一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用
阅读说明：本技术 一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用 (Nitrilase mutant with improved nitrile hydrolysis activity specificity and application thereof ) 是由 郑仁朝 汤晓玲 闻鹏飞 郑裕国 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用,所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第200位、第224位、第229位、第246位进行单突变或多突变获得的。本发明构建的突变体C145N、K200R/R224W/A229P、K200R/R224W/N246V催化苯乙腈产生的主产物为苯乙酸,分别占产物含量的96.5％、96.3％和98.8％,腈水合活性比K200R/R224W分别下降88.3％、82.2％和94.3％,有利于定向生成目的产物苯乙酸。对腈水解酶的反应专一性调控使其能够应用于酰胺和羧酸的绿色工业催化合成,具有重要意义。(The invention discloses a nitrilase mutant with improved nitrile hydrolysis activity specificity and application thereof, wherein the mutant is obtained by carrying out single mutation or multiple mutation on the 200 th site, the 224 th site, the 229 th site and the 246 th site of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1. The mutants C145N, K200R/R224W/A229P and K200R/R224W/N246V constructed by the invention catalyze phenylacetonitrile to generate main products, namely phenylacetic acid which respectively account for 96.5%, 96.3% and 98.8% of the product content, and the nitrile hydration activity is respectively reduced by 88.3%, 82.2% and 94.3% compared with K200R/R224W, so that the targeted production of the target product phenylacetic acid is facilitated. The method has important significance for the green industrial catalytic synthesis of amide and carboxylic acid by specifically regulating and controlling the reaction of nitrilase.)
(一)技术领域
本发明涉及一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体及在合成苯乙酸中的应用。
(二)背景技术
腈化合物是一类含氰基的有机化工原料，广泛用于化工、医药、农药和材料工业。腈水解酶能够催化腈化合物水解生成羧酸，具有独特的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优势，在腈化合物转化中发挥重要作用。一些腈水解酶除催化腈化合物水解生成羧酸外，同时具有腈水合活性。如Piotrowski等发现拟南芥腈水解酶同时具有腈水解和腈水合活性，能够催化β-氰基-L-丙氨酸转化为天冬酰胺和天冬氨酸，天冬酰胺的含量高达60％以上(J.Biol.Chem.,2001,276,2616-2621)。此外，Bradyrhizobium japonicum腈水解酶催化β-氨基丙腈水解，β-氨基丙酰胺的比例高达33％(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2015,115,113-118)。
腈水解酶同时具有腈水解和水合活力的特性使其在生物有机合成中具有巨大潜力。提高腈水解酶的水解活性，专一性生成羧酸有利于产率的提高以及后期产物的分离纯化，为腈水解酶工业化生产提供便利。因此，腈水解酶反应专一性的调控对腈水解酶的工业化应用有着重要的意义。
随着基因工程技术的迅猛发展，通过分子改造可显著提高腈水解酶的活性、稳定性及底物特异性等催化性能。近年来，腈水解酶反应专一性的调控也成为研究热点。Gong等通过定点突变构建了双突变体I128L-N161Q，催化3-氰基吡啶时，产物中羧酸含量提高至99.1％，催化活力提高了1.98倍(Catalysis Science&Technology,2016,6(12):4134-4141)。DeSantis等对腈水解酶全基因序列进行饱和突变改造，获得了能够在3M底物浓度下高效催化3-羟基戊二腈的突变体，其产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸是阿托伐他汀的关键手性中间体(Journal of the American Chemical Society,2003,125(38):11476-11477.)。张焱等改造水稻(Oryza sativa)腈水解酶OsNIT，突变体K200R/R224W以苯乙腈为底物时，羧酸含量达到95.1％(CN111321132A)，但是突变体K200R/R224W腈水合活性依旧为野生型的22.74％。
(三)
发明内容
本发明目的是提供一种高产羧酸的腈水解酶突变体、编辑基因、工程菌及应用，对OsNIT进行反应专一性调控，在保持水解活力的同时，提高羧酸含量，同时降低其水合活力从而降低酰胺含量。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQID NO.1所示氨基酸序列第200位、第224位、第229位、第246位进行单突变或多突变获得的。所述突变体可采用易错PCR、定点饱和突变及组合突变构建获得。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第145位半胱氨酸突变为天冬酰胺(C145N，氨基酸序列SEQ ID NO.4所示)；(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第200位赖氨酸突变为精氨酸、第224位精氨酸突变为色氨酸、第229位丙氨酸突变为脯氨酸(K200R/R224W/A229P，氨基酸序列SEQ ID NO.5所示)；(4)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第200位赖氨酸突变为精氨酸、第224位精氨酸突变为色氨酸、第246位天冬酰胺突变为缬氨酸(K200R/R224W/N246V，氨基酸序列SEQ ID NO.6所示)。
本发明还提供一种所述腈水解酶突变体的编码基因，由编码基因构建的重组载体，及重组基因工程菌，所述重组载体按如下方法构建：将腈水解酶突变体基因插入pET-28b载体的BamH I与Hind III位点之间，构建含腈水解酶突变体基因的重组质粒。所述工程菌按如下方法制备：将构建的重组质粒转入宿主菌得到重组工程菌。所述宿主菌可采用大肠杆菌Escherichia coli BL21。
本发明提供所述腈水解酶突变体在催化苯乙腈合成苯乙酸中的应用，所述的应用为：以含腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以苯乙腈为底物，以甲醇为助剂，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～60℃、150～500rpm/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得苯乙酸。
进一步，转化体系中底物的加入终浓度以缓冲液体积计为20-100mM，催化剂的用量以湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为5-20g/L，其中湿菌体含水质量为88-92％；所述甲醇加入体积浓度为2-8％，优选4.5％。
进一步，底物浓度优选为100mM。
进一步，湿菌体加入量优选为5g/L。
进一步，缓冲液为pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。
进一步，反应条件优选为30℃、180rpm下反应30min。
进一步，所述湿菌体的制备方法为：含腈水解酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养8-10h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养至菌体OD600为0.6-0.8，加入终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃、180rpm条件下诱导培养10-12h，于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体细胞，即为湿菌体。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明通过非理性及理性设计对反应非专一性腈水解酶OsNIT进行分子改造，获得反应专一性显著提高的突变体C145N、突变体K200R/R224W/A229P、K200R/R224W/N246V。野生型OsNIT催化苯乙腈时，苯乙酸含量为49.38％，同时将OsNIT腈水解活力记为100％。突变体C145N催化产物中羧酸的含量达到96.5％，相对腈水解活力为39.3％；突变体K200R/R224W/A229P催化产物中羧酸的含量为96.3％，相对水解活力为280.9％；突变体K200R/R224W/N246V催化产物中羧酸的含量为98.8％，相对水解活力为124.23％。构建的突变体C145N、K200R/R224W/A229P、K200R/R224W/N246V催化苯乙腈产生的主产物为苯乙酸，分别占产物含量的96.5％、96.3％和98.8％，腈水合活性比K200R/R224W分别下降88.3％、82.2％和94.3％，有利于定向生成目的产物苯乙酸。对腈水解酶的反应专一性调控使其能够应用于酰胺和羧酸的绿色工业催化合成，具有重要意义。
(四)附图说明
图1野生型OsNIT、突变体C145N、K200R/R224W/A229P、K200R/R224W/N246V催化苯乙腈性能比较。
(五)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
LB液体培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母提取粉，溶剂为去离子水，pH值自然。蛋白胨及酵母提取粉购自赛默飞世尔科技公司，NaCl购自于国药集团试剂有限公司。灭菌条件：使用高压蒸汽灭菌锅于121℃高温灭菌20min。灭菌后的培养基加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素方可用于菌体培养。
LB平板培养基组成：固体培养基是在上述LB液体培养基组成成分基础上加入20g/L琼脂粉，灭菌条件同上。
实施例1腈水解酶突变体的构建
1、突变体的构建
水稻腈水解酶(OsNIT，GenBank登录号：AB027054，氨基酸序列SEQ ID NO.1)催化苯乙腈反应时，产物中酰胺与羧酸的比例接近1:1。通过生物信息学分析，确定其催化三联体为196Cys-71Glu-162Lys，然后通过理性设计分析，第145位半胱氨酸、第200位赖氨酸、第224位精氨酸、第229位丙氨酸、第246位天冬酰胺进行定点饱和突变，构建了反应专一性显著提高的突变体，具体为：
将水稻腈水解酶(OsNIT，GenBank登录号：AB027054)基因(氨基酸序列SEQ IDNO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2)插入pET-28b载体BamH I与Hind III位点之间，构建重组质粒。以重组质粒为模板，采用表1引物，在表2反应体系下进行全质粒PCR扩增，在该基因第145位、第200位、第224位、第229位、第246位进行单位点定点饱和突变。
表1、引物
注：N＝A/G/C/T,K＝G/T,M＝A/C。
表2、反应体系
PCR程序设定：95℃预变性5min；95℃变性30s，Tm+3℃退火30s，72℃延伸4.5min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
PCR产物经过0.9％琼脂糖凝胶电泳分析确定PCR结果为阳性后，向PCR产物内加入限制性内切酶Dpn I，于37℃酶切0.5-1h去除模板质粒DNA，65℃灭活15min，获得消除模板后的PCR产物，即为含不同突变体的质粒。
往E.coli BL21(DE3)感受态细胞100μL中加入20μL消除模板后的PCR产物，置于冰上30min，42℃热击90s，加入600μL LB液体培养基，37℃复苏1h后涂布于含终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，每个平板获得约200个克隆的突变体库。挑取单菌落接种于含终浓度50mg/L卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养8小时后，提取质粒测序，每个位点得到含20种不同氨基酸的饱和突变体文库，即为含不同突变体的工程菌，进行下一步活力测定及筛选过程。
3、突变体重组基因工程菌湿菌体的制备
将测序正确的突变体重组基因工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养8-10h，以2％(v/v)接种量转接至新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至菌体OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG，28℃、180rpm诱导培养10-12h，于4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体细胞。-20℃保藏备用(即为静息细胞，用于苯乙腈水解反应)。
4、活力测定
反应体系组成为：20mL Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，湿菌体0.1g，甲醇0.9mL、苯乙腈100mM(苯乙腈先溶于甲醇)。反应液于30℃，180rpm反应30min。取样1mL，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。经高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度和比例，并计算酶活。
腈水解酶细胞酶活定义为标准反应条件即30℃，180rpm中，每分钟生成1μmol的苯乙酸所需要的细胞量为一个酶活力单位(1U)；
液相色谱分析采用C18柱，柱温40℃，检测波长210nm，流动相为甲醇：水＝30:70(含0.1％H3PO4)，流速1ml/min。
利用上述方法对单点突变结果进行分析，发现第145位点从半胱氨酸突变为天冬酰胺可以改变反应专一性，使其趋于生成羧酸，水解活力有较好的保留或有提高，水合活力被抑制。145位点饱和突变结果显示，除C145G、C145K、C145R、C145S、C145W、C145Y、C145E、C145F、C145H、C145Q、C145D无活力外，其余突变体按照上述步骤测算羧酸含量和酶活，结果见表3。由此选择优势突变体C145N，在提高羧酸含量的同时，较好保留水解活力，降低水合活力。发现第229位点从丙氨酸突变为其他19种氨基酸时，除A229W无活力外，其余突变体羧酸含量和酶活见表4。由此选择优势突变体A229P，其在提高羧酸含量同时，降低水合活力，提升水解活力。发现第246位点从天冬酰胺突变为其他19种氨基酸时，除N246E、N246P、N246F、N246R、N246M、N246Y、N246H、N246K、N246W无活力外，其余突变体羧酸含量和酶活见表5。由此选择优势突变体N246V，其在提高羧酸含量同时，降低水合活力，提升水解活力。同时，选择第200位的优势突变体为K200R，第224位的优势突变体为R224W。
最终，筛选获得含腈水解酶突变体C145N、K200R、R224W、A229P、N246V的质粒，并采用步骤3方法制备相应的湿菌体。
表3野生型OsNIT与145位点突变体反应专一性及活力比较
表4野生型OsNIT与229位点突变体反应专一性及活力比较
表5野生型OsNIT与246位点突变体反应专一性及活力比较
实施例2腈水解酶突变体C145N、K200R/R224W、A229P、N246V反应专一性和活力测定
以实施例1获得的K200R突变体的质粒为模板，采用R224W定点突变引物(表1Lys200-For、Lys200-Rev)进行全质粒PCR扩增，PCR体系和反应条件同步骤1，采用实施例1方法构建突变体K200R/R224W(氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示)质粒，并按实施例1方法制备湿菌体。
反应体系(20mL)组成为：20mL Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，采用实施例1方法制备的腈水解酶突变体湿菌体0.1g，甲醇0.9mL、苯乙腈100mM(苯乙腈先溶于甲醇)。反应液于30℃，180rpm反应30min。取样1mL，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。经实施例1所述高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度和比例，并计算酶活，结果见表6。
表6野生型OsNIT与突变体C145N、K200R/R224W、A229P、N246V反应专一性和活力比较
如表6所示，突变体C145N产物中羧酸的含量达到96.5％，水解活力为亲本的39.3％，水合活力为亲本的1.4％。突变体K200R/R224W羧酸比例为95.1％，但水合活力仅降至22.74％。突变体A229P羧酸比例提升至71.53，并且水解活力为亲本的145.3％。突变体N246V羧酸比例提升至80.17％，其水解活力保留的同时降低水合活力。
实施例3腈水解酶多重突变体K200R/R224W/A229P的构建。
对实施例1单点突变结果进行分析，发现第200位、第224位、第229位点突变可以改变反应专一性使其趋于生成羧酸，水解活力有较好的保留或有提高，水合活力被抑制，叠加突变得到突变体K200R/R224W/A229P，具体为：
以实施例2构建的K200R/R224W突变体质粒为模板，采用229位点引物(表1Ala229-For、Ala229-Rev)进行全质粒PCR扩增，PCR体系和反应条件同步骤1，采用实施例1方法构建含腈水解酶突变体K200R/R224W/A229P的质粒。
按实施例1方法培养获得能进行羧酸比例和活力测定的湿菌体细胞。
实施例4腈水解酶多重突变体K200R/R224W/N246V的构建。
对实施例1单点突变结果进行分析，发现第200、第224、第246位点突变可以改变反应专一性使其趋于生成羧酸，水解活力有较好的保留或有提高，水合活力被抑制，叠加突变得到突变体K200R/R224W/N246V，具体为：
以实施例2构建的K200R/R224W突变体质粒为模板，采用246位点引物(表1Asn246-For、Asn246-Rev)进行全质粒PCR，PCR体系和反应条件同步骤1，采用实施例1方法构建含腈水解酶突变体K200R/R224W/N246V的质粒。
按实施例1方法培养获得能进行羧酸比例和活力测定的湿菌体细胞。
实施例5腈水解酶突变体K200R/R224W/A229P反应专一性和活力测定
反应体系组成为：20mLTris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，采用实施例3方法制备的腈水解酶突变体K200R/R224W/A229P湿菌体0.1g，甲醇0.9mL、苯乙腈100mM(溶于甲醇)。反应液于30℃，180rpm反应30min。取样1mL，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。经实施例1所述高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度和比例，并计算酶活。
如表7所示，突变体K200R/R224W/A229P催化产生的苯乙酸含量为96.3％，水解活力为亲本的280.9％，水合活力为亲本的3.6％。
表7野生型OsNIT与突变体K200R/R224W/A229P反应专一性和活力比较
实施例6腈水解酶突变体K200R/R224W/N246V反应专一性和活力测定
反应体系组成为：20mLTris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，采用实施例4方法制备的腈水解酶突变体K200R/R224W/N246V湿菌体0.1g，甲醇0.9mL、苯乙腈100mM(溶于甲醇)。反应液于30℃，180rpm反应30min。取样1mL，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。经高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度和比例，并计算酶活。
如表8所示，突变体K200R/R224W/N246V催化苯乙腈产生的苯乙酸含量为98.8％，水解活力为亲本的124.2％，水合活力为亲本的1.7％。
表8野生型OsNIT与突变体K200R/R224W/N246V反应专一性和活力比较
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 370
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val
100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Arg
210 215 220
Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr Leu Glu His His His His
355 360 365
His His
370
<210> 2
<211> 1113
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atggctatgg ttccgtctgg ttctggtggt ggtccgccgg ttatcgctga agttgaaatg 60
aacggtggtg ctacctctgg tgctgctacc gttcgtgcta ccgttgttca ggcttctacc 120
gttttctacg acaccccggc taccctggac aaagctgaac gtctgatcga agaagctgct 180
ggttacggtt ctcagctggt tgttttcccg gaagctttcg ttggtggtta cccgcgtggt 240
tctaccttcg gtttcggtgc taacatctct atcggtaacc cgaaagacaa aggtaaagaa 300
gaattccgta aataccacgc tgctgctatc gaagttccgg gtccggaagt tacccgtctg 360
gctgctatgg ctggtaaata caaagttttc ctggttatgg gtgttatcga acgtgaaggt 420
tacaccctgt actgctctgt tctgttcttc gacccgctgg gtcgttacct gggtaaacac 480
cgtaaactga tgccgaccgc tctggaacgt atcatctggg gtttcggtga cggttcgact 540
atcccggtgt acgacacgcc gctgggtaaa atcggtgctc tgatctgctg ggaaaacaaa 600
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atcaccgctg acctggacct gggtgaaatc gttcgtgcta aattcgactt cgacgttgtt 960
ggtcactacg ctcgtccgga agttctgtct ctggttgtta acgaccagcc gcacctccca 1020
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ccgtacctcg agcaccacca ccaccaccac tga 1113
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<212> PRT
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<400> 3
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
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