
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种检测食品中稻曲菌素A或稻曲菌素B的方法。
背景技术
水稻作为全球三种最重要的粮食作物之一，为全球近21％的人提供了食物来源。近年来，随着高产密穗性杂交水稻的大面积推广、水稻栽培模式的改变等，稻曲病已成为我国水稻生产中三大真菌病害之一，其主要次生代谢产物-稻曲菌素受到了广泛关注。稻曲菌素是一类水溶性环肽类真菌毒素，当前已有6种结构类似的化合物被分离和鉴定，其中稻曲菌素A(UA)和稻曲菌素B(UB)是含量最多和毒性最强的毒素。稻曲菌素是一类潜在的真核生物抗有丝分裂剂，对动、植物细胞均具有广泛的生物活性。据报道，过量摄入稻曲菌素可引起家禽多器官病变，甚至个体死亡。鉴于稻曲病的普发性和高频性，选择性监测稻谷及其制品中UA和UB的残留水平对评估其食用安全具有重要意义。
目前，真菌毒素常规检测方法主要有色谱分析法、液质联用技术、免疫酶联吸附法。其中，免疫酶联法容易出现假阳性，且当多种稻曲菌素同时存在时无法同时准确提供每种毒素的精确含量。液质联用技术(LC-MS/MS)由于选择性好、灵敏度高等优点而广受研究者青睐，是近年来发展最为迅速的检测方法之一。近年来，有些课题组基于LC-MS/MS技术在检测稻曲菌素的检测方面取得了不错的成果。例如，史建荣等以含PEG4000的去离子水为提取溶剂，采用C18柱固相萃取小柱为净化柱，并借助LC-MS/MS实现稻谷中稻曲菌素的检测，其中UA的检出限为5.0μg/L。Chen等结合UA和UB的分子结构特征，利用两者酸性条件可带正电荷的特点，以PCX混合阳离子交换柱为净化柱构建了一种用于精米中UA和UB的定量分析方法，其中UA和UB的定量限为1μg/kg。虽然这些方法在检测大米中稻曲菌素时表现时均表现出优良的性能，但它们普遍存在样品需求量大(一般为5-20g)、灵敏度低等缺点，并不适合其它稻谷制品中痕量稻曲菌素的检测。这主要是因为青贮饲料、稻壳等稻谷制品中稻曲菌素含量相对较低，且含有多种大极性的色素、有机酸干扰物，难以在上述样品预净化和富集步骤中去除，易在质谱分析时造成严重的基质抑制效应。
针对复杂基质的中痕量物质分析时，有效的预净化和富集手段是提高样品检出限的方法之一。值得注意的是，流动相的种类不仅影响目标化合物分离效果，还决定了待测组分的离子化效率。例如，雌激素在NH4F体系中离子化效率明显高于氨水体系；黄曲霉毒素、伏马毒素、柄曲霉素等多种真菌毒素在乙酸铵体系中的离子化效率显著高于甲酸体系。因此，优化色谱条件也是提高方法灵敏度的最有效的方法之一。
针对现有的技术问题，本发明旨在提供一种的前处理方法，实现食品中UA和UB的快速、准确、高灵敏检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测食品中稻曲菌素A或稻曲菌素B的方法，该方法可快速检测包括稻米、米糠、稻壳、米饭、青贮饲料等中的痕量的稻曲菌素A和稻曲菌素B，实现快速、准确，高灵敏的检测。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种检测食品中稻曲菌素A和/或稻曲菌素B的方法，包括下述步骤：
(1)样品提取：
待测品冷冻干燥并粉碎，加水后振荡，冰浴超声，离心收集上清液，残渣继续按照上述步骤进行萃取，合并上清；上清液加入二氯甲烷，震荡后离心收集上层水相，为待净化液；
(2)固相微萃取柱净化
采用0.1-1％甲酸溶液调节上述待净化液pH范围在4.0～6.0，并以0.1-1mL/min的流速通过提前活化好的WAX柱，弃流出液；依次用1-4mL pH＝4～6甲酸溶液、1-4mL甲醇淋洗固相萃取小柱，最终采用1-5％氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液氮吹至净干，0-10％甲醇-水复溶，过滤膜后待上机检测；
WAX活化条件为：依次量取2-4mL甲醇、2-4mLpH＝4.0～6.0甲酸水溶液以0.1-1mL/min的流速通过WAX柱；
(3)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪检测
将待测液用超高液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(LC-MS/MS)进行检测，采用外标法定量，以检测待测样品中UA和UB；其中：
(a)超高效液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)；柱温为30-45℃；进样体积为1-5μL；流速为0.20-0.40mL/min；流动相采用LC-MS级甲醇(A)和0.01-0.1％甲酸-水(B)，运行梯度为0-2min,2-5％A；2-6min,40-95％A；6-8min,95-100％A；8-8.5min,2-5％A；8.5-10min,2-5％A。
(b)质谱条件：离子源为ESI(+)，毛细管电压为0.5-1.0KV，脱溶剂温度为300-400℃，锥孔电压为20-60V，脱溶剂流速和碰撞气流速分别为600-800和100-200L/h；多级反应监测。
以上所述的方法中，优选的，UA和UB的定性离子对分别为m/z 674.30>209.00和m/z646.30>187.00；UA和UB的定量离子对分别为m/z 674.30>187.00和m/z 646.30>181.00。
以上所述的方法中，优选的，所述的WAX固相萃取柱的上样条件为pH＝5.0的甲酸水溶液，最大上样体积为20mL。
以上所述的方法中，优选的，所述的WAX固相萃取柱的洗脱条件为1％氨化甲醇溶液。
以上所述的方法中，优选的，步骤(3)(a)中所述的液相流动相为甲醇和0.01％甲酸-水体系。
以上所述的方法中，优选的，WAX柱的活化条件为：依次量取3mL甲醇、3mLpH＝5.0甲酸水溶液以1mL/min的流速通过WAX柱。
以上所述的方法中，优选的，UA和UB的具体质谱参数：
UA和UB检测的质谱分析条件
以上所述的方法适用于稻米、米糠、稻壳、米饭、青贮饲料中的UA和UB的检测。与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1本发明建立了一种稻曲菌素液质检测法，能够有效检测大米、谷糠、米糊、青贮饲料等稻谷制品中稻曲菌素，对开展稻曲菌素的环境分布和环境危害评估具有重要意义。
2本发明方法具有灵敏度高、重复性好等优势，UA和UB的加标回收率在87％-96％之间，定量检测限可低至40ng/kg，且样品基质对目标分子基本无抑制效应，表明该方法可准确分析食品或饲料中稻曲菌素A或稻曲菌素B的残留情况。
3本发明采用弱阴离子固相交换柱对稻谷及其相关制品中痕量的稻曲菌素A和稻曲菌素B进行提取富集。在该体系中，糖、有机碱及有机弱酸等干扰物在WAX柱上基本不保留或弱保留，实现了待测样品的第一次净化。随后，借助纯甲醇溶液淋洗可有效去除色谱上非特异性吸附的大极性色素分子，进一步实现对待测样品中UA的净化和富集，最大程度上降低样品的基质效应和基线噪音。
附图说明
图1为各型号固相萃取柱对大米中UA和UB的回收率。
图2为44份商业大米中UA和UB的分布情况。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例所述的WAX柱购自安谱(CNW，200mg，3CC)。
实施例1：
一种检测食品中稻曲菌素A或稻曲菌素B的方法，包括下述步骤：
本发明
1.1样品提取：
待测品冷冻干燥，并采用高速粉碎机粉碎并过100目筛。称取0.5g粉碎后的待测品，加入稻曲菌素的混合标准液(含100μg/L的UA和100μg/L的UB)，使得UA和UB在样品中的终的浓度分别为0和0μg/kg；2和2μg/kg；10和10μg/kg(添加UA和UB浓度为0和0μg/kg是作为空白基质样品即空白对照，二者均为2和10μg/kg的加标后的空白基质样品)，混匀后室温平衡30min。加入6mL超纯水，涡旋1min后振荡15min并冰浴超声15min，7000rpm离心10min收集上清液。残渣用6mL*2水再次萃取两次，合并上清，获得提取液；
所述的待测样品为：不含UA和UB的大米、米糠、稻壳、米饭、青贮饲料。
1.2液-液萃取：
提取液加入15mL二氯甲烷，涡旋振荡1min，7000rpm离心5min,收集上层水相，待净化。
1.3固相萃取：
采用0.1％甲酸溶液调节上述待净化液pH至5.0，并以1mL/min的流速通过提前活化好的WAX柱(活化方式为：依次用3mL甲醇、3mL pH＝5.0甲酸水溶液，以1mL/min的流速通过WAX柱，CNW 200mg,3CC)，弃流出液。依次用2mL pH＝5.0甲酸水溶液、2mL甲醇以1mL/min的流速淋洗固相萃取小柱，弃去淋洗液，真空泵抽干20min。最终采用2mL1％氨化甲醇溶液分两次洗脱(控制流速在1ml/min以内)，合并洗脱液。洗脱液氮吹至净干，采用5％甲醇-水定容至200μL，过0.22μM滤膜后转移至内插中待上机检测。
1.4 LC-MS/MS定量检测稻曲菌素A和稻曲菌素B
5％甲醇-水梯度稀释步骤1.3中的溶液使得UA和UB的最终浓度为0.05～100μg/L，借助LC-MS/MS检测溶液在不同浓度UA和UB存在时的总离子流图。随后以浓度为横坐标，以定量离子对的选择检测图的峰面积为纵坐标，分别建立UA和UB的标准曲线。
LC-MS/MS检测设备为：Waters ACQUITY H-Plus(UHPLC)超高效液相色谱串联TQ-XS三重四级杆质谱(Milford,MA,USA)进行检测。
液相色谱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱，流动相为甲醇(A)和0.01％甲酸水(B)；柱温为40℃；进样体积为2μL；流速为0.3mL/min。流动相采用LC-MS级甲醇(A)和0.01％甲酸-水(B)，运行梯度为如下表所示。
液相运行梯度
时间(min)
A(％)
0
5
0.5
5
6
95
8
100
8.2
5
10
5
质谱采用电喷雾(ESI+)离子源，毛细管电压为1.0KV，脱溶剂温度为300℃，锥孔电压为30V，脱溶剂流速和碰撞气流速分别为600和150L/h，多反应监测(MRM)模式检测扫描目标分析物，UA和UB的定性离子对分别为m/z 674.30>209.00和m/z 646.30>187.00；UA和UB的定量离子对分别为m/z 674.30>187.00和m/z 646.30>181.00。
UA和UB检测的质谱分析条件
在0.05-100μg/L范围内，UA和UB的浓度均与对应的色谱峰面积呈现良好的线性关系，R2>0.999。采用加标回收法和标准加入法分别评价方法的回收率和样品的基质效应(参照《Waters样品前处理及色谱柱手册》)，结果如下表所示。
大米、米糠、谷糠、米饭、青贮饲料的稻谷制品中，UA的回收率在87.3-92.1％，UB的回收率在87.6-95.7％，UA的基质效应介于91.2-96.2％，UB的基质效应介于93.4-96.2％。按照S/N＝10计算方法最小定量限，UA和UB的定量检测下限分别为40ng/kg和25ng/kg(备注：检出限均换算成待测样品的质量浓度)。由此可见，本方法的准确性较好，灵敏度较高。
不同基质样品中UA和UB的加标回收率及基质效应
实施例2：
待测品提取液的不同对最终检测灵敏度的影响
称取0.5g空白大米样本，加入一定体积的UA和UB的混合溶液，使得大米中UA和UB的质量浓度均为2μg/kg。
UA和UB均为水溶性环肽，在水和甲醇中均具有较好的水溶性，申请人在实施例1中的步骤1.1中，选取不同比例的甲醇-水(10:0～0:10)的为提取溶剂。其余实验条件与实施例1相同。
实验发现，甲醇的浓度并不影响UA和UB的提取效率，但高浓度甲醇易将样品中的有机酸、色素、脂肪等提取出来导致样品的基线噪音升高。
实施例3：
不同品牌及功能的离子交换柱对UA和/或UB的吸附影响：
称取0.5g空白大米样本，加入一定体积的UA和UB的混合溶液，使得大米中UA和UB的质量浓度均为2μg/kg。
UA和UB均为两性分子，pKa1和pKa2分别为1.05和8.80，其在自由溶液中的带电性质取决于所处溶液pH。
申请人将实施例1所述方法，步骤1.3中的离子交换柱进行了替换，替换的离子交换柱分别为：Agilent PCX混合阳离子交换柱(200mg,3CC)，安捷伦PAX混合阴离子交换柱(200mg,3CC)，WatersOasisMCX混合型阳离子交换柱(200mg,3CC)，WatersOasisMAX混合型阴离子交换柱(200mg,3CC)，Waters Sep-Pak氨丙基(NH2)固相萃取柱(200mg,3CC)，WatersOasis WAX混合型弱阴离子交换柱(200mg,3CC)，安谱CNW WAX弱阴离子交换柱(200mg,3CC)。
其余参数与步骤1.3相同，以检测不同的离子交换柱对UA和UB的吸附能力的影响：
结果如图1所示。除离子交换作用外，PCX、PAX、MCX及MAX对UA和UB均具有较强的非特异性吸附作用，常规洗脱条件下UA和UB的回收率均低于70％。Oasis WAX和Sep-PakNH2在pH＝0～6范围内对UA和UB均不保留。CNW WAX弱阴离子交换柱在pH＝4～6范围内对UA和UB的保留效率高达95％，UA和UB的回收率均大于85％。
实施例4：
液相色谱中流动相甲酸浓度对灵敏度的影响：
称取0.5g不含UA和UA的空白大米样本，加入一定体积的UA和UB的混合溶液，使得大米中UA和UB的质量浓度均为2μg/kg。
改变实施例1步骤1.4中液相色谱中流动相中甲酸浓度(0-0.1％)，其余步骤与参数与实施例1相同。
实验结果表明，现有技术中，一般采取0.1％的甲酸进行洗脱分离，但在本发明中发现，0.01％甲酸能显著减小UA和UB的半峰宽，并增强其质谱响应，但高浓度甲酸(0.1％)会抑制UA和UB的离子化效率，降低方法灵敏度。随后分别以甲醇-水和乙腈-水为流动相，考察UA和UB的分离情况。结果表明UA和UB在甲醇-水体系中的离子化效率显著高于乙腈-水体系。
实施例5：
不同的色谱柱对灵敏度的影响：
称取0.5g空白青贮饲料样品，加入一定体积的UA和UB的混合溶液，使得样品中UA和UB的质量浓度均为2μg/kg。
改变实施例1步骤1.4中液相色谱中色谱柱种类及流动相梯度，其余步骤与参数与实施例1相同。
色谱柱具体型号为：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm,1.7μm)，ACQUITYUPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)
实验结果表明，在大多数流动相条件下C18色谱柱对UA和UB的保留能力都很差，且对UA和UB基本无分离能力。此外，当以甲醇和0.01％甲酸-水为流动相时，待测样品中UA和UB均存在严重的基质抑制效应，降低方法灵敏度。当以T3为色谱分离柱时，UA和UB具有较好的分离度，均能与待测样品中的杂质实现较好的基线分离，且基质效应可忽略不计，大大增加了方法的灵敏度。
实施例6：
WAX固相萃取柱中不同的上样条件、洗脱条件对灵敏度的影响：
称取0.5g空白青贮饲料样品，加入一定体积的UA和UB的混合溶液，使得样品中UA和UB的质量浓度均为2μg/kg。
改变实施例1步骤1.3中WAX柱的上样条件、淋洗条件及洗脱条件，其余步骤与参数与实施例1相同。
UA和UB为两性分子，在弱酸性条件下呈负电性。首先，对比了上样溶液pH值对UA和UB在弱阴离子交换柱WAX上吸附效果的影响。实验结果表明，当上样溶液的pH在4-6之间时，UA和UB在WAX柱上具有良好的保留能力；当溶液的pH过高或过低时其保留能力都很弱。随后，申请人发现上样溶液中的乙酸铵浓度会显著影响UA和UB的保留效果，UA和UB的吸附效果与上样液中盐浓度呈负相关趋势。在此基础上，本申请进一步优化WAX柱的淋洗和洗脱条件，最终确定当以2ml pH＝5的甲酸水溶液、2mL甲醇溶液依次淋洗小柱，以0.5％-2％氨化甲醇洗脱小柱时，不仅能获得较高的回收率，而且能有效去除待测样品中色素等杂质，降低基线噪音。综合考虑WAX小柱的个别差异、实际样品的复杂性以及实验稳定性，本发明实施例1选择了pH＝5.0的甲酸溶液为上样溶液、2mL水和2mL甲醇为淋洗溶剂、1％氨水甲醇溶液为样品洗脱剂。
实施例7：
本发明的方法在检测商业大米中UA和UB的残留检测中的应用：
分析2020年采集的湖北省恩施市44份大米样品中UA和UB的残留情况，按照实施例1中所述方法进行。
1)样品提取：
大米样品冷冻干燥，并采用高速粉碎机粉碎并过100目筛。称取0.5g粉碎后的样品，加入6mL超纯水，涡旋1min后振荡15min并超声15min(4℃)，7000rpm离心10min收集上清液。残渣用6mL*2水再次萃取两次，合并上清。
2)液-液萃取：
提取液加入15mL二氯甲烷，涡旋振荡1min，7000rpm离心5min,收集上层水相，待净化。
3)固相萃取：
采用0.1％甲酸溶液调节上述待净化液pH至5.0，并以1mL/min的流速通过提前活化好的WAX柱(3mL甲醇、3mL pH＝5.0甲酸水溶液)，弃流出液。依次用2mL pH＝5.0甲酸水溶液、2mL甲醇淋洗固相萃取小柱，弃去淋洗液，真空泵抽干20min。最终采用2mL1％氨化甲醇溶液分两次洗脱，合并洗脱液。洗脱液氮吹至净干，采用5％甲醇-水定容至200μL，过0.22μM滤膜后转移至内插中待上机检测。
4)LC-MS/MS定量检测UA和UB
制备含UA和UB的混合溶液，并梯度稀释上述溶液使得UA和UB的最终浓度为0.05～100g/L，借助LC-MS/MS检测溶液在不同浓度UA和UB存在时的总离子流图。随后以浓度为横坐标，以定量离子对的选择检测图的峰面积为纵坐标，分别建立UA和UB的标准曲线。其中LC-MS/MS检测条件为：Waters ACQUITY H-Plus(UHPLC)超高效液相色谱串联TQ-XS三重四级杆质谱(Milford,MA,USA)进行检测。其中，质谱采用电喷雾(ESI+)离子源，多反应监测(MRM)模式检测扫描目标分析物，UA和UB的定性离子对分别为m/z 674.30>209.00和m/z 646.30>187.00；UA和UB的定量离子对分别为m/z 674.30>187.00和m/z 646.30>181.00。液相色谱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱，流动相为甲醇(A)和0.01％甲酸水(B)；柱温为40℃；进样体积为2μL；流速为0.3mL/min。流动相采用LC-MS级甲醇(A)和0.01％甲酸-水(B)，运行梯度为0min,5％A；0.5min,5％A；6min,95％A；8min,100％A；8.2min,5％A；10min,5％A。
检测结果如图2所示，UA的检出率高达100％，平均值为1.69μg/kg；UB的检出率为86.4％，平均值为0.35μg/kg。
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