肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法和使用方法
阅读说明：本技术 肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法和使用方法 (Establishment method and use method of testosterone and 6 beta-hydroxytestosterone detection platform in liver microsome incubation system ) 是由 李明 盘建红 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法,包括如下步骤：采用甲醇稀释混合储备液,得到标准曲线工作液,任意一个浓度的标准曲线工作液中睾酮和6β-羟基睾酮的浓度相同。采用肝微粒体孵育体系稀释标准曲线工作液,得到标准曲线样品。取100ng/mL的标准曲线样品,加入含卡马西平的甲醇沉淀剂,振荡、离心后,取上清加入超纯水,采用LC-MS/MS进样分析。得出睾酮最优质谱条件和6β-羟基睾酮最优质谱条件。设置睾酮最优质谱条件以及6β-羟基睾酮最优质谱条件,将标准曲线样品采用LC-MS/MS进样分析,得到睾酮线性回归方程和6β-羟基睾酮线性回归方程。本发明方法缩短了分析时间,提高了检测效率,确保试验结果的准确性,并且符合方法学验证要求。(The invention discloses a method for establishing a testosterone and 6 beta-hydroxytestosterone detection platform in a liver microsome incubation system, which comprises the following steps: and diluting the mixed stock solution by using methanol to obtain a standard curve working solution, wherein the concentrations of testosterone and 6 beta-hydroxytestosterone in the standard curve working solution with any concentration are the same. And (4) diluting the standard curve working solution by adopting a liver microsome incubation system to obtain a standard curve sample. And (3) adding a methanol precipitator containing carbamazepine into a 100ng/mL standard curve sample, oscillating and centrifuging, taking the supernatant, adding ultrapure water, and performing sample injection analysis by adopting LC-MS/MS. Obtaining the optimal mass spectrum condition of testosterone and the optimal mass spectrum condition of 6 beta-hydroxytestosterone. And setting optimal mass spectrum conditions of testosterone and 6 beta-hydroxytestosterone, and analyzing the sample of the standard curve by adopting LC-MS/MS sample injection to obtain a testosterone linear regression equation and a 6 beta-hydroxytestosterone linear regression equation. The method shortens the analysis time, improves the detection efficiency, ensures the accuracy of the test result, and meets the requirement of methodology verification.)
技术领域
本发明涉及一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法和使用方法。
背景技术
与药物代谢密切相关的细胞色素P450酶(CYP450)主要有CYP1～4，其中以CYP3A亚族最为重要，在成人肝脏中以CYP3A4为主。
CYP3A4的底物较多，据统计大约38个类别共150多种药物是其底物，约占全部药物的50％，因此能够准确地评价CYP3A4的酶活性对药物相互作用研究以及临床合理用药都是十分重要的。
目前国内、外多采用睾酮作为CYP3A4的探针底物，通过测定肝微粒体体外代谢反应过程中睾酮的减少量或其代谢产物6β-羟基睾酮的生成量来评价该酶的活性。
传统的测试方法精确性差，较难准确评价CYP3A4的活性。因此，有必要再建立一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法和使用方法，其缩短了分析时间，提高了检测效率，确保试验结果的准确性，并且符合方法学验证要求。
本发明公开了一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法，包括如下步骤：
步骤一、最优质谱条件的确定
建立包含人肝微粒体、NADPH、氯化镁和PBS缓冲液的肝微粒体孵育体系；
配置混合储备液，使所述混合储备液中睾酮和6β-羟基睾酮的浓度相同；
采用甲醇稀释混合储备液，得到睾酮系列浓度为5～5000ng/mL的标准曲线工作液，任意一个浓度的标准曲线工作液中睾酮和6β-羟基睾酮的浓度相同；
采用肝微粒体孵育体系稀释标准曲线工作液，得到睾酮系列浓度为0.5～500ng/mL的标准曲线样品；
取100ng/mL的标准曲线样品，加入含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡、离心后，取上清加入超纯水，采用LC-MS/MS进样分析；
其中，对于睾酮分别设定第一质谱条件为：离子对m/z 289.4→m/z 109.1，锥孔电压90V，碰撞电压40V；第二质谱条件为：离子对m/z 289.4→m/z 97.1，锥孔电压90V，碰撞电压45V；第三质谱条件为：离子对m/z 289.4→m/z 88.0，锥孔电压90V，碰撞电压55V；比较检测结果，得出睾酮最优质谱条件；
其中，对于6β-羟基睾酮分别设定第四质谱条件为：离子对m/z 305.1→m/z287.3，锥孔电压50V，碰撞电压20V；第五质谱条件为：离子对m/z 305.1→m/z 269.3，锥孔电压50V，碰撞电压22V；第六质谱条件为：离子对m/z 305.1→m/z 227.2，锥孔电压50V，碰撞电压30V；比较检测结果，得出6β-羟基睾酮最优质谱条件；
步骤二、肝微粒体孵育体系中睾酮和6β-羟基睾酮检测平台的建立
设置睾酮最优质谱条件以及6β-羟基睾酮最优质谱条件，将睾酮系列浓度为0.5～500ng/mL的标准曲线样品采用LC-MS/MS进样分析，得到睾酮线性回归方程和6β-羟基睾酮线性回归方程。
作为优选，所述睾酮最优质谱条件为第一质谱条件。
作为优选，所述6β-羟基睾酮最优质谱条件为第五质谱条件。
作为优选，所述LC-MS/MS分析中液相色谱条件为：
流速：0.5mL/min；流动相A：含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；洗脱时长：1.5min；洗脱方式：梯度洗脱，总流速0.5mL/min；柱温：40℃；自动进样器温度：4℃；进样体积：5μL；保留时间：睾酮1.1min，6β-羟基睾酮0.9min，卡马西平1.2min。
进一步优选，所述LC-MS/MS分析中梯度洗脱程序为：
0.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；
0.5min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；
1.0min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；
1.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；
1.5min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％。
作为优选，所述LC-MS/MS分析中质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式；扫描方式：多反应检测扫描；碰撞气：9psi；气帘气：20psi；Resolution Q1/Q3：Unit/Unit；喷雾电压：5500v；离子化温度：500℃；分析时间：1.5min。
进一步优选，所述LC-MS/MS分析中，所述睾酮的质谱条件为：Q1：289.4Da；Q3：109.1Da；时间：100ms；去簇电压：90V；碰撞电压：40V；碰撞室射出电压：15V；射入电压：10V；
所述6β-羟基睾酮的质谱条件为：Q1：305.1Da；Q3：269.3Da；时间：100ms；去簇电压：50V；碰撞电压：22V；碰撞室射出电压：15V；射入电压：10V；
所述卡马西平的质谱条件为：Q1：237.1Da；Q3：194.1Da；时间：100ms；去簇电压：60V；碰撞电压：24V；碰撞室射出电压：15V；射入电压：10V。
本发明同时提供了一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的使用方法，其采用上述肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法所建立的检测平台，包括以下步骤：
将睾酮在肝微粒体孵育体系中进行孵育得到孵育物；
取孵育物200μL，加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，LC-MS/MS进样分析；其中甲醇沉淀剂卡马西平浓度为10ng/mL；
根据睾酮线性回归方程和6β-羟基睾酮线性回归方程，计算孵育物中睾酮及其特异性产物6β-羟基睾酮的浓度。
本发明的有益效果如下：
本发明建立的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台同时检测睾酮原型与代谢产物，针对一些需要同时检测分析的试验，缩短了分析时间，提高了检测效率。针对一些不必需同时检测分析的试验，相当于增加了联合检测，确保试验结果的准确性。
本发明建立的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台进行了系统的方法学验证，确保检测结果的准确性。
本发明建立的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台基质效应小、批内和批间准确度与精密度高、稳定性高，符合方法学验证要求，具有广泛的应用前景。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中睾酮LC-MS/MS中母离子和锥孔电压的优选结果；
图2是本发明实施例中6β-羟基睾酮LC-MS/MS中母离子和锥孔电压的优选结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例提供了一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法，本实施例中所述空白基质为包含人肝微粒体、NADPH、氯化镁和PBS缓冲液的肝微粒体孵育体系。本实施例甲醇沉淀剂中卡马西平浓度为10ng/mL，卡马西平即为本实施例的内标物。
本实施例肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法包括如下步骤：
步骤一、最优质谱条件的确定
(1)建立包含人肝微粒体、NADPH、氯化镁和PBS缓冲液的肝微粒体孵育体系。
(2)配置混合储备液
采用甲醇和睾酮标准品配置睾酮浓度为1mg/mL的睾酮储备液；
采用甲醇和6β-羟基睾酮标准品配置6β-羟基睾酮浓度为1mg/mL的6β-羟基睾酮储备液；
将睾酮储备液和6β-羟基睾酮储备液按照体积比1:1混合，得到睾酮和6β-羟基睾酮的浓度均为0.5mg/mL的混合储备液。
(3)配置标准曲线样品
采用甲醇稀释混合储备液，得到睾酮系列浓度为5、10、30、100、300、1000、3000、5000ng/mL的标准曲线工作液。任意一个浓度的标准曲线工作液中睾酮和6β-羟基睾酮的浓度相同。
将标准曲线工作液和肝微粒体孵育体系按照体积比1:9混合，得到睾酮系列浓度为0.5、1、3、10、30、100、300、500ng/mL的标准曲线样品。任意一个浓度的标准曲线样品中睾酮和6β-羟基睾酮的浓度相同。
(4)配置质控样品
采用甲醇稀释混合储备液，得到睾酮系列浓度为5、150、2500、4000ng/mL的质控工作液。任意一个浓度的质控工作液中睾酮和6β-羟基睾酮的浓度相同。
将质控工作液和肝微粒体孵育体系按照体积比1:9混合，摇匀，得到睾酮系列浓度为0.5、15、250、400ng/mL的质控样品。任意一个浓度的质控样品中睾酮和6β-羟基睾酮的浓度相同。
(5)进样分析
取100ng/mL的标准曲线样品，加入含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡、离心后，取上清加入超纯水，采用LC-MS/MS进样分析。
对于睾酮分析样品分别设定第一质谱条件、第二质谱条件和第三质谱条件，比较检测结果，得出最优质谱条件。
其中，第一质谱条件为：离子对m/z 289.4→m/z 109.1，锥孔电压90V，碰撞电压40V，结果显示强度为2.55×105。
第二质谱条件为：离子对m/z 289.4→m/z 97.1，锥孔电压90V，碰撞电压45V，结果显示强度为2.40×105。
第三质谱条件为：离子对m/z 289.4→m/z 88.0，锥孔电压90V，碰撞电压55V，结果显示强度为1.35×105。
附图1为母离子和锥孔电压的优选结果，综合考虑图谱和强度的结果，选用第一质谱条件。
对于6β-羟基睾酮分析样品分别设定第四质谱条件、第五质谱条件和第六质谱条件，比较检测结果，得出最优质谱条件。
其中，第四质谱条件为：离子对m/z 305.1→m/z 287.3，锥孔电压50V，碰撞电压20V，结果显示强度为1.32×105。
第五质谱条件为：离子对m/z 305.1→m/z 269.3，锥孔电压50V，碰撞电压22V，结果显示强度为1.65×105。
第六质谱条件为：离子对m/z 305.1→m/z 227.2，锥孔电压50V，碰撞电压30V，结果显示强度为8.50×104。
附图2为母离子和锥孔电压的优选结果，综合考虑图谱和强度的结果，选用第五质谱条件。
步骤二、肝微粒体孵育体系中睾酮和6β-羟基睾酮检测平台的建立
设置睾酮的质谱条件为第一质谱条件，6β-羟基睾酮的质谱条件为第五质谱条件，将标准曲线样品采用LC-MS/MS进样分析，得到睾酮线性回归方程和6β-羟基睾酮线性回归方程。
本实施步骤一和步骤二中，LC-MS/MS分析中液相色谱条件参加表1和表2：
表1液相色谱条件
表2梯度洗脱程序
LC-MS/MS的质谱条件参加表3和表4。
表3质谱条件1
表4质谱条件2
步骤三、睾酮检测平台的建立中，LC-MS/MS测试的方法学验证
(1)批内和批间精度/准确度
本实施例质控样品中，睾酮的浓度包括：定量下限(LLOQ)0.5ng/mL、低浓度(QC3)15ng/mL、中浓度(QC2)250ng/mL和高浓度(QC1)400ng/mL。每个浓度的质控样品中，同时也含有6β-羟基睾酮，6β-羟基睾酮的浓度和睾酮浓度是相同的，举例而言，LLOQ样品中，同时含有0.5ng/mL的睾酮和0.5ng/mL6β-羟基睾酮。
取每个浓度的质控样品200μL，加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，LC-MS/MS进样分析，每个浓度设置6组平行，连续测定3批(批内精度/准确度-1、批内精度/准确度-2、批内精度/准确度-3)，以当批标准曲线计算其浓度，并根据测试结果分析批间精度/准确度和批内精度/准确度。测样时，每个质控样品经过一次分析，同时检测到睾酮和6β-羟基睾酮的结果。睾酮相关结果参见表5-8，6β-羟基睾酮相关结果参见表9-12。
对于定量下限组，准确率应当在80-120％之间，变异系数小于等于20％。对于低浓度、中浓度和高浓度组，准确率应当在85-115％之间，变异系数小于等于15％。由测试和分析结果可知，本实施例方法可以达到要求。
表5睾酮批内精度/准确度-1
表6睾酮批内精度/准确度-2
表7睾酮批内精度/准确度-3
表8睾酮批间精度/准确度
表9 6β-羟基睾酮批内精密度&准确度-1
表10 6β-羟基睾酮批内精密度&准确度-2
表11 6β-羟基睾酮批内精密度&准确度-3
表12 6β-羟基睾酮批间精密度&准确度
(2)标准曲线验证
按照步骤一中方法，配置睾酮系列浓度为0.5、1、3、10、30、100、300、500ng/mL的标准曲线样品，每个浓度的标准曲线样品中6β-羟基睾酮的浓度和睾酮的浓度相同。
取每个浓度的标准曲线样品200μL，加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，LC-MS/MS进样分析。
每个浓度分别做6组平行，每个样品只经过一次分析，同时检测两种成分，睾酮的测试和分析结果见表13，6β-羟基睾酮的测试和分析结果见表14。
结果显示，本实施例检测方法中睾酮线性回归方程以及6β-羟基睾酮线性回归方程的线性关系较好。
表13睾酮标准曲线验证
表14 6β-羟基睾酮标准曲线验证
(3)基质效应和提取回收率
提取物样本：取睾酮浓度分别为低浓度(QC3)15ng/mL、中浓度(QC2)250ng/mL和高浓度(QC1)400ng/mL的质控样品200μL，向每个浓度的质控样品中加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，LC-MS/MS进样分析。每个浓度共6组平行，得到提取物样本的峰面积数据，每个浓度的质控样品中6β-羟基睾酮的浓度和睾酮的浓度相同，每个样品只经过一次分析，同时检测两种成分，睾酮提取物样本测试结果参见表15，6β-羟基睾酮提取物样本测试结果参见表16。
提取后加入样本：在180μL空白基质中加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂后，再与20μL质控工作液混合，得到睾酮浓度分别为低浓度(QC3)15ng/mL、中浓度(QC2)250ng/mL和高浓度(QC1)400ng/mL的提取后加入样本，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，LC-MS/MS进样分析，每个浓度共6组平行，得到提取后加入样本的峰面积数据，每个浓度的质控工作液中6β-羟基睾酮的浓度和睾酮的浓度相同，每个样品只经过一次分析，同时检测两种成分，睾酮提取后加入样本测试结果参见表17，6β-羟基睾酮提取后加入样本测试结果参见表18。
无基质样本：在180μL超纯水中加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂后，再与20μL质控工作液混合，得到睾酮浓度分别为低浓度(QC3)15ng/mL和高浓度(QC1)400ng/mL的无基质样品，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，LC-MS/MS进样分析，每个浓度共6组平行，得到无基质样本的峰面积数据，每个浓度的质控工作液中6β-羟基睾酮的浓度和睾酮的浓度相同，每个样品只经过一次分析，同时检测两种成分，睾酮无基质样本测试结果参见表19，6β-羟基睾酮无基质样本测试结果参见表20。。
由提取物样本、提取后加入样本及无基质样本的测试结果分析得到基质效应和回收率相关数据，睾酮回收率参见表21，6β-羟基睾酮回收率参见表22，睾酮基质效应参见表23，6β-羟基睾酮基质效应参见表24。结果显示本实施例测试方法具有低基质效应和高提取回收率。
表15睾酮提取物样本的峰面积数据
表16 6β-羟基睾酮提取物样本的峰面积数据
表17睾酮提取后添加样本的峰面积数据
表18 6β-羟基睾酮提取后添加样本的峰面积数据
表19睾酮无基质样本的峰面积数据
表20 6β-羟基睾酮无基质样本的峰面积数据
表21睾酮回收率
表22 6β-羟基睾酮回收率
表23睾酮基质效应
表24 6β-羟基睾酮基质效应
(4)稳定性
取睾酮浓度分别为低浓度(QC3)15ng/mL和高浓度(QC1)400ng/mL的质控样品200μL，每个浓度的质控样品中睾酮和6β-羟基睾酮的浓度相同。向每个浓度的质控样品中加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，置于进样器中放置24h后进样分析，每个浓度共3组平行，每个样品只经过一次分析，同时检测两种成分，睾酮进样器稳定性测试结果见表25，6β-羟基睾酮进样器稳定性测试结果26。
取睾酮浓度分别为低浓度(QC3)15ng/mL和高浓度(QC1)400ng/mL的质控样品200μL，置于室温下放置6h，然后向每个浓度的质控样品中加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，进样分析，每个浓度共3组平行，每个样品只经过一次分析，同时检测两种成分，睾酮室温稳定性测试结果见表27，6β-羟基睾酮室温稳定性测试结果28。
由测试数据可知，本实施例方法的稳定性较高。
表25睾酮进样器稳定性测试
表26 6β-羟基睾酮进样器稳定性测试
表27睾酮室温稳定性测试
表28 6β-羟基睾酮室温稳定性测试
(5)残留
取高浓度500ng/mL的标准曲线样品200μL，加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀。
按照标准曲线样品的方法制备不含睾酮和6β-羟基睾酮的空白样本。
(6)将睾酮标准曲线样品和空白样本交替进样，试验设置6组平行。每个样品只经过一次分析，同时检测两种成分，睾酮峰面积数据见表29，睾酮残留测试结果见表30，6β-羟基睾酮峰面积数据见表31，6β-羟基睾酮残留测试结果见表32。
由测试结果可知，本方法无残留。
表29睾酮峰面积数据
表30睾酮残留测试
表31 6β-羟基睾酮峰面积数据
表32 6β-羟基睾酮残留测试
通过上述的方法学验证试验，表明本发明建立的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台基质效应小、批内和批间准确度与精密度高、稳定性高，符合方法学验证要求，具有广泛的应用前景。
步骤四、肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的使用
将睾酮在肝微粒体孵育体系中进行孵育得到孵育物。取孵育物200μL，加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，5μL LC-MS/MS进样分析；其中甲醇沉淀剂卡马西平浓度为10ng/mL；
根据睾酮线性回归方程和6β-羟基睾酮线性回归方程，计算孵育物中睾酮及其特异性产物6β-羟基睾酮的浓度。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
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