具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发 明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下 所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：

一种酶催化制备茶黄素的方法，如图1所示，所述方法包括：

步骤S1：将鲜茶叶粉碎，并加入石油醚或乙酸乙酯搅拌均匀，获得混合 物。

鲜茶叶用于制备酶，石油醚是一种轻质石油产品，低相对分子质量烃(主 要成分是戊烷及己烷)的混合物，不溶于水。石油醚和乙酸乙酯用于脱除鲜 茶叶中的咖啡因、茶碱蜡质、叶绿素及非挥发性油脂。

步骤S2：将混合物中的石油醚或乙酸乙酯滤除，获得叶粉。

其中叶粉中含有天然固定化的多酚氧化酶酶系。

步骤S3：在所述叶粉中，加入茶多酚制品和水，加入乙酸乙酯或乙酸丁 酯，获得多相态的混合体系。

水相用于溶解茶多酚及儿茶素类物质，然后茶多酚及儿茶素类物质扩散 至乙酸乙酯相中，并在叶粉的酶表面聚合催化为茶黄素类物质，茶黄素类物 质再溶迁至乙酸乙酯相中并恢复酶的活性。同时水在叶粉表面形成水膜，多 酚氧化酶吸附在叶粉木质结构的活性基团上，并在水膜内充分展开。湿润的 叶粉在乙酸乙酯或乙酸丁酯相中处于充分分散状态，获得尽量大的比表面积； 茶黄素溶解在乙酸乙酯中即使在低浓度状态下也比较稳定，1.5％浓度的茶黄 素乙酸乙酯溶液室温避光放置24小时降解不超过2％，可以满足生产过程中各 工序对操作时间的要求。

乙酸丁酯在国标GB2760中允许使用的食用香料，广泛用于杏、香蕉、菠 萝、梨等香精的配制，毒性很低；乙酸丁酯的沸点较高，沸点126.5℃，在通 氧的有氧发酵时损耗很小，远较乙酸乙酯损耗低，可以有效降低成本，且乙 酸丁酯与石油醚沸点差异更大，易于分馏混合溶剂。

步骤S4：将所述混合体系进行有氧发酵。可以向混合物体系吹入氧气， 室温或0-20℃低温条件下，搅拌酶促氧化发酵。

步骤S5：取发酵液，并进行干燥，获得茶黄素固形物。茶黄素固形物呈 棕红色。

在鲜茶叶粉中加入石油醚或乙酸乙酯脱除鲜茶叶中的咖啡因、茶碱蜡质、 叶绿素及非挥发性油脂，以制备含有多酚氧化酶酶系的叶粉，以叶粉为固定 化酶催化剂，在水相、乙酸乙酯或乙酸丁酯的混合相中催化茶多酚发酵聚合， 制备茶黄素；叶粉在制备过程中，保留了天然固化多酚氧化酶酶系，对酶活 性的影响小，使发酵产物中茶黄素类物质的组成与天然红茶中的组成相近。 且发酵后处理简单，直接分离发酵液，浓缩过滤干燥即可；产品中不含有水 溶性的酶，使产品中的茶黄素活性及含量高。

其中，茶黄素的结构如图2所示，茶黄素组分包括茶黄素(TF)、茶黄素 单酯(TF-3-G或TF-3'-G)、茶黄素双酯(TFDG)，茶黄素的原始反应物如下 表所示：

其中，EGC为表没食子儿茶素，EGCG为表没食子儿茶素没食子酸酯，EC 为表儿茶素，ECG为表儿茶素没食子酸酯，gallate为没食子酸基，H为氢。

步骤S1中，石油醚与鲜茶叶的比为：2-30L：1kg，搅拌时间为30-90 分钟。

步骤S3中，茶多酚制品、乙酸乙酯、水和鲜茶叶的比例为：0.1-1kg： 2-20L：0-1.5L：1kg。

步骤S5中，取发酵液，并进行干燥的方法包括：

步骤S101：通过过滤的方法处理经有氧发酵的混合液，获得发酵液和叶 渣。

步骤S102：用乙酸乙酯洗涤所述叶渣，并过滤获得滤洗液。

步骤S103：将滤洗液与发酵液合并后，减压干燥。

通过将叶渣洗涤，并过滤取得滤洗液，以提高茶黄素的回收效率。

本发明的方法还可以包括重复利用叶粉的方法：将洗涤后的叶渣作为叶 粉重复使用2-4次。

本发明的方法还可以包括提取副产物的方法：

取叶渣，与50℃-70℃水混和，分离后获得提取液；将提取液干燥后，获 得红茶提取物。

通过热水提取叶渣中含有的物质，提取副产物红茶提取物，红茶提取物 中富含茶氨酸、咖啡因和茶多糖。

其中，在提取副产物中，还可以对提取液进行纯化：

步骤S111：所述提取液经减压蒸去乙酸乙酯，过滤后过AB-8大孔树脂柱， 收集上柱流出液。

步骤S112：AB-8大孔树脂柱经水洗后，20％浓度乙醇水溶液洗脱，分别 收集经过AB-8大孔树脂柱的水洗液和洗脱液。

步骤S114：所述上柱流出液干燥后得到副产物茶多糖，水洗液干燥后得 到副产物咖啡因，所述洗脱液干燥后得到副产物茶氨酸。

其中，本发明的方法还包括茶黄素固形物纯化的方法：

步骤S6：茶黄素粉末用3％-10％乙醇水溶液溶解后，过滤，滤出液经真空 干燥，获得茶黄素成品。

在一个具体实施例中，制备的茶黄素成品中茶黄素的含量大于40％，为粉 状成品。

茶多酚制品作为茶黄素发酵的主要底物，可以从市场上购买，也可以从 绿茶中分离得到，如绿茶经水提取获得。如图6所示，本发明还包括同步提 取茶多酚制品的方法：

步骤S11：将鲜茶叶萎凋后粉碎，加入绿茶末，并加入石油醚和水，室温 下搅拌60分钟，获得混合物，其中，鲜茶叶和绿茶末的重量比为0.8-1.2：1， 石油醚、水和绿茶末的重量比为4-10：0.8-1.2：1。

绿茶末中含有丰富的茶多酚，与鲜茶叶粉同步加入石油醚和水，用于去 除鲜茶叶粉和绿茶末中的咖啡因、茶碱蜡质、叶绿素及非挥发性油脂。

步骤S12：混合物滤除石油醚后，再次加入石油醚，室温搅拌60分钟后 滤除石油醚，获得叶粉混合物；其中，石油醚和绿茶末的重量比为4-10:1。 再次加入石油醚，进一步去除咖啡因、茶碱蜡质、叶绿素及非挥发性油脂。

步骤S13：在所述叶粉混合物中，加入乙酸乙酯或乙酸丁酯，获得混合体 系；其中，乙酸乙酯与绿茶末的重量比为4-10:1。

混合体系进入步骤S4进行有氧发酵。

实施例1

制备叶粉：将新鲜采摘的鲜茶叶100公斤(江苏无锡马山8月份采摘)， 经凋萎后绞切粉碎，放入底置筛板和侧滤出口的控温不锈钢提取釜中，加入 800升的石油醚，室温条件下搅拌60分钟，滤除深绿色石油醚溶液并回收石 油醚。

有氧发酵：向提取釜中继续加入700升乙酸乙酯、20公斤茶多酚含量35％ 的绿茶水提取物和15升水，室温或0℃-20℃下吹入氧气并搅拌发酵。并用紫 外分光光度计检测发酵液在380纳米处的吸光度变化，待发酵液的A380吸光 度达到峰值并开始走平时停止发酵，过滤获得叶渣和橙红色的发酵液。

茶黄素固形物制备：叶渣中以1000升乙酸乙酯均分为两次搅拌洗涤，过 滤并收集橙红色洗涤液。合并发酵液及洗涤液，减压浓缩至干，得到棕红色 的茶黄素固形物。

茶黄素纯化：向固形物中加入5％乙醇水溶液60公斤并搅拌以充分溶解固 形物，溶液抽滤或压滤或离心过滤，滤液浓缩至25％-50％含固率后，用连续真 空带式干燥机干燥，得橙红色粉末6.9公斤，经高效液相色谱(HPLC)检测 茶黄素含量45.2％，如图3所示。

叶渣重复利用：乙酸乙酯洗涤后的叶渣可再次使用，加入600升乙酸丁 酯，20公斤茶多酚含量35％的绿茶水提物和15升水，室温或低温条件下吹入 氧气并搅拌发酵，并用紫外分光光度计检测发酵液在380纳米处的吸光度变 化，待发酵液的A380吸光度达到峰值并开始走平时停止发酵，过滤获得叶渣 和橙红色发酵液。叶渣中以1000升乙酸丁酯均分为两次搅拌洗涤，过滤并收 集橙红色洗涤液。合并发酵液及洗涤液，减压浓缩至干得棕红色的茶黄素固 形物。向茶黄素固形物中加入5％乙醇水溶液60公斤并搅拌以充分溶解，抽滤 或压滤或离心过滤，滤液浓缩至25％-50％含固率后，用连续真空带式干燥机干 燥，得橙红色粉末6.8公斤，高效液相色谱HPLC检测茶黄素含量43.7％。

副产物提取：向叶渣中加入800升70℃热水，搅拌提取30分钟，分离获 得提取液，提取液经减压蒸去乙酸乙酯或乙酸丁酯，过滤后上AB-8大孔树脂 柱，收集上柱流出液，滤液上柱完毕后，5倍柱体积的水洗，3倍柱体积的20％ 乙醇洗脱，分别收集经过AB-8大孔树脂柱的水洗液和洗脱液。流出液浓缩干 燥得到副产物茶多糖，水洗液浓缩干燥副产物咖啡因，洗脱液浓缩后静置结 晶、过滤、干燥得到副产物茶氨酸。

对比例1

制备鲜茶叶粉：将新鲜采摘的鲜茶叶100公斤(江苏无锡马山8月份采 摘)，经凋萎后绞切粉碎，放入底置筛板和侧滤出口的不锈钢提取釜中。

有氧发酵：向提取釜中加入600升乙酸乙酯、20公斤茶多酚含量35％的 绿茶水提物和15公斤水，室温或低温条件下吹入氧气并搅拌发酵，并用紫外 分光光度计检测发酵液在380纳米处的吸光度变化，待发酵液的A380吸光度 达到峰值并开始走平时停止发酵，过滤并收集墨绿色发酵液。

茶黄素固形物制备：叶渣中以1000升乙酸乙酯均分为两次搅拌洗涤，过 滤并收集绿色洗涤液。合并发酵液及洗涤液，减压浓缩至干得墨绿色的茶黄 素固形物。

茶黄素纯化：向茶黄素固形物中加入5％乙醇水溶液80公斤并搅拌以充分 溶解固形物，得到含有大量悬浮胶状叶绿素的黄绿色浑浊溶液，沉降式离心 并收集上清液，上清液浓缩至25％-50％含固率后，用连续真空带式干燥机干燥 或喷雾干燥，得橙红色粉末3.1公斤，高效液相色谱HPLC检测茶黄素含量36.7％，HPLC检测图如图4所示。

实施例2

制备叶粉：将新鲜采摘的鲜茶叶100公斤(江苏无锡马山8月份采摘)， 经凋萎后绞切粉碎，放入底置筛板和侧滤出口的不锈钢提取釜中，加入800 升的石油醚，室温条件下搅拌60分钟，滤除深绿色石油醚溶液并回收石油醚。

有氧发酵：向提取釜中继续加入600升乙酸乙酯、10公斤含85％茶多酚 的低咖啡因绿茶提取物(咖啡因含量小于1％)和8升水，室温或低温条件下 吹入氧气并搅拌发酵，并用紫外分光光度计检测发酵液在380纳米处的吸光 度变化，待发酵液的A380吸光度达到峰值并开始走平时停止发酵，过滤并收 集橙红色发酵液。

茶黄素固形物制备：叶渣中以800升乙酸乙酯均分为两次搅拌洗涤，过 滤并收集橙红色洗涤液。合并发酵液及洗涤液，减压浓缩至干得棕红色茶黄 素固形物。

茶黄素纯化：向固形物中加入5％乙醇水溶液100升并搅拌以充分溶解固 形物，抽滤或压滤或离心过滤，滤液浓缩至25％-50％含固率后，用连续真空带 式干燥机干燥或喷雾干燥，得橙红色粉末10.2公斤，高效液相色谱HPLC检 测茶黄素含量51.6％，HPLC检测图如图5所示。

叶渣重复利用：乙酸乙酯洗涤后的叶渣可再次使用，加入600升乙酸乙 酯，10公斤茶多酚含量85％的低咖啡因绿茶提取物(咖啡因含量小于1％)和 6升水，室温或低温条件下吹入氧气并搅拌发酵，并用紫外分光光度计检测发 酵液在380纳米处的吸光度变化，待发酵液的A380吸光度达到峰值并开始走 平时停止发酵，过滤并收集橙红色发酵液。叶渣中以800升乙酸乙酯均分为 两次搅拌洗涤，过滤并收集橙红色洗涤液。合并发酵液及洗涤液，减压浓缩 至干得棕红色茶黄素固形物。向固形物中加入5％乙醇水溶液100升并搅拌以 充分溶解固形物，抽滤或压滤或离心过滤，滤液浓缩至25％～50％含固率后，用 连续真空带式干燥机干燥或喷雾干燥，得橙红色粉末9.2公斤，高效液相色 谱HPLC检测茶黄素含量48.5％。

乙酸乙酯洗涤后的叶渣可再次使用，加入600升乙酸乙酯，9公斤茶多酚 含量85％的低咖啡因绿茶提取物(咖啡因含量小于1％)和5升水，室温或低 温条件下吹入氧气并搅拌发酵，并用紫外分光光度计检测发酵液在380纳米 处的吸光度变化，待发酵液的A380吸光度达到峰值并开始走平时停止发酵， 过滤并收集橙红色发酵液。叶渣中以900升乙酸乙酯均分为两次搅拌洗涤， 过滤并收集橙红色洗涤液。合并发酵液及洗涤液，减压浓缩至干得棕红色固 形物。向固形物中加入5％乙醇水溶液90升并搅拌以充分溶解固形物，抽滤或压滤或离心过滤，滤液浓缩至25％-50％含固率后，用连续真空带式干燥机干燥 或喷雾干燥，得橙红色粉末8.7公斤，高效液相色谱HPLC检测茶黄素含量 47.3％。

副产物提取：向叶渣中加入800升70℃热水，搅拌提取30分钟，分离获 得提取液，提取液经减压蒸去乙酸乙酯，过滤后上AB-8大孔树脂柱，收集上 柱流出液，滤液上柱完毕后，5倍柱体积的水洗，3倍柱体积的20％乙醇洗脱， 分别收集经过AB-8大孔树脂柱的水洗液和洗脱液。上柱流出液浓缩干燥即为 茶多糖，水洗液浓缩干燥富含咖啡因，洗脱液浓缩后静置结晶、过滤、干燥 得到茶氨酸。

对比例2

制备鲜茶叶粉：将新鲜采摘的鲜茶叶100公斤(江苏无锡马山8月份采 摘)，经凋萎后绞切粉碎，放入底置筛板和侧滤出口的不锈钢提取釜中。

有氧发酵：向提取釜中继续加入600升乙酸乙酯、10公斤茶多酚含量85％ 的低咖啡因绿茶提取物(咖啡因含量小于1％)和8公斤水，室温或低温条件 下吹入氧气并搅拌发酵，并用紫外分光光度计检测发酵液在380纳米处的吸 光度变化，待发酵液的A380吸光度达到峰值并开始走平时停止发酵，过滤并 收集墨绿色发酵液。

茶黄素固形物制备：叶渣中以800升乙酸乙酯均分为两次搅拌洗涤，过 滤并收集绿色洗涤液。合并发酵液及洗涤液，减压浓缩至干得墨绿色茶黄素 固形物。

茶黄素纯化：向固形物中加入5％乙醇水溶液100公斤并搅拌以充分溶解 固形物，得到含有大量悬浮胶状叶绿素的黄绿色浑浊溶液，沉降式离心，上 清液浓缩至25％-50％含固率后，用连续真空带式干燥机干燥或喷雾干燥，得橙 红色粉末4.8公斤，高效液相色谱HPLC检测茶黄素含量40.1％。

实施例3

制备叶粉：将新鲜采摘的鲜茶叶100公斤(江苏无锡马山8月份采摘)， 经凋萎后绞切粉碎，放入底置筛板和侧滤出口的不锈钢提取釜中，再加入100 公斤提取茶多酚的原料绿茶末，加入800公斤石油醚和100公斤水，室温条 件下搅拌60分钟，滤除深绿色石油醚溶液并回收石油醚。向提取釜中再加入 800升石油醚，室温条件下搅拌60分钟，滤除浅绿色石油醚溶液并回收石油 醚。

有氧发酵：向提取釜中继续加入800公斤乙酸乙酯，室温或0℃-20℃低 温条件下吹入氧气并搅拌发酵，并用紫外分光光度计检测发酵液在380纳米 处的吸光度变化，待发酵液的A380吸光度达到峰值并开始走平时停止发酵。

茶黄素固形物制备：过滤并收集橙红色发酵液，叶渣中以1500公斤乙酸 乙酯均分为两次搅拌洗涤，过滤并收集橙红色洗涤液，合并发酵液及洗涤液， 减压浓缩至干得棕红色茶黄素固形物。

茶黄素纯化：向固形物中加入5％乙醇水溶液100公斤并搅拌以充分溶解 固形物，抽滤或压滤或离心过滤，滤液浓缩至25％～50％含固率后，用连续真空 带式干燥机组干燥，得橙红色粉末10.2公斤，高效液相色谱HPLC检测茶黄 素含量45.1％。

副产物提取：向叶渣中加入800升70℃热水，搅拌提取30分钟，分离获 得提取液，提取液经减压蒸去乙酸乙酯，过滤后上AB-8大孔树脂柱，收集上 柱流出液，滤液上柱完毕后，5倍柱体积的水洗，3倍柱体积的20％乙醇洗脱， 分别收集经过AB-8大孔树脂柱的水洗液和洗脱液。上柱流出液浓缩干燥即为 茶多糖，水洗液浓缩干燥富含咖啡因，洗脱液浓缩后静置结晶、过滤、干燥 得到茶氨酸。

如上表所示，实施例1-3与对比例1和2相比，发酵产量明显提高，茶 黄素含量明显提高；实施例2与实施例1相比，发酵产量明显提高，茶黄素 含量明显提高。

其中，在检测中，采用以下高效液相色谱仪：日本岛津公司Shimadzu LC-10ATVP系统控制器，LC-10ATVP二元泵，SPD-M20A二极管阵列检测器， Shimadzu LC-Solution色谱工作站；色谱分析参数：色谱柱为Hypersil BDS (C18,5u,4.6x250mm)，流动相A为2％乙酸，流动相B为乙腈-乙酸乙酯(体 积比21:3)，梯度洗脱，流动相B再30分钟内从18％线性梯度变化到30％，流 速0.9ml/min，柱温40℃，检测波长280nm，进样量10微升。

如图7-10所示，为茶黄素组分标准品的HPLC出峰图，分别为TF标准品、 TF-3-G标准品、TF-3'-G标准品和TFDG标准品的HPLC出峰图。如图3-5所 示，儿茶素类物质在色谱开始阶段以宽的和未分辨的峰的形式被洗脱，而茶 黄素类物质则在15-30分钟内被洗脱。本发明通过茶黄素标准品构建标准校 正曲线，以校正曲线为参考，获取茶黄素的峰，并计算峰面积，根据峰面积 计算茶黄素的含量，从图3-图5可以看出，实施例1和实施例2中制备的产 品茶黄素组成成分与天然发酵的对比例1相近。

本发明还提供由上述方法制得的产品，包括茶黄素和副产物。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域 的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。