具体实施方式

发明人令人惊讶地发现了由不同Wzz蛋白（例如，WzzB）的人工改造产生的大肠杆菌抗原，包括其免疫原性缀合物及使用方法的令人惊讶的发现。发明人进一步令人惊讶地发现了含有如例如通过在本文中称为(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基的二价、异双功能接头共价缀合到载体蛋白的这种糖的复合糖。本发明人还令人惊讶地发现了含有如例如通过还原性胺化（RAC）与载体蛋白缀合的糖的复合糖。特别地，在非质子溶剂中，优选在DMSO（RAC/DMSO）或水溶液中的RAC。本发明进一步涉及包含这种复合糖的免疫原性组合物，以及用于使用这种复合糖和免疫原性组合物的方法。另外，发明人令人惊讶地发现，在一些实施方案中，与具有相对短的O-抗原链的复合糖相比，含有具有中间或长O-抗原链的高分子量糖的复合糖可以更具免疫原性。此外，发明人发现，在一些实施方案中，通过在如例如通过包括RAC或单端缀合或eTEC的方法与载体蛋白缀合之前糖的多端活化产生的复合糖可能比通过在与载体蛋白缀合之前糖的单端活化产生的复合糖更具有免疫原性。

在一个实施方案中，通过表达（不必定超表达）不同的Wzz蛋白（例如，WzzB）来生产糖，以控制糖的大小。

如本文所用的，术语“糖”是指单个糖部分或单糖单元以及共价连接以形成二糖、寡糖和多糖的两个或更多个单个糖部分或单糖单元的组合。糖可以是直链或支链的。

在一个实施方案中，糖在重组革兰氏阴性细菌中产生。在一个实施方案中，糖在重组大肠杆菌细胞中产生。在一个实施方案中，糖在重组沙门氏菌属细胞中产生。示例性细菌包括大肠杆菌O25K5H1、大肠杆菌BD559、大肠杆菌GAR2831、大肠杆菌GAR865、大肠杆菌GAR868、大肠杆菌GAR869、大肠杆菌GAR872、大肠杆菌GAR878、大肠杆菌GAR896、大肠杆菌GAR1902、大肠杆菌O25a ETC NR-5、大肠杆菌O157:H7:K-、肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型（Salmonella enterica serovar Typhimurium）菌株LT2、大肠杆菌GAR2401、肠沙门氏菌肠炎血清型（Salmonella enterica serotype Enteritidis）CVD 1943、肠沙门氏菌鼠伤寒血清型（Salmonella enterica serotype Typhimurium）CVD 1925、肠沙门氏菌副伤寒血清型A（Salmonella enterica serotype Paratyphi A）CVD 1902和弗氏志贺氏菌（Shigella flexneri）CVD 1208S。在一个实施方案中，细菌不是大肠杆菌GAR2401。所述对于糖产生的遗传方法允许有效产生作为疫苗组分的O-多糖和O-抗原分子。

如本文所用的，术语“wzz蛋白”是指链长决定簇多肽，如例如，wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzzl和wzz2。示例性wzz基因序列的GenBank检索号为对于E4991/76的AF011910、对于F186的AF011911、对于M70/1-1的AF011912、对于79/311的AF011913、对于Bi7509- 41的AF011914、对于C664-1992的AF011915、对于C258-94的AF011916、对于C722-89的AF011917和对于EDL933的AF011919。G7和Bi316-41 wzz基因序列的GenBank检索号分别为U39305和U39306。示例性wzz基因序列的进一步的GenBank检索号是对于肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清变型菌株（Salmonella enterica subsp. enterica serovarTyphimurium str.）LT2 FepE的NP_459581；对于大肠杆菌O157:H7菌株EDL933 FepE的AIG66859；对于肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清变型菌株LT2 WzzB的NP_461024。对于大肠杆菌K-12亚株（substr.）MG1655 WzzB的NP_416531、对于大肠杆菌K-12亚株MG1655 FepE的NP_415119。在优选的实施方案中，wzz家族蛋白是wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2中的任何一种，最优选wzzB，更优选fepE。

示例性的wzzB序列包括：

>沙门氏菌属LT2 WzzB

示例性的FepE序列包括：

>沙门氏菌属LT2 FepE

在一些实施方案中，修饰的糖（与相应的野生型糖相比修饰的）可以通过在革兰氏阴性细菌中表达（不必定超表达）来自革兰氏阴性细菌的wzz家族蛋白（例如，fepE）和/或关掉（即，阻抑、缺失、去除）第二个wzz基因（例如，wzzB）来产生，以产生含有中间或长O-抗原链的高分子量的糖，例如脂多糖。例如，修饰的糖可以通过表达（不必定超表达）wzz2并关掉wzzl来产生。或者，备择地，修饰的糖可通过表达（不必定超表达）wzzfepE并关掉wzzB来产生。在另一个实施方案中，修饰的糖可以通过表达（不必定超表达）wzzB并关掉wzzfepE来产生。在另一个实施方案中，修饰的糖可以通过表达fepE来产生。优选地，wzz家族蛋白衍生自与宿主细胞异源的菌株。

在一些实施方案中，通过表达wzz家族蛋白来产生糖，所述wzz家族蛋白具有与SEQID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的任一种具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，wzz家族蛋白包括选自SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ IDNO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的任一种的序列。优选地，wzz家族蛋白与SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性。在一些实施方案中，通过表达蛋白来产生糖，所述蛋白具有与fepE蛋白具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明涉及通过在革兰氏阴性细菌中表达wzz家族蛋白，优选fepE，以产生含有中间或长O-抗原链的高分子量糖而产生的糖，其与相应的野生型O-多糖相比，具有至少1、2、3、4或5个重复单元的增加。在一个方面，本发明涉及由表达（不必定超表达）来自革兰氏阴性细菌的wzz家族蛋白（例如，wzzB）以产生含有中间或长O-抗原链的高分子量糖的培养物中的革兰氏阴性细菌产生的糖，其与相应的野生型O-抗原相比，具有至少1、2、3、4或5个重复单元的增加。对于与相应的野生型糖相比具有增加的重复单元数目的另外的示例性糖，参见以下O-多糖和O-抗原的描述。期望的链长是在给定疫苗构建体的背景中产生改善的或最大的免疫原性的链长。

在另一个实施方案中，糖包含选自表1的任何一个式，其中糖中的重复单元的数目n比相应的野生型O-多糖中的重复单元的数目大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个重复单元。优选地，糖包括与相应的野生型O-多糖相比至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元的增加。参见，例如，表21。确定糖长度的方法是本领域已知的。如实施例5中所述的，这种方法包括核磁共振、质谱法和尺寸排阻层析。

在优选的实施方案中，本发明涉及在重组大肠杆菌宿主细胞中产生的糖，其中内源性wzz O-抗原长度调节物的基因（例如，wzzB）被缺失并被来自与重组大肠杆菌宿主细胞异源的革兰氏阴性细菌的（第二）wzz基因（例如，沙门氏菌属fepE）置换，以产生含有中间或长O-抗原链的高分子量的糖，例如脂多糖。在一些实施方案中，重组大肠杆菌宿主细胞包含来自沙门氏菌属，优选来自肠沙门氏菌的wzz基因。

在一个实施方案中，宿主细胞包含作为稳定维持的质粒载体的wzz家族蛋白的异源基因。在另一个实施方案中，宿主细胞包含作为在宿主细胞的染色体DNA中整合的基因的wzz家族蛋白的异源基因。在大肠杆菌宿主细胞中稳定表达质粒载体的方法和将异源基因整合到大肠杆菌宿主细胞的染色体中的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，宿主细胞包含作为稳定维持的质粒载体的O-抗原的异源基因。在另一个实施方案中，宿主细胞包含作为在宿主细胞的染色体DNA中整合的基因的O-抗原的异源基因。在大肠杆菌宿主细胞和沙门氏菌属宿主细胞中稳定表达质粒载体的方法是本领域已知的。将异源基因整合到大肠杆菌宿主细胞和沙门氏菌属宿主细胞的染色体中的方法是本领域已知的。

在一个方面，重组宿主细胞在包含碳源的培养基中培养。用于培养大肠杆菌的碳源是本领域已知的。示例性碳源包括糖醇、多元醇、醛醇糖或酮糖，包括但不限于阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露糖醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨糖醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸、琥珀酸和甲胺。在优选的实施方案中，培养基包含葡萄糖。在一些实施方案中，培养基包含多元醇或醛醇糖，例如甘露糖醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨糖醇、乳糖和阿拉伯糖作为碳源。可以在开始培养之前将所有碳源添加到培养基中，或者可以在培养期间逐步或连续添加所有碳源。

用于重组宿主细胞的示例性培养基包含选自KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O的任一种的元素。优选地，培养基包含KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

本文使用的培养基可以是固体或液体，合成的（即人造的）或天然的，并且可以包含足够的营养物以用于重组宿主细胞的培养。优选地，培养基是液体培养基。

在一些实施方案中，培养基可以进一步包含合适的无机盐。在一些实施方案中，培养基可以进一步包含痕量营养物。在一些实施方案中，培养基可以进一步包含生长因子。在一些实施方案中，培养基可以进一步包含额外的碳源。在一些实施方案中，培养基可以进一步包含合适的无机盐、痕量营养物、生长因子和补加碳源。适合于培养大肠杆菌的无机盐、痕量营养物、生长因子和补加碳源是本领域已知的。

在一些实施方案中，培养基适当时可以包含额外的组分，例如蛋白胨、N-Z胺、酶促大豆水解产物（hydrosylate）、额外的酵母提取物、麦芽提取物、补加碳源和各种维生素。在一些实施方案中，培养基不包含这种额外的组分，例如蛋白胨、N-Z胺、酶促大豆水解产物、额外的酵母提取物、麦芽提取物、补加碳源和各种维生素。

合适的补加碳源的举例说明性实例包括，但不限于其他碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、甘露糖醇、淀粉或淀粉水解产物、纤维素水解产物和糖蜜；有机酸，例如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸和延胡索酸；和醇，例如甘油、肌醇、甘露糖醇和山梨糖醇。

在一些实施方案中，培养基进一步包含氮源。适合于培养大肠杆菌的氮源是本领域已知的。合适的氮源的举例说明性实例包括，但不限于氨，包括氨气和氨水；无机或有机酸的铵盐，例如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和乙酸铵；尿素；硝酸盐或亚硝酸盐，以及其他含氮材料，包括作为纯或粗制剂的氨基酸、肉膏、蛋白胨、鱼粉、鱼水解产物、玉米浆、酪蛋白水解产物、豆饼水解产物、酵母提取物、干酵母、乙醇-酵母馏出物、大豆粉、棉籽粉等。

在一些实施方案中，培养基包含无机盐。合适的无机盐的举例说明性实例包括，但不限于钾、钙、钠、镁、锰、铁、钴、锌、铜、钼、钨及其他痕量元素和磷酸的盐。

在一些实施方案中，培养基包含适当的生长因子。适当的痕量营养物、生长因子等的举例说明性实例包括，但不限于辅酶A、泛酸、盐酸吡哆醇、生物素、硫胺素、核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、DL-6,8-硫辛酸、叶酸、维生素B₁₂、其他维生素、氨基酸（例如半胱氨酸和羟脯氨酸）、碱基（例如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶）、硫代硫酸钠、对-或r-氨基苯甲酸、烟酰胺、氮川乙酸盐等，作为纯的或部分纯化的化合物，或存在于天然材料中。量可以由本领域技术人员根据本领域已知的方法和技术根据经验确定。

在另一个实施方案中，本文所述的修饰的糖（与相应的野生型糖相比）是合成产生的，例如，在体外。糖的合成生产或合成可以促进避免成本和时间密集型的生产过程。在一个实施方案中，糖是从适当保护的单糖中间体合成性地合成的，如例如通过使用顺序糖基化策略或顺序糖基化与[3+2]嵌段合成策略的组合。例如，硫糖苷（thioglycosides）和糖基三氯乙酰亚胺酯（glycosyl trichloroacetimidate）衍生物可以用作糖基化中的糖基供体。在一个实施方案中，在体外合成性地合成的糖具有与通过重组方法（例如通过操纵上述wzz家族蛋白）产生的糖相同的结构。

产生的糖（通过重组或合成方法）包含衍生自任何大肠杆菌血清型的结构，包括，例如，下述大肠杆菌血清型的任一种：O1（例如，O1A、O1B和O1C）、O2、O3、O4（例如，O4:K52和O4:K6）、O5（例如，O5ab和O5ac（菌株180/C3））、O6（例如，O6:K2；K13；K15和O6:K54）、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18（例如，O18A、O18ac、O18A1、O18B和O18B1）、O19、O20、O21、O22、O23（例如，O23A）、O24、O25（例如，O25a和O25b）、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45（例如，O45和O45rel）、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D₁、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73（例如，O73（菌株73-1））、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186和O187。

一般通过本领域已知的方法，如例如，透析、浓缩操作、渗滤操作、切向流过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超滤、深度过滤和/或柱层析（离子交换层析、多元离子交换层析、DEAE和疏水作用层析），纯化各多糖（相对于多糖-蛋白缀合物的量富集的）。优选地，通过包括切向流过滤的方法纯化多糖。

纯化的多糖可以被活化（例如，化学活化）以使其能够反应（例如，直接与载体蛋白或通过接头例如eTEC间隔基），且然后并入本发明的复合糖中，如本文进一步所述的。

在一个优选的实施方案中，本发明的糖衍生自大肠杆菌血清型，其中所述血清型是O25a。在另一个优选的实施方案中，血清型是O25b。在另一个优选的实施方案中，血清型是O1A。在另一个优选的实施方案中，血清型是O2。在另一个优选的实施方案中，血清型是O6。在另一个优选的实施方案中，血清型是O17。在另一个优选的实施方案中，血清型是O15。在另一个优选的实施方案中，血清型是O18A。在另一个优选的实施方案中，血清型是O75。在另一个优选的实施方案中，血清型是O4。在另一个优选的实施方案中，血清型是O16。在另一个优选的实施方案中，血清型是O13。在另一个优选的实施方案中，血清型是O7。在另一个优选的实施方案中，血清型是O8。在另一个优选的实施方案中，血清型是O9。

如本文所用的，提及上面列举的任何血清型是指包含本领域已知的重复单元结构（O-单元，如下所述的）并且为相应血清型所特有的血清型。例如，术语“O25a”血清型（在本领域中也称为血清型“O25”）是指包含表1中所示的式O25的血清型。作为另一个例子，术语“O25b”血清型是指包含表1中所示的式O25b的血清型。

如本文所用的，除非另外指定，否则本文一般地提及血清型，从而使得例如，术语式“O18”一般是指包括式O18A、式O18ac、式18A1、式O18B和式O18B1。

如本文所用的，术语“O1”一般是指包括在根据表1的式名称中包括通用术语“O1”的式的种类，例如式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C中的任何一种，其各自示于表1中。因此，“O1血清型”一般是指包含式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C中的任何一种的血清型。

如本文所用的，术语“O6”一般是指在根据表1的式名称中包括通用术语“O6”的式的种类，例如式O6:K2；K13；K15；和O6:K54中的任何一种，其各自示于表1中。因此，“O6血清型”一般是指包含式O6:K2；K13；K15；和O6:K54中的任何一种的血清型。

一般是指在根据表1的式名称中包括通用术语的式的种类的术语的其他实例包括：“O4”、“O5”、“O18”和“O45”。

如本文所用的，术语“O2”是指表1中所示的式O2。术语“O2 O-抗原”是指包含表1中所示的式O2的糖。

如本文所用的，提及来自上面列举的血清型的O-抗原是指包含用相应血清型名称标记的式的糖。例如，术语“O25B O-抗原”是指包含表1中所示的式O25B的糖。

作为另一个例子，术语“O1 O-抗原”一般是指包含式的糖，所述式包括术语“O1”，例如式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C，其各自示于表1中。

作为另一个例子，术语“O6 O-抗原”一般是指包含式的糖，所述式包括术语“O6”，例如式O6:K2；式O6:K13；式O6:K15和式O6:K54，其各自示于表1中。

O-多糖

如本文所用的，术语“O-多糖”是指包含O-抗原的任何结构，只要所述结构不包括全细胞或脂质A。例如，在一个实施方案中，O-多糖包括脂多糖，其中脂质A未结合。去除脂质A的步骤在本领域中是已知的，并且作为例子包括在添加酸的情况下的热处理。示例性方法包括于100℃用1％乙酸处理90分钟。所述方法与分离所去除的脂质A的方法组合。用于分离脂质A的示例性方法包括超速离心。

在一个实施方案中，O-多糖是指由O-抗原组成的结构，在这种情况下，O-多糖与术语O-抗原同义。在一个优选的实施方案中，O-多糖是指在没有核心糖的情况下包含O-抗原的重复单元的结构。因此，在一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌K12核心部分。在另一个优选的实施方案中，O-多糖是指包含O-抗原和核心糖的结构。在另一个实施方案中，O-多糖是指包含O-抗原、核心糖和KDO部分的结构。

从LPS纯化包含核心寡糖的O-多糖的方法是本领域已知的。例如，在纯化LPS之后，可以通过于100摄氏度在1％（v/v）乙酸中加热90分钟继之以于4摄氏度以142,000 x g超速离心5小时来水解纯化的LPS。将含有O-多糖的上清液冷冻干燥并于4摄氏度贮藏。在某些实施方案中，描述了荚膜合成基因的缺失以使得能够简单O-多糖的纯化。

可以通过包括但不限于温和的酸水解以从LPS去除脂质A的方法分离O-多糖。其他实施方案可包括使用肼作为用于O-多糖制备的试剂。LPS的制备可以通过本领域已知的方法完成。

在某些实施方案中，提供了从表达（不必定超表达）Wzz蛋白（例如，wzzB）的野生型、修饰的或减毒的革兰氏阴性细菌菌株中纯化的O-多糖，以供缀合疫苗之用。在优选的实施方案中，从表达（不必定超表达）wzz蛋白的革兰氏阴性细菌菌株中纯化O-多糖链，以用作作为缀合或复合疫苗的疫苗抗原。

在一个实施方案中，O-多糖具有与相应的野生型O-多糖相比增加到约1-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、11-倍、12-倍、13-倍、14-倍、15-倍、16-倍、17-倍、18-倍、19-倍、20-倍、21-倍、22-倍、23-倍、24-倍、25-倍、26-倍、27-倍、28-倍、29-倍、30-倍、31-倍、32-倍、33-倍、34-倍、35-倍、36-倍、37-倍、38-倍、39-倍、40-倍、41-倍、42-倍、43-倍、44-倍、45-倍、46-倍、47-倍、48-倍、49-倍、50-倍、51-倍、52-倍、53-倍、54-倍、55-倍、56-倍、57-倍、58-倍、59-倍、60-倍、61-倍、62-倍、63-倍、64-倍、65-倍、66-倍、67-倍、68-倍、69-倍、70-倍、71-倍、72-倍、73-倍、74-倍、75-倍、76-倍、77-倍、78-倍、79-倍、80-倍、81-倍、82-倍、83-倍、84-倍、85-倍、86-倍、87-倍、88-倍、89-倍、90-倍、91-倍、92-倍、93-倍、94-倍、95-倍、96-倍、97-倍、98-倍、99-倍、100-倍或更多的分子量。在优选的实施方案中，O-多糖具有与相应的野生型O-多糖相比增加到至少1-倍且至多5-倍的分子量。在另一个实施方案中，O-多糖具有与相应的野生型O-多糖相比增加到至少2-倍且至多4-倍的分子量。与相应的野生型O-多糖相比O-多糖的分子量的增加优选与O-抗原重复单元数目的增加有关。在一个实施方案中，O-多糖的分子量的增加是由于wzz家族蛋白。

在一个实施方案中，O-多糖具有与相应的野生型O-多糖相比增加了约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 kDa或更多的分子量。在一个实施方案中，本发明的O-多糖具有与相应的野生型O-多糖相比增加了至少1且至多200kDa的分子量。在一个实施方案中，分子量增加了至少5且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少12且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少15且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少18且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少21且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少22且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少30且至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少1且至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少5且至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少12且至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少15且至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20且至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少1且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少5且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少12且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少15且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少18且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少30且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多90kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少12且至多85kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多70kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多60kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多50kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多49kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多48kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多47kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10且至多46kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20且至多45kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20且至多44kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20且至多43kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20且至多42kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20且至多41kDa。与相应的野生型O-多糖相比O-多糖的分子量的这种增加优选与O-抗原重复单元数目的增加有关。在一个实施方案中，O-多糖的分子量的增加是由于wzz家族蛋白。参见，例如，表21。

在另一个实施方案中，O-多糖包含选自表1的任何一个式，其中O-多糖中的重复单元的数目n比相应的野生型O-多糖中的重复单元的数目大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个重复单元。优选地，糖包括与相应的野生型O-多糖相比至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元的增加。参见，例如，表21。

O-抗原

O-抗原是革兰氏阴性细菌外膜中脂多糖（LPS）的一部分。O-抗原在细胞表面上，且是可变的细胞成分。O-抗原的变异性为革兰氏阴性细菌的血清分型提供了基础。当前的大肠杆菌血清分型方案包括O-多糖1-181。

O-抗原包含寡糖重复单元（O-单元），其野生型结构通常包含来自各式各样糖的2至8个残基。表1中显示了示例性大肠杆菌O-抗原的O-单元，也参见图9A-C和图10A-B。

在一个实施方案中，本发明的糖可以是一个寡糖单元。在一个实施方案中，本发明的糖是相关血清型的一个重复寡糖单元。在这种实施方案中，糖可以包含选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101中的任何一种的结构。

在一个实施方案中，本发明的糖可以是寡糖。寡糖具有小数目的重复单元（一般为5-15个重复单元），且一般是合成地或通过多糖水解得到的。在这种实施方案中，糖可以包含选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101中的任何一种的结构。

优选地，本发明的所有糖和本发明的免疫原性组合物中的所有糖均为多糖。高分子量多糖可能由于存在于抗原性表面上的表位而诱导某些抗体免疫应答。优选预期高分子量多糖的分离和纯化以供本发明的缀合物、组合物和方法之用。

在一些实施方案中，每个个别O-抗原聚合物中的重复O单元的数目（以及因此聚合物链的长度和分子量）取决于wzz链长调节物，一种内膜蛋白。不同的wzz蛋白赋予模式长度的不同范围（4到> 100个重复单元）。术语“模式长度”是指重复O-单元的数目。革兰氏阴性细菌经常具有两种不同的Wzz蛋白，其赋予两种不同的OAg模式链长，一个更长，且一个更短。wzz家族蛋白（例如，wzzB）在革兰氏阴性细菌中的表达（不必定超表达）可能允许操纵O-抗原的长度，以改变或偏重某些长度范围的O-抗原的细菌生产，以及以提高高得率大分子量脂多糖的生产。在一个实施方案中，如本文所用的“短”模式长度是指重复O-单元的小数目，例如1-20。在一个实施方案中，如本文所用的“长”模式长度是指大于20且最多到40的最大值的重复O-单元的数目。在一个实施方案中，如本文所用的“非常长”模式长度是指大于40个重复O-单元。

在一个实施方案中，产生的糖具有与相应的野生型O-多糖相比至少10个重复单元、15个重复单元、20个重复单元、25个重复单元、30个重复单元、35个重复单元、40个重复单元、45个重复单元、50个重复单元、55个重复单元、60个重复单元、65个重复单元、70个重复单元、75个重复单元、80个重复单元、85个重复单元、90个重复单元、95个重复单元或100个重复单元的增加。

在另一个实施方案中，本发明的糖具有与相应的野生型O-多糖相比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个重复单元的增加。优选地，糖包括与相应的野生型O-多糖相比至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元的增加。参见，例如，表21。确定糖长度的方法是本领域已知的。如实施例5中所述的，这种方法包括核磁共振、质谱法和尺寸排阻层析。

确定糖中重复单元的数目的方法也是本领域已知的。例如，重复单元的数目（或式中的“n”）可以通过将多糖的分子量（不含核心糖或KDO残基的分子量）除以重复单元的分子量（即，例如表1中所示的相应式中的结构的分子量，其可以理论上计算为式中每个单糖的分子量之和）来计算。式中每个单糖的分子量是本领域已知的。例如，式O25b的重复单元的分子量为约862 Da。例如，式O1a的重复单元的分子量为约845 Da。例如，式O2的重复单元的分子量为约829 Da。例如，式O6的重复单元的分子量为约893 Da。当确定缀合物中的重复单元的数目时，将载体蛋白分子量和蛋白:多糖比计入计算。如本文所定义的，“n”是指多糖分子中重复单元（在表1中的括号中表示的）的数目。如本领域中已知的，在生物大分子中，重复结构可以点缀有不完美重复的区域，如例如缺少的分支。另外，在本领域中已知从天然来源例如细菌分离和纯化的多糖在大小和分支方面可以是不均匀的。在这种情况下，n可以代表群体中分子的n的平均值或中值。

在一个实施方案中，O-多糖具有与相应的野生型O-多糖相比O-抗原的至少一个重复单元的增加。表1显示了O-抗原的重复单元。在一个实施方案中，O-多糖包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个总重复单元。优选地，糖具有总计至少3个至最多80个重复单元。在另一个实施方案中，O-多糖具有与相应的野生型O-多糖相比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个重复单元的增加。

在一个实施方案中，糖包含O-抗原，其中在任何O-抗原式（如例如，表1中所示的式（也参见图9A-C和图10A-B））中的n是至少1、2、3、4、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40和至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50的整数。可以将任何最小值和任何最大值组合以定义范围。示例性的范围包括，例如，至少1至最多1000；至少10至最多500；和至少20至最多80，优选最多90。在一个优选的实施方案中，n为至少31至最多90。在优选的实施方案中，n为40至90，更优选60至85。

在一个实施方案中，糖包含O-抗原，其中任一O-抗原式中的n为至少1和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少5和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少10和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少25和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少50和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少75和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少100和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少125和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少150和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少175和至多200。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少1和至多100。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少5和至多100。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少10和至多100。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少25和至多100。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少50和至多100。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少75和至多100。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少1和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少5和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少10和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少20和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少25和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少30和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少40和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少50和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少30和至多90。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多85。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多75。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多70。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多60。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多50。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多49。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多48。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多47。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少35和至多46。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少36和至多45。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少37和至多44。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少38和至多43。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少39和至多42。在一个实施方案中，任一O-抗原式中的n为至少39和至多41。

例如，在一个实施方案中，糖中的n为31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90，最优选40。在另一个实施方案中，n为至少35至最多60。例如，在一个实施方案中，n是35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60中的任何一个，优选50。在另一个优选的实施方案中，n为至少55至最多75。例如，在一个实施方案中，n为55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69，最优选60。

糖结构可以通过本领域已知的方法和工具测定，如例如，NMR，包括1D、1H和/或13C，2D TOCSY，DQF-COSY，NOESY和/或HMQC。

在一些实施方案中，缀合之前的纯化的多糖具有5 kDa-400 kDa的分子量。在其他这种实施方案中，糖具有10 kDa-400 kDa；5 kDa-400 kDa；5 kDa-300 kDa；5 kDa-200kDa；5 kDa-150 kDa；10 kDa-100 kDa；10 kDa-75 kDa；10 kDa-60 kDa；10 kDa-40 kDa；10kDa-100 kDa；10 kDa-200 kDa；15 kDa-150 kDa；12 kDa-120 kDa；12 kDa-75 kDa；12kDa-50 kDa；12-60 kDa；35 kDa-75 kDa；40 kDa-60 kDa；35 kDa-60 kDa；20 kDa-60 kDa；12 kDa-20 kDa；或20 kDa-50 kDa的分子量。在进一步的实施方案中，多糖具有7 kDa-15kDa；8 kDa-16 kDa；9 kDa-25 kDa；10 kDa-100；10 kDa-60 kDa；10 kDa-70 kDa；10 kDa-160 kDa；15 kDa-600 kDa；20 kDa-1000 kDa；20 kDa-600 kDa；20 kDa-400 kDa；30 kDa-1,000 KDa；30 kDa-60 kDa；30 kDa-50 kDa或5 kDa-60 kDa的分子量。任何以上范围内的任何整数整数均被预期作为本公开内容的实施方案。

如本文所用的，术语多糖或载体蛋白-多糖缀合物的“分子量”是指通过与多角度激光散射检测器（MALLS）组合的尺寸排阻层析（SEC）计算的分子量。

在正常的纯化程序过程中，多糖的大小可能变得略微减小。另外，如本文所述的，可以在缀合之前使多糖经受分级（sizing）技术。可以采用机械或化学分级。可以使用乙酸进行化学水解。机械分级可使用高压匀浆剪切（High Pressure HomogenizationShearing）进行。上述分子量范围是指缀合之前（例如，活化之前）的纯化的多糖。

表1：大肠杆菌血清群/血清型和O-单元部分

†β-D-6dmanHep2Ac是2-O-乙酰基-6-脱氧-β-D-甘露-吡喃庚糖基。

‡β-D-Xulf是β-D-苏糖型-呋喃戊糖基。

核心寡糖

核心寡糖定位于野生型大肠杆菌LPS中的脂质A和O-抗原外部区域之间。更具体地，核心寡糖是包括野生型大肠杆菌中O-抗原和脂质A之间的键的多糖的一部分。所述键包括最里面的3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸（KDO））残基的半酮缩醇官能与脂质A的GlcNAc-残基的羟基之间的酮糖苷键。核心寡糖区域在野生型大肠杆菌菌株之间显示出高程度的相似性。它通常包含有限数目的糖。核心寡糖包含内部核心区域和外部核心区域。

更具体地，内部核心主要由L-甘油-D-甘露-庚糖（庚糖）和KDO残基组成。内部核心是高度保守的。KDO残基包括下式KDO：

核心寡糖的外部区域展示比内部核心区域更多的变异，并且所述区域中的差异区分了大肠杆菌中的五种化学型：R1、R2、R3、R4和K-12。参见图17，其举例说明了五种已知化学型的外部核心寡糖的碳水化合物主链的一般结构。HepII是内部核心寡糖的最后一个残基。尽管所有的外部核心寡糖都共有具有(己糖)₃碳水化合物主链和两个侧链残基的结构主题，但主链中己糖的顺序以及侧链残基的特性、位置和键都可以改变。R1和R4外部核心寡糖的结构高度相似，仅在单个β-连接的残基方面不同。

基于远侧寡糖的结构，在本领域中将野生型大肠杆菌的核心寡糖分为五种不同的化学型：大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12。

在优选的实施方案中，本文所述的组合物包含复合糖，其中O-多糖包含结合至O-抗原的核心寡糖。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少任一种核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12的免疫应答。在另一个实施方案中，组合物诱导针对至少两种核心大肠杆菌化学型的免疫应答。在另一个实施方案中，组合物诱导针对至少三种核心大肠杆菌化学型的免疫应答。在另一个实施方案中，组合物诱导针对至少四种核心大肠杆菌化学型的免疫应答。在另一个实施方案中，组合物诱导针对所有五种核心大肠杆菌化学型的免疫应答。

在另一个优选的实施方案中，本文所述的组合物包含复合糖，其中O-多糖不包含与O-抗原结合的核心寡糖。在一个实施方案中，这种组合物诱导针对至少任一种核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12的免疫应答，尽管复合糖具有不包含核心寡糖的O-多糖。

大肠杆菌血清型可以根据五种化学型之一来表征。表2列举了根据化学型表征的示例性血清型。以粗体表示的血清型代表与所示核心化学型最通常有关的血清型。因此，在优选的实施方案中，组合物诱导针对至少任一种核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12的免疫应答，其包括针对各自相应的大肠杆菌血清型的任何一种的免疫应答。

表2：核心化学型和有关的大肠杆菌血清型

在一些实施方案中，组合物包含糖，所述糖包含衍生自具有R1化学型的血清型的结构，例如，选自具有式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O8、式O18、式O9、式O13、式O20、式O21、式O91和式O163的糖，其中n为1至100。在一些实施方案中，所述组合物中的糖进一步包含大肠杆菌R1核心部分，例如，图17中所示的。

在一些实施方案中，组合物包含糖，所述糖包含衍生自具有R1化学型的血清型的结构，例如，选自具有式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O18、式O13、式O20、式O21、式O91和式O163的糖，其中n为1至100，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖进一步包含糖中的大肠杆菌R1核心部分。

在一些实施方案中，组合物包含糖，所述糖包含衍生自具有R2化学型的血清型的结构，例如，选自具有式O21、式O44、式O11、式O89、式O162和式O9的糖，其中n为1至100，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖进一步包含大肠杆菌R2核心部分，例如，图17中所示的。

在一些实施方案中，组合物包含糖，所述糖包含衍生自具有R3化学型的血清型的结构，例如，选自具有式O25b、式O15、式O153、式O21、式O17、式O11、式O159、式O22、式O86和式O93的糖，其中n为1至100，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖进一步包含大肠杆菌R3核心部分，例如，图17中所示的。

在一些实施方案中，组合物包含糖，所述糖包含衍生自具有R4化学型的血清型的结构，例如，选自具有式O2、式O1、式O86、式O7、式O102、式O160和式O166的糖，其中n为1至100，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖进一步包含大肠杆菌R4核心部分，例如，图17中所示的。

在一些实施方案中，组合物包含糖，所述糖包含衍生自具有K-12化学型的血清型的结构（例如，选自具有式O25b的糖和具有式O16的糖），其中n为1至1000，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖进一步包含大肠杆菌K-12核心部分，例如，图17中所示的。

在一些实施方案中，糖包含核心糖。因此，在一个实施方案中，O-多糖进一步包含大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖进一步包含大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖进一步包含大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖进一步包含大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖进一步包含大肠杆菌K12核心部分。

在一些实施方案中，糖不包含核心糖。因此，在一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包含大肠杆菌K12核心部分。

缀合的O-抗原

O-抗原或优选O-多糖与蛋白载体的化学键合可以改善O-抗原或O-多糖的免疫原性。然而，聚合物大小的可变性代表了对于生产的实际挑战。在商业用途中，糖的大小可影响与不同缀合合成策略的相容性、产物均匀性和缀合物免疫原性。通过操纵O-抗原合成途径来控制Wzz家族蛋白链长调节物的表达为在多种革兰氏阴性细菌菌株包括大肠杆菌中产生所期望的长度的O-抗原链创造了条件。

在一个实施方案中，将纯化的糖化学活化以产生能够与载体蛋白反应的活化的糖。一旦被活化，每种糖就分别与载体蛋白缀合以形成缀合物，即复合糖。如本文所用的，术语“复合糖”是指与载体蛋白共价连接的糖。在一个实施方案中，糖直接与载体蛋白连接。在另一个实施方案中，糖通过间隔基/接头与蛋白连接。

缀合物可以通过在沿着O-抗原的一个或多个位点处将载体与O-抗原结合的方案或通过活化核心寡糖的至少一个残基的方案来制备。

在一个实施方案中，每种糖缀合至相同的载体蛋白。

如果蛋白载体对于组合物中的2种或更多种糖是相同的，则可以将糖缀合到相同的载体蛋白分子上（例如，具有2种或更多种不同的与其缀合的糖的载体分子）。

在优选的实施方案中，糖各自个别地与不同的蛋白载体分子缀合（仅具有与其缀合的一种类型的糖的每个蛋白载体分子）。在所述实施方案中，糖被认为个别地与载体蛋白缀合。

糖的化学活化以及后来与载体蛋白的缀合可以通过本文公开的活化和缀合方法来实现。在多糖与载体蛋白缀合之后，通过多种技术纯化复合糖（相对于多糖-蛋白缀合物的量富集的）。这些技术包括浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱、柱层析和深度过滤。在纯化各复合糖之后，将它们配合以配制本发明的免疫原性组合物。

活化。本发明进一步涉及由本文所述的任一种实施方案生产的活化的多糖，其中所述多糖用化学试剂活化以产生用于缀合至接头或载体蛋白的反应基。在一些实施方案中，本发明的糖在与载体蛋白缀合之前被活化。在一些实施方案中，活化程度不显著降低多糖的分子量。例如，在一些实施方案中，活化程度不切割多糖主链。在一些实施方案中，活化程度不显著影响缀合程度，如通过在载体蛋白如CRM₁₉₇中修饰的赖氨酸残基的数目所测量的（如通过氨基酸分析所确定的）。例如，在一些实施方案中，与在相同的活化程度具有参考多糖的缀合物的载体蛋白中修饰的赖氨酸残基的数目相比，活化程度不显著将载体蛋白中修饰的赖氨酸残基的数目（如通过氨基酸分析所确定的）增加到3-倍。在一些实施方案中，活化程度不增加未缀合的游离糖的水平。在一些实施方案中，活化程度不降低最佳糖/蛋白比。

在一些实施方案中，活化的糖具有活化百分比，其中硫醇的摩尔数/活化的糖的糖重复单元为1-100％，如例如2-80％、2-50％、3-30％和4-25％。活化程度为至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、≥20%、≥30%、≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、或≥90%、或约100%。优选地，活化程度为至多50％，更优选为至多25％。在一个实施方案中，活化程度为至多20％。可以将任何最小值和任何最大值组合以定义范围。

在一个实施方案中，将多糖用1-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶（CDAP）活化以形成氰酸酯。然后将活化的多糖直接或经由间隔基（接头）基团偶联至载体蛋白（优选CRM₁₉₇或破伤风类毒素）上的氨基。

例如，间隔基可以是胱胺或半胱胺，以产生硫醇化的多糖，其可以通过在与马来酰亚胺活化的载体蛋白（例如，使用N-[Y-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯（GMBS））或卤乙酰化的载体蛋白（例如使用碘乙酰亚胺（iodoacetimide），溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯（SBA；SIB），(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯（SIAB），(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯（磺基-SIAB），碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯（SIA）或3-[溴乙酰氨基]丙酸琥珀酰亚胺酯（SBAP））反应后获得的硫醚键与载体偶联。在一个实施方案中，将氰酸酯（任选地通过CDAP化学制备）与己二胺或己二酸二酰肼（ADH）偶联，并且使用碳二亚胺（例如，EDAC或EDC）化学通过蛋白载体上的羧基将氨基衍生的糖缀合至载体蛋白（例如，CRM₁₉₇）。

其他合适的缀合技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷（norborane）、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI反应继之以与蛋白反应以形成氨基甲酸酯键而形成。这可能包括将端基异构末端还原为伯羟基，伯羟基的任选保护/脱保护，伯羟基与CDI反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体，以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基的偶联（CDI化学）。

分子量。在一些实施方案中，复合糖包含具有10kDa-2,000 kDa的分子量的糖。在其他实施方案中，糖具有50 kDa-1,000 kDa的分子量。在其他实施方案中，糖具有70 kDa-900 kDa的分子量。在其他实施方案中，糖具有100 kDa-800 kDa的分子量。在其他实施方案中，糖具有200 kDa-600 kDa的分子量。在进一步的实施方案中，糖具有100 kDa-1000 kDa；100 kDa-900 kDa；100 kDa-800 kDa；100 kDa-700 kDa；100 kDa-600 kDa；100 kDa-500kDa；100 kDa-400 kDa；100 kDa-300 kDa；150 kDa-1,000 kDa；150 kDa-900 kDa；150kDa-800 kDa；150 kDa-700 kDa；150 kDa-600 kDa；150 kDa-500 kDa；150 kDa-400 kDa；150 kDa-300 kDa；200 kDa-1,000 kDa；200 kDa-900 kDa；200 kDa-800 kDa；200 kDa-700kDa；200 kDa-600 kDa；200 kDa-500 kDa；200 kDa-400 kDa；200 kDa-300；250 kDa-1,000kDa；250 kDa-900 kDa；250 kDa-800 kDa；250 kDa-700 kDa；250 kDa-600 kDa；250 kDa-500 kDa；250 kDa-400 kDa；250 kDa-350 kDa；300 kDa-1,000 kDa；300 kDa-900 kDa；300kDa-800 kDa；300 kDa-700 kDa；300 kDa-600 kDa；300 kDa-500 kDa；300 kDa-400 kDa；400 kDa-1,000 kDa；400 kDa-900 kDa；400 kDa-800 kDa；400 kDa-700 kDa；400 kDa-600kDa；500 kDa-600 kDa的分子量。在一个实施方案中，具有这种分子量的复合糖通过单端缀合产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的复合糖通过在水性缓冲液中制备的还原性胺化化学（RAC）产生。任何以上范围内的任何整数整数均被预期作为本公开内容的实施方案。

在一些实施方案中，本发明的复合糖具有400 kDa-15,000 kDa；500 kDa-10,000kDa；2,000 kDa-10,000 kDa；3,000 kDa-8,000 kDa；或3,000 kDa-5,000 kDa的分子量。在其他实施方案中，复合糖具有500 kDa-10,000 kDa的分子量。在其他实施方案中，复合糖具有1,000 kDa-8,000 kDa的分子量。在又其他实施方案中，复合糖具有2,000 kDa-8,000kDa或3,000 kDa-7,000 kDa的分子量。在进一步的实施方案中，本发明的复合糖具有200kDa-20,000 kDa；200 kDa-15,000 kDa；200 kDa-10,000 kDa；200 kDa-7,500 kDa；200kDa-5,000 kDa；200 kDa-3,000 kDa；200 kDa-1,000 kDa；500 kDa-20,000 kDa；500 kDa-15,000 kDa；500 kDa-12,500 kDa；500 kDa-10,000 kDa；500 kDa-7,500 kDa；500 kDa-6,000 kDa；500 kDa-5,000 kDa；500 kDa-4,000 kDa；500 kDa-3,000 kDa；500 kDa-2,000kDa；500 kDa-1 ,500 kDa；500 kDa-1,000 kDa；750 kDa-20,000 kDa；750 kDa-15,000kDa；750kDa-12,500 kDa；750kDa-10,000 kDa；750kDa-7,500 kDa；750 kDa-6,000 kDa；750 kDa-5,000 kDa；750 kDa-4,000 kDa；750 kDa-3,000 kDa；750 kDa-2,000 kDa；750kDa-1,500 kDa；1,000 kDa-15,000 kDa；1,000 kDa-12,500 kDa；1,000 kDa-10,000 kDa；1,000 kDa-7,500 kDa；1,000 kDa-6,000 kDa；1,000 kDa-5,000 kDa；1,000 kDa-4,000kDa；1,000 kDa-2,500 kDa；2,000 kDa-15,000 kDa；2,000 kDa-12,500 kDa；2,000 kDa-10,000 kDa；2,000 kDa-7,500 kDa；2,000 kDa-6,000 kDa；2,000 kDa-5,000 kDa；2,000kDa-4,000 kDa；或2,000 kDa-3,000 kDa的分子量。在一个实施方案中，具有这种分子量的复合糖通过本文所述的eTEC缀合产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的复合糖通过还原性胺化化学（RAC）产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的复合糖通过在DMSO中制备的还原性胺化化学（RAC）产生。

在进一步的实施方案中，本发明的复合糖具有1,000 kDa-20,000 kDa；1,000kDa-15,000 kDa；2,000 kDa-10,000 kDa；2000 kDa-7,500 kDa；2,000 kDa-5,000 kDa；3,000 kDa-20,000 kDa；3,000 kDa-15,000 kDa；3,000 kDa-12,500 kDa；4,000 kDa-10,000kDa；4,000 kDa-7,500 kDa；4,000 kDa-6,000 kDa；或5,000 kDa-7,000 kDa的分子量。在一个实施方案中，具有这种分子量的复合糖通过还原性胺化化学（RAC）产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的复合糖通过在DMSO中制备的还原性胺化化学（RAC）产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的复合糖通过本文所述的eTEC缀合产生。

在进一步的实施方案中，本发明的复合糖具有5,000 kDa-20,000 kDa；5,000kDa-15,000 kDa；5,000 kDa-10,000 kDa；5,000 kDa-7,500 kDa；6,000 kDa-20,000 kDa；6,000 kDa-15,000 kDa；6,000 kDa-12,500 kDa；6,000 kDa-10,000 kDa或6,000 kDa-7,500 kDa的分子量。

复合糖的分子量可以通过SEC-MALLS测量。任何以上范围内的任何整数整数均被预期作为本公开内容的实施方案。本发明的复合糖还可以通过糖与载体蛋白的比例（重量/重量）来表征。在一些实施方案中，复合糖中的多糖与载体蛋白的比例（w/w）为0.5-3（例如，约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1 、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0）。在其他实施方案中，糖与载体蛋白比例（w/w）为0.5-2.0、0.5-1.5、0.8-1.2、0.5-1.0、1.0-1.5或1.0-2.0。在进一步的实施方案中，糖与载体蛋白比例（w/w）为0.8-1.2。在优选的实施方案中，缀合物中多糖与载体蛋白的比例为0.9-1.1。在一些这种实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇。

复合糖还可以通过其分子大小分布（K_d）来表征。尺寸排阻层析基质（CL-4B）可用于确定缀合物的相对分子大小分布。在重力自流进料柱中使用尺寸排阻层析（SEC）以用数据图表表示缀合物的分子大小分布。从介质的孔中排除的大分子比小分子更快地洗脱。级分收集器用于收集柱洗脱物。通过糖测定比色法地测试级分。对于K_d的测定，将柱进行校准以确立分子被完全排除的级分（V₀），（K_d=0），以及代表最大保留的级分（V_i），（K_d=1）。达到指定样品属性的级分（V_e）通过表达式K_d = (V_e - V_o)/ (V_i - V₀)与Kd相关。

游离糖。本发明的复合糖和免疫原性组合物可包含未与载体蛋白共价缀合但仍然存在于复合糖组合物中的游离糖。游离糖可以与复合糖非共价地缔合（即，非共价地结合其、吸附其或截留在其中）。在优选的实施方案中，与多糖的总量相比，复合糖包含至多50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%的游离多糖。在优选的实施方案中，与多糖的总量相比，复合糖包含少于约25％的游离多糖。在优选的实施方案中，与多糖的总量相比，复合糖包含至多约20％的游离多糖。在优选的实施方案中，与多糖的总量相比，复合糖包含至多约15％的游离多糖。在另一个优选的实施方案中，与多糖的总量相比，复合糖包含至多约20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的游离多糖。在优选的实施方案中，与多糖的总量相比，复合糖包含少于约8％的游离多糖。在优选的实施方案中，与多糖的总量相比，复合糖包含至多约6％的游离多糖。在优选的实施方案中，与多糖的总量相比，复合糖包含至多约5％的游离多糖。参见，例如，表12、表13、表14、表15、表16、表17和表18。

共价键。在其他实施方案中，对于每5-10个糖重复单元；每2-7个糖重复单元；每3-8个糖重复单元；每4-9个糖重复单元；每6-1 1个糖重复单元；每7-12个糖重复单元；每8-13个糖重复单元；每9-14个糖重复单元；每10-15个糖重复单元；每2-6个糖重复单元；每3-7个糖重复单元；每4-8个糖重复单元；每6-10个糖重复单元；每7-11个糖重复单元；每8-12个糖重复单元；每9-13个糖重复单元；每10-14个糖重复单元；每10-20个糖重复单元；每4-25个糖重复单元或每2-25个糖重复单元，缀合物在载体蛋白和糖之间包含至少一个共价键。在常见的实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇。在另一个实施方案中，对于多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个糖重复单元，存在载体蛋白和糖之间的至少一个键。在一个实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇。任何以上范围内的任何整数整数均被预期作为本公开内容的实施方案。

赖氨酸残基。表征本发明的复合糖的另一种方法是通过载体蛋白（例如，CRM₁₉₇）中变得与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可以表征为缀合的赖氨酸的范围（缀合程度）。对于归因于与多糖的共价键合的载体蛋白的赖氨酸修饰的证据可以使用本领域技术人员已知的常规方法通过氨基酸分析获得。与用于产生缀合物材料的载体蛋白原材料相比，缀合导致回收的赖氨酸残基数目的减少。在优选的实施方案中，本发明的复合糖的缀合程度为2-15、2-13、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、3-15、3-13、3-10、3-8、3-6、3-5、3-4、5-15、5-10、8-15、8-12、10-15或10-12。在一个实施方案中，本发明的复合糖的缀合程度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在优选的实施方案中，本发明的复合糖的缀合程度为4至7。在一些这种实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇。

糖链与载体蛋白上的赖氨酸附着的频率是表征本发明的复合糖的另一个参数。例如，在一些实施方案中，对于多糖的每4个糖重复单元，在载体蛋白和多糖之间至少一个共价键。在另一个实施方案中，在载体蛋白和多糖之间的共价键在多糖的每10个糖重复单元中至少发生一次。在另一个实施方案中，在载体蛋白和多糖之间的共价键在多糖的每15个糖重复单元中至少发生一次。在进一步的实施方案中，在载体蛋白和多糖之间的共价键在多糖的每25个糖重复单元中至少发生一次。O-乙酰化。在一些实施方案中，本发明的糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中，复合糖包含具有10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、75-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%的O-乙酰化程度的糖。在其他实施方案中，O-乙酰化程度为≥10%、≥20%、≥30%、≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、或≥90%或约100%。所谓O-乙酰化的%指的是给定糖相对于100％（其中每个重复单元相对于其乙酰化结构被完全乙酰化）的百分比。

在一些实施方案中，复合糖通过还原性胺化制备。在一些实施方案中，复合糖是单端连接的缀合的糖，其中糖直接共价结合至载体蛋白。在一些实施方案中，复合糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基共价结合至载体蛋白。

还原性胺化。在一个实施方案中，通过还原性胺化将糖缀合到载体蛋白上（例如在美国专利申请公开Nos. 2006/0228380、2007/0231340、2007/0184071和2007/0184072、WO2006/110381、WO 2008/079653和WO 2008/143709中描述的）。

还原性胺化包括（1）糖的氧化，（2）活化的糖和载体蛋白的还原以形成缀合物。在氧化之前，糖任选地被水解。可以采用机械或化学水解。可以使用乙酸进行化学水解。

氧化步骤可包括与高碘酸反应。如本文所用的术语“高碘酸”是指高碘酸盐和高碘酸两者。所述术语还包括偏高碘酸盐（IO₄ ⁻）和原高碘酸盐（IO₆ ⁵⁻）以及高碘酸的各种盐（例如，高碘酸钠和高碘酸钾）。在一个实施方案中，在有偏高碘酸盐的情况下，优选在有高碘酸钠（NalO₄）的情况下，将多糖氧化。在另一个实施方案中，在有原高碘酸盐情况下，优选在有高碘酸的情况下，将多糖氧化。

在一个实施方案中，氧化剂是在有氧化剂的情况下选择性氧化伯羟基的稳定的硝酰或硝基氧自由基化合物，例如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。在所述反应中，在催化循环中，实际的氧化剂是N-氧代铵（oxoammonium）盐。在一个方面，所述稳定的硝酰或硝基氧自由基化合物是哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。在一个方面，所述稳定的硝酰或硝基氧自由基化合物带有TEMPO（2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基）或PROXYL（2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基）部分。在一个方面，所述稳定的硝酰自由基化合物是TEMPO或其衍生物。在一个方面，所述氧化剂是带有N-卤部分的分子。在一个方面，所述氧化剂选自N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺、二氯异氰脲酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪烷（triazinane）-2,4,6-三酮、二溴异氰脲酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二碘异氰脲酸和1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮中的任何一种。优选地，所述氧化剂是N-氯代琥珀酰亚胺。

在糖的氧化步骤之后，糖被认为是活化的，并且在下文中被称为“活化的”。可以将活化的糖和载体蛋白独立地（分开冻干）或一起（共冻干（co-lyophilized））冻干（冷冻干燥）。在一个实施方案中，将活化的糖和载体蛋白共冻干。在另一个实施方案中，将活化的多糖和载体蛋白独立地冻干。

在一个实施方案中，冻干在有非还原糖的情况下发生，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露糖醇、乳糖醇和异麦芽糖醇（palatinit）。

缀合过程的下一步是使用还原剂还原活化的糖和载体蛋白以形成缀合物（所谓的还原性胺化）。合适的还原剂包括氰基氢硼化物，例如氰基氢硼化钠，三乙酰氧基氢硼化钠或在有布朗斯台德酸或路易斯酸的情况下的氢硼化钠或氢硼化锌），胺硼烷，例如吡啶硼烷，2-甲基吡啶硼烷，2,6-二硼烷-甲醇，二甲胺-硼烷，t-BuMe'PrN-BH3，苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷（PEMB），硼烷-吡啶或氢硼化物交换树脂。在一个实施方案中，还原剂是氰基氢硼化钠。

在实施方案中，还原反应在水性溶剂（例如，选自pH为6.0-8.5、7.0-8.0或7.0-7.5的PBS、MES、HEPES、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇（Bis-tris）、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、N-2[羟乙基]甘氨酸或HEPB）中进行，在另一个实施方案中，反应在非质子溶剂中进行。在实施方案中，还原反应在DMSO（二甲基亚砜）或DMF（二甲基甲酰胺）溶剂中进行。DMSO或DMF溶剂可用于重构已冻干的活化的多糖和载体蛋白。

在还原反应结束时，在缀合物中可能剩余未反应的醛基，这些可以使用合适的封端剂进行封端。在一个实施方案中，所述封端剂是氢硼化钠（NaBH₄）。缀合（还原反应和任选地封端）后，可以通过本领域技术人员已知的多种技术纯化复合糖（相对于多糖-蛋白缀合物的量富集的）。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析（DEAE或疏水作用层析）和深度过滤。复合糖可以通过渗滤和/或离子交换层析和/或尺寸排阻层析纯化。在实施方案中，通过渗滤或离子交换层析或尺寸排阻层析纯化复合糖。在一个实施方案中，将复合糖无菌过滤。

在优选的实施方案中，来自选自O25B、O1、O2和O6中的任何一种的大肠杆菌血清型的复合糖通过还原性胺化来制备。在优选的实施方案中，来自大肠杆菌血清型O25B、O1、O2和O6的复合糖通过还原性胺化来制备。

在一个方面，本发明涉及缀合物，其包含与由

表示的式O25B的糖连接的载体蛋白，例如CRM₁₉₇，其中n是大于或等于1的任何整数。在优选的实施方案中，n是至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40和至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50的整数。可以将任何最小值和任何最大值组合以定义范围。示例性的范围包括，例如，至少1至最多1000；至少10至最多多500；和至少20至最多80。在优选的实施方案中，n为至少31至最多90，更优选40至90，最优选60至85。

在另一个方面，本发明涉及缀合物，其包含与具有表1中所示的以下结构中的任一个的糖（也参见图9A-C和图10A-B）连接的载体蛋白，例如，CRM₁₉₇，其中n是大于或等于1的整数。

在不受理论或机制的约束的情况下，在一些实施方案中，认为稳定的缀合物需要一定水平的糖抗原修饰，其与保持抗原的关键免疫原性表位的结构完整性相平衡。

活化和醛的形成。在一些实施方案中，本发明的糖被活化并导致醛的形成。在其中糖被活化的这种实施方案中，活化的百分比（％）（或氧化程度（DO））是指糖重复单元的摩尔数/活化的多糖的醛的摩尔数。例如，在一些实施方案中，通过在多糖的重复单元上邻位二醇的高碘酸氧化来活化糖，从而导致醛的形成。氧化期间改变高碘酸钠相对于糖重复单元的摩尔当量（meq）和温度导致氧化程度（DO）的不同水平。

糖和醛的浓度一般通过比色测定来测定。备择试剂是TEMPO（2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基自由基）-N-氯代琥珀酰亚胺（NCS）组合，其导致从伯醇基团形成醛。

在一些实施方案中，活化的糖具有这样的氧化程度，其中糖重复单元的摩尔数/活化的糖的醛的摩尔数为1-100，如例如2-80、2-50、3-30和4-25。活化程度至少为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、≥20、≥30、≥40、≥50、≥60、≥70、≥80或≥90或约100。优选地，氧化程度（DO）为至少5且至多50，更优选至少10且至多25。在一个实施方案中，活化程度为至少10且至多25。可以将任何最小值和任何最大值组合以定义范围。氧化程度值可以表示为活化的百分比（％）。例如，在一个实施方案中，10的DO值是指活化的糖中总计10个糖重复单元中的一个活化的糖重复单元，在这种情况下，10的DO值可以表示为10％活化。

在一些实施方案中，通过还原性胺化化学制备的缀合物包含载体蛋白和糖，其中所述糖包含选自式O1（例如，式O1A、式O1B和式O1C）、式O2、式O3、式O4（例如，式O4:K52和式O4:K6）、式O5（例如，式O5ab和式O5ac（菌株180/C3））、式O6（例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54）、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18（例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1）、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23（例如，式O23A）、式O24、式O25（例如，式O25a和式O25b）、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45（例如，式O45和式O45rel）、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73（例如，式O73（菌株73-1））、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187中的任何一种的结构。在一些实施方案中，缀合物中的糖包含式，其中n是1至1000、5至1000、优选31至100、更优选35至90、最优选35至65的整数。

单端连接的缀合物。在一些实施方案中，缀合物是单端连接的缀合的糖，其中所述糖在糖的一端共价结合至载体蛋白。在一些实施方案中，单端连接的缀合的多糖具有末端糖。例如，如果多糖的末端之一（末端糖残基）与载体蛋白共价结合，则缀合物是单端连接的。在一些实施方案中，如果多糖的末端糖残基通过接头与载体蛋白共价结合，则缀合物是单端连接的。这种接头可包括，例如，胱胺接头（A1）、3,3'-二硫代双(丙二酰肼)（3,3’-dithio bis(propanoic dihydrazide)）接头（A4）和2,2'-二硫代-N,N'-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(氨基氧基)乙酰胺)接头（A6）。

在一些实施方案中，糖通过3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸（KDO）残基缀合至载体蛋白以形成单端连接的缀合物。参见，例如，实施例18、实施例19、实施例20和图24。

在一些实施方案中，缀合物优选不是生物缀合物（bioconjugate）。术语“生物缀合物”是指在宿主细胞背景中制备的蛋白（例如，载体蛋白）和抗原例如O抗原（例如，O25B）之间的缀合物，其中宿主细胞手段将抗原与蛋白连接（例如，N-链接）。复合糖包括生物缀合物，以及通过不需要在宿主细胞中制备缀合物的方式来制备的糖抗原（例如，寡糖和多糖）-蛋白缀合物，例如，通过蛋白和糖的化学键合来缀合。

硫醇活化的糖。在一些实施方案中，本发明的糖是硫醇活化的。在其中糖被硫醇活化的这种实施方案中，活化的百分比（％）是指硫醇的摩尔数/活化的多糖的糖重复单元。糖和硫醇浓度一般通过用于巯基定量的Ellman氏测定进行测定。例如，在一些实施方案中，糖包括用二硫化物胺接头活化2-酮-3-脱氧辛酸（KDO）。参见，例如，实施例18和图24。在一些实施方案中，糖通过二价的、异双功能接头（在本文中也称为“间隔基”）共价结合至载体蛋白。接头优选在糖和载体蛋白之间提供硫醚键，从而结果产生在本文中称为“硫醚复合糖”的复合糖。在一些实施方案中，接头进一步提供氨基甲酸酯和酰胺键，如例如，(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）。参见，例如，实施例13。

在一些实施方案中，单端连接的缀合物包含载体蛋白和糖，其中所述糖包含选自式O1（例如，式O1A、式O1B和式O1C）、式O2、式O3、式O4（例如，式O4:K52和式O4:K6）、式O5（例如，式O5ab和式O5ac（菌株180/C3））、式O6（例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54）、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18（例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1）、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23（例如，式O23A）、式O24、式O25（例如，式O25a和式O25b）、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45（例如，式O45和式O45rel）、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73（例如，式O73（菌株73-1））、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187中的任何一种的结构。在一些实施方案中，缀合物中的糖包含式，其中n是1至1000、5至1000、优选31至100、更优选35至90、最优选35至65的整数。

例如，在一个实施方案中，单端连接的缀合物包含载体蛋白和具有选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101的结构的糖，其中n是1至10的整数

eTEC缀合物

在一个方面，本发明总的来说涉及复合糖，其包含通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基与载体蛋白共价缀合的上述衍生自大肠杆菌的糖（如例如在美国专利9517274和国际专利申请公开WO2014027302中所述的，其整体引入本文作为参考），包括包含这种复合糖的免疫原性组合物，以及用于制备和使用这种复合糖和免疫原性组合物的方法。所述复合糖包含通过一个或多个eTEC间隔基与载体蛋白共价缀合的糖，其中所述糖通过氨基甲酸酯键与eTEC间隔基共价缀合，并且其中载体蛋白通过酰胺键与eTEC间隔基共价缀合。eTEC间隔基包含七个线性原子（即，–C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(O)-），并在糖和载体蛋白之间提供稳定的硫醚和酰胺键。

本发明的eTEC连接的复合糖可以由通式（I）表示：

其中构成eTEC间隔基的原子包含在中心的框中。

在本发明的所述复合糖中，糖可以是多糖或寡糖。

并入本发明的复合糖中的载体蛋白选自通常适合于这种目的的载体蛋白，如本文进一步描述的或本领域技术人员已知的。在特定的实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇。

在另一个方面，本发明提供了制备包含通过eTEC间隔基与载体蛋白缀合的本文所述的糖的复合糖的方法，其包括以下步骤：a）使糖与碳酸衍生物在有机溶剂中反应以产生活化的糖；b）使活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应，以产生硫醇化的糖；c）使硫醇化的糖与还原剂反应以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化的糖；d）使活化的硫醇化的糖与包含一个或多个α-卤乙酰胺基团的活化的载体蛋白反应，以产生硫醇化的糖-载体蛋白缀合物；和e）使硫醇化的糖-载体蛋白缀合物与（i）能够将活化的载体蛋白的未缀合的α-卤乙酰胺基团进行封端的第一封端试剂；和/或（ii）能够将活化的硫醇化的糖的未缀合的游离巯基残基封端的第二封端试剂反应；由此产生eTEC连接的复合糖。

在常见的实施方案中，碳酸衍生物是1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)（CDT）或1,1’-羰基二咪唑（CDI）。优选地，碳酸衍生物是CDT，且有机溶剂是极性非质子溶剂，例如二甲基亚砜（DMSO）。在优选的实施方案中，通过活化的糖与双功能对称硫代烷基胺试剂，胱胺或其盐的反应来生产硫醇化的糖。另一方面，可以通过活化的糖与半胱胺或其盐的反应来形成硫醇化的糖。通过本发明的方法产生的eTEC连接的复合糖可以由通式（I）表示。

在常见的实施方案中，第一封端试剂是N-乙酰-L-半胱氨酸，其与载体蛋白的赖氨酸残基上的未缀合的α-卤乙酰胺基团反应，以形成通过硫醚键与活化的赖氨酸残基共价连接的S-羧甲基半胱氨酸（CMC）残基。

在其他实施方案中，第二封端试剂是碘乙酰胺（IAA），其与活化的硫醇化的糖的未缀合的游离巯基反应以提供封端的硫代乙酰胺。步骤e）常常包括用第一封端试剂和第二封端试剂两者封端。在某些实施方案中，步骤e）包括用作为第一封端试剂的N-乙酰-L-半胱氨酸和作为第二封端试剂的IAA进行封端。

在一些实施方案中，封端步骤e）进一步包括在与第一和/或第二封端试剂反应之后与还原剂例如DTT、TCEP或巯基乙醇反应。

本发明的eTEC连接的复合糖和免疫原性组合物可包含游离的巯基残基。在一些情况下，通过本文提供的方法形成的活化的硫醇化的糖将包含多个游离的巯基残基，其中一些在缀合步骤过程中可能不经历与载体蛋白的共价缀合。这种剩余的游离巯基残基通过与硫醇反应性封端试剂（例如，碘乙酰胺（IAA））反应而封端，以封端潜在反应性的功能性。也预期其他硫醇反应性的封端试剂，例如，含马来酰亚胺的试剂等。

另外，本发明的eTEC连接的复合糖和免疫原性组合物可以包含剩余的未缀合的载体蛋白，其可以包括在封端过程步骤期间已经历修饰的活化的载体蛋白。

在一些实施方案中，步骤d）进一步包括在使活化的硫醇化的糖与活化的载体蛋白反应之前，提供包含一个或多个α-卤乙酰胺基团的活化的载体蛋白。在常见的实施方案中，活化的载体蛋白包含一个或多个α-溴乙酰胺基团。

在另一个方面，本发明提供了根据本文公开的任何一种方法产生的eTEC连接的复合糖，其包含通过eTEC间隔基缀合至载体蛋白的本文所述的糖。

在一些实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇，并且在多糖的每4、10、15或25个糖重复单元中发生至少一次在CRM₁₉₇和多糖之间经由eTEC间隔基的共价键合。

对于本发明的每个方面，在本文描述的方法和组合物的特定实施方案中，eTEC连接的复合糖包含本文描述的糖，例如，衍生自大肠杆菌的糖。

在另一个方面，本发明提供了预防、治疗或改善主体中的细菌感染、疾病或状况的方法，其包括向所述主体施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含eTEC连接的复合糖，其包含本文所述的糖。在一些实施方案中，糖衍生自大肠杆菌。

在一些实施方案中，eTEC连接的复合糖包含载体蛋白和糖，其中所述糖包含选自式O1（例如，式O1A、式O1B和式O1C）、式O2、式O3、式O4（例如，式O4:K52和式O4:K6）、式O5（例如，式O5ab和式O5ac（菌株180/C3））、式O6（例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54）、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18（例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1）、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23（例如，式O23A）、式O24、式O25（例如，式O25a和式O25b）、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45（例如，式O45和式O45rel）、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73（例如，式O73（菌株73-1））、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187中的任何一种的结构。在一些实施方案中，缀合物中的糖包含式，其中n是1至1000、5至1000、优选31至100、更优选35至90、最优选35至65的整数。

可以将变得与糖缀合的载体蛋白中赖氨酸残基的数目表征为缀合的赖氨酸的范围。例如，在免疫原性组合物的一些实施方案中，CRM₁₉₇可包含与糖共价连接的39个中的4至16个赖氨酸残基。表示所述参数的另一种方式是约10％至约41％的CRM₁₉₇赖氨酸与糖共价连接。在其他实施方案中，CRM₁₉₇可包含与糖共价连接的39个中的2至20个赖氨酸残基。表示所述参数的另一种方式是约5％至约50％的CRM₁₉₇赖氨酸与糖共价连接。

在常见的实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇，并且在多糖的每4、10、15或25个糖重复单元中发生至少一次在CRM₁₉₇和多糖之间经由eTEC间隔基的共价键合。

在其他实施方案中，对于每5-10个糖重复单元；每2-7个糖重复单元；每3-8个糖重复单元；每4-9个糖重复单元；每6-11个糖重复单元；每7-12个糖重复单元；每8-13个糖重复单元；每9-14个糖重复单元；每10-15个糖重复单元；每2-6个糖重复单元；每3-7个糖重复单元；每4-8个糖重复单元；每6-10个糖重复单元；每7-11个糖重复单元；每8-12个糖重复单元；每9-13个糖重复单元；每10-14个糖重复单元；每10-20个糖重复单元；或每4-25个糖重复单元，缀合物在载体蛋白和糖之间包含至少一个共价键。

在另一个实施方案中，对于多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个糖重复单元，存在载体蛋白和糖之间的至少一个键。

载体蛋白

本发明的复合糖的组分是与糖缀合的载体蛋白。术语“蛋白载体”或“载体蛋白”或“载体”在本文可互换使用。载体蛋白对于标准缀合程序应为可改良的。

缀合物的一种组分是与O-多糖缀合的载体蛋白。在一个实施方案中，缀合物包含缀合至O-多糖的核心寡糖的载体蛋白（参见图17）。在一个实施方案中，缀合物包含与O-多糖的O-抗原缀合的载体蛋白。

术语“蛋白载体”或“载体蛋白”或“载体”在本文可互换使用。载体蛋白对于标准缀合程序应为可改良的。

在优选的实施方案中，缀合物的载体蛋白独立地选自TT、DT、DT突变体（例如CRM₁₉₇）、流感嗜血菌（H. influenzae）D蛋白、PhtX、PhtD、PhtDE融合物（特别是在WO 01/98334和WO 03/54007中描述的那些）、解毒的肺炎球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艰难梭菌（C. Difficile）的毒素A或B和PsaA中的任何一种。在实施方案中，本发明的缀合物的载体蛋白是DT（白喉类毒素）。在另一个实施方案中，本发明的缀合物的载体蛋白是TT（破伤风类毒素）。在另一个实施方案中，本发明的缀合物的载体蛋白是PD（流感嗜血菌D蛋白-参见，例如，EP 0 594 610 B）。

在优选的实施方案中，糖与CRM₁₉₇蛋白缀合。CRM₁₉₇蛋白是白喉毒素的无毒形式，但在免疫学上与白喉毒素不能区别。CRM₁₉₇是由被通过产毒棒状杆菌噬菌体β的亚硝基胍诱变产生的非产毒噬菌体β197tox^-感染的白喉棒杆菌（C. diphtheriae）产生的。CRM₁₉₇蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但在结构基因方面与其相差单个碱基变化（鸟嘌呤至腺嘌呤）。所述单个碱基变化导致成熟蛋白中谷氨酸对甘氨酸的氨基酸替代，并消除了白喉毒素的毒性性质。CRM₁₉₇蛋白是安全且有效的用于糖的T-细胞依赖性载体。

因此，在一些实施方案中，本发明的缀合物包含作为载体蛋白的CRM₁₉₇，其中糖与CRM₁₉₇共价连接。

在优选的实施方案中，复合糖的载体蛋白选自DT（白喉毒素），TT（破伤风类毒素）或TT的片段C，CRM197（白喉毒素的无毒但在抗原性上相同的变体），其他DT突变体（例如CRM176、CRM228、CRM 45（Uchida等人，J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973）、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103或CRM107；以及Nicholls和Youle在Genetically EngineeredToxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992中描述的其他突变；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至Gly的缺失或突变以及在US 4709017或US 4950740中公开的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变以及US 5917017或US 6455673中公开的其他突变；或US 5843711中公开的片段），肺炎球菌肺炎球菌溶血素（Kuo等人(1995) Infect lmmun 63; 2706-13），包括以某种方式解毒的ply，例如dPLY-GMBS（WO 04081515、PCT/EP2005/010258）或dPLY-甲醛（formol），PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE（在WO 00/37105或WO 00/39299中公开了PhtA、PhtB、PhtD或PhtE的序列）和Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物，PhtBE融合物，Pht A-E（WO 01/98334、WO 03/54007、WO2009/000826），OMPC（脑膜炎球菌外膜蛋白-通常从脑膜炎奈瑟氏球菌（N.meningitidis）血清群B提取-EP0372501），PorB（来自脑膜炎奈瑟氏球菌），PD（流感嗜血菌D蛋白-参见，例如，EP 0 594 610 B）或其免疫学功能同等物，合成肽（EP0378881、EP0427347），热休克蛋白（WO 93/17712、WO 94/03208），百日咳蛋白（WO 98/58668、EP0471177），细胞因子，淋巴因子，生长因子或激素（WO 91/01146），包含来自各种病原体衍生的抗原的多种人CD4+ T细胞表位的人工蛋白（Falugi等人(2001 ) Eur J Immunol 31 ; 3816-3824）如N19蛋白（Baraldoi等人(2004) Infect lmmun 72; 4884-7）肺炎球菌表面蛋白PspA（WO 02/091998），铁摄取蛋白（WO 01/72337），艰难梭菌的毒素A或B（WO 00/61761），运铁蛋白结合蛋白，肺炎球菌黏着蛋白（PsaA），重组铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）外毒素A（特别是其无毒突变体（例如在谷氨酸553处带有取代的外毒素A（Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971））。其他蛋白，例如卵清蛋白、匙孔䗩血蓝蛋白（KLH）、牛血清清蛋白（BSA）或结核菌素的纯化的蛋白衍生物（PPD），也可用作载体蛋白。其他合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素，例如霍乱类毒素（例如，如国际专利申请No. WO 2004/083251中所述的）、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌的外毒素A。

在一些实施方案中，载体蛋白选自例如CRM₁₉₇，白喉毒素片段B（DTFB），DTFB C8，白喉类毒素（DT），破伤风类毒素（TT），TT的片段C，百日咳类毒素，霍乱类毒素，或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A（EPA），麦芽糖结合蛋白（MBP），鞭毛蛋白，金黄色葡萄球菌（S. aureus）的解毒的溶血素A，聚集因子A，聚集因子B，霍乱毒素B亚基（CTB），肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）肺炎球菌溶血素和其解毒的变体，空肠弯曲杆菌（C. jejuni）AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白中的任一种。在一个实施方案中，载体蛋白是解毒的假单胞菌属外毒素（EPA）。在另一个实施方案中，载体蛋白不是解毒的假单胞菌属外毒素（EPA）。在一个实施方案中，载体蛋白是鞭毛蛋白。在另一个实施方案中，载体蛋白不是鞭毛蛋白。

在优选的实施方案中，复合糖的载体蛋白独立地选自TT、DT、DT突变体（例如CRM₁₉₇）、流感嗜血菌D蛋白、PhtX、PhtD、PhtDE融合物（特别是在WO 01/98334和WO 03/54007中描述的那些）、解毒的肺炎球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艰难梭菌的毒素A或B和PsaA。在实施方案中，本发明的复合糖的载体蛋白是DT（白喉类毒素）。在另一个实施方案中，本发明的复合糖的载体蛋白是TT（破伤风类毒素）。在另一个实施方案中，本发明的复合糖的载体蛋白是PD（流感嗜血菌D蛋白-参见，例如，EP 0 594 610 B）。

在优选的实施方案中，本发明的荚膜糖与CRM₁₉₇蛋白缀合。CRM₁₉₇蛋白是白喉毒素的无毒形式，但在免疫学上与白喉毒素不能区别。CRM₁₉₇是由被通过产毒棒状杆菌噬菌体β的亚硝基胍诱变产生的非产毒噬菌体β197tox-感染的白喉棒杆菌产生的（Uchida, T.等人，1971, Nature New Biology 233:8-11）。CRM₁₉₇蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但在结构基因方面与其相差单个碱基变化（鸟嘌呤至腺嘌呤）。所述单个碱基变化导致成熟蛋白中谷氨酸对甘氨酸的氨基酸替代，并消除了白喉毒素的毒性性质。CRM₁₉₇蛋白是安全且有效的用于糖的T-细胞依赖性载体。关于CRM₁₉₇及其生产的进一步的细节可以例如在US 5,614,382中找到。

因此，在常见的实施方案中，本发明的复合糖包含作为载体蛋白的CRM₁₉₇，其中荚膜多糖共价连接至CRM₁₉₇。

组合物和疫苗

发明人进一步发现了包含至少一种上述糖的组合物和包含至少一种上述缀合物的组合物。在优选的实施方案中，组合物是免疫原性组合物。在另一个实施方案中，组合物是疫苗。

在一个方面，免疫原性组合物包含本文公开的糖的任何一种。在优选的方面，免疫原性组合物包含本文公开的缀合物的任何一种。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O25，优选血清型O25b的复合糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O1，优选血清型O1a的复合糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O2的复合糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O6的复合糖。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种选自以下大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6，优选O25b、O1a、O2和O6的任一种的复合糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少两种选自以下大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6，优选O25b、O1a、O2和O6的任一种的复合糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少三种选自以下大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6，优选O25b、O1a、O2和O6的任一种的复合糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含来自以下大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6，优选O25b、O1a、O2和O6的每一种的复合糖。

在优选的实施方案中，上述免疫原性组合物中任何一种的复合糖各自与CRM₁₉₇缀合。

因此，组合物包含来自至少一种大肠杆菌血清型的O-抗原。在优选的实施方案中，组合物包含来自不止1种大肠杆菌血清型的O-抗原。例如，组合物可包含来自两种不同的大肠杆菌血清型（或“v”，价）至12种不同血清型（12v）的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自3种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自12种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自13种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自14种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自15种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自16种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自18种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自19种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物包含来自20种不同血清型的O-抗原。

优选地，大肠杆菌糖的数目可以从1种血清型（或“v”，价）一直到26种不同血清型（26v）。在一个实施方案中，存在一种血清型。在一个实施方案中，存在2种不同的血清型。在一个实施方案中，存在3种不同的血清型。在一个实施方案中，存在4种不同的血清型。在一个实施方案中，存在5种不同的血清型。在一个实施方案中，存在6种不同的血清型。在一个实施方案中，存在7种不同的血清型。在一个实施方案中，存在8种不同的血清型。在一个实施方案中，存在9种不同的血清型。在一个实施方案中，存在10种不同的血清型。在一个实施方案中，存在11种不同的血清型。在一个实施方案中，存在12种不同的血清型。在一个实施方案中，存在13种不同的血清型。在一个实施方案中，存在14种不同的血清型。在一个实施方案中，存在15种不同的血清型。在一个实施方案中，存在16种不同的血清型。在一个实施方案中，存在17种不同的血清型。在一个实施方案中，存在18种不同的血清型。在一个实施方案中，存在19种不同的血清型。在一个实施方案中，存在20种不同的血清型。在一个实施方案中，存在21种不同的血清型。在一个实施方案中，存在22种不同的血清型。在一个实施方案中，存在23种不同的血清型。在一个实施方案中，存在24种不同的血清型。在一个实施方案中，存在25种不同的血清型。在一个实施方案中，存在26种不同的血清型。糖与载体蛋白缀合以形成如本文所述的复合糖。

在一个方面，组合物包含复合糖，其包含来自至少一种大肠杆菌血清群的O-抗原，其中所述O-抗原与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自不止1种大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自3种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自12种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自13种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自14种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自15种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自16种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自18种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自19种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自20种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原都与载体蛋白缀合。

在另一个方面，组合物包含来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖。在优选的实施方案中，组合物包含来自不止1种大肠杆菌血清型的O-多糖。例如，组合物可以包含来自两种不同的大肠杆菌血清型到12种不同的大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自12种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自13种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自14种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自15种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自16种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自18种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自19种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包含来自20种不同血清型的O-多糖。

在优选的实施方案中，组合物包含来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中所述O-多糖与载体蛋白缀合。在优选的实施方案中，组合物包含来自不止1种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。例如，组合物可以包含来自两种不同的大肠杆菌血清型至12种不同的大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自12种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自13种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自14种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自15种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自16种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自18种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自19种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自20种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合。

在最优选的实施方案中，组合物包含来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中所述O-多糖与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在优选的实施方案中，组合物包含来自不止1种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。例如，组合物可以包含来自两种不同的大肠杆菌血清型至12种不同的大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自12种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自13种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自14种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自15种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自16种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自18种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自19种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自20种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与载体蛋白缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在优选的实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇。

在另一个优选的实施方案中，组合物包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O25a，其中n为至少40，以及核心糖。在优选的实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O25b，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O1a，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O2，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O6，其中n为至少40，以及核心糖。

在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O17，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O15，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O18A，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O75，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O4，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O16，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O13，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O7，其中n为至少40，以及核心糖。

在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O8，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，O-多糖包含式O8，其中n为1-20，优选2-5，更优选3。式O8示于例如图10B中。在另一个实施方案中，组合物进一步包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O9，其中n为至少40，以及核心糖。在另一个实施方案中，O-多糖包含式O9，其中n为1-20，优选4-8，更优选5。式O9示于例如图10B中。在另一个实施方案中，O-多糖包含式O9a，其中n为1-20，优选4-8，更优选5。式O9a示于例如图10B中。

在一些实施方案中，O-多糖包含选自式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101中的任何一种，其中n为1-20，优选4-8，更优选5。参见，例如，图10B。

如上所述的，组合物可以包含缀合的O-多糖（抗原）的任何组合。在一个示例性实施方案中，组合物包含包含式O25b的多糖、包含式O1A的多糖、包含式O2的多糖和包含式O6的多糖。更具体地，例如包含以下的组合物：（i）与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O25b，其中n为至少40，以及核心糖；（ii）与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O1a，其中n为至少40，以及核心糖；（iii）与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O2，其中n为至少40，以及核心糖；和（iv）与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中所述O-多糖包含式O6，其中n为至少40，以及核心糖。

在一个实施方案中，组合物包含至少一种衍生自任何大肠杆菌血清型的O-多糖，其中所述血清型不是O25a。例如，在一个实施方案中，组合物不包含包含式O25a的糖。这种组合物可以包含例如包含式O25b的O-多糖、包含式O1A的O-多糖、包含式O2的O-多糖和包含式O6的O-多糖。

在一个实施方案中，组合物包含来自2种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自12种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自13种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自14种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自15种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自16种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自18种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自19种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自20种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖都与CRM₁₉₇缀合，并且其中所述O-多糖包含O-抗原和核心糖。

在一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O25b，其中n为15±2。在一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O25b，其中n为17±2。在一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O25b，其中n为55±2。在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O25b，其中n为51±2。在一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R1核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌K12核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包含KDO部分。优选地，载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合制备。在一个实施方案中，缀合物通过还原性胺化化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基缀合至载体蛋白。优选地，组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够在至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml的浓度结合大肠杆菌血清型O25B多糖，如通过ELISA测定所测定的。因此，可以进行用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清的OPA活性的比较，并且比较它们对血清型O25B的应答，以评估反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O25B，如通过体外调理吞噬（opsonophagocytic）测定所测定的。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出功能性抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O25B，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O25B的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物在至少50％的主体中引出针对大肠杆菌血清型O25B的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在至少60%、70%、80%或至少90%的主体中引出针对大肠杆菌血清型O25B的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O25B的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加人主体针对大肠杆菌血清型O25B的OPA滴度。

在一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O1a，其中n为39±2。在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O1a，其中n为13±2。在一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包含KDO部分。优选地，载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合制备。在一个实施方案中，缀合物通过还原性胺化化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基缀合至载体蛋白。优选地，组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够在至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml的浓度结合大肠杆菌血清型O1A多糖，如通过ELISA测定所测定的。因此，可以进行用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清的OPA活性的比较，并且比较它们对血清型O1A的应答，以评估反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O1A，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出功能性抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O1A，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O1A的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物在至少50％的主体中引出针对大肠杆菌血清型O1A的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在至少60%、70%、80%或至少90%的主体中引出针对大肠杆菌血清型O1A的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O1A的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加人主体针对大肠杆菌血清型O1A的OPA滴度。

在一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O2，其中n为43±2。在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O2，其中n为47±2。在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O2，其中n为17±2。在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O2，其中n为18±2。在一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R1核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R4核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包含KDO部分。优选地，载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合制备。在一个实施方案中，缀合物通过还原性胺化化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基缀合至载体蛋白。优选地，组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够在至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml的浓度结合大肠杆菌血清型O2多糖，如通过ELISA测定所测定的。因此，可以进行用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清的OPA活性的比较，并且比较它们对血清型O2的应答，以评估反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O2，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出功能性抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O2，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O2的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物在至少50％的主体中引出针对大肠杆菌血清型O2的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在至少60%、70%、80%或至少90%的主体中引出针对大肠杆菌血清型O2的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O2的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加人主体针对大肠杆菌血清型O2的OPA滴度。

在一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O6，其中n为42±2。在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O6，其中n为50±2。在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O6，其中n为17±2。在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含式O6，其中n为18±2。在一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包含KDO部分。优选地，载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合制备。在一个实施方案中，缀合物通过还原性胺化化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基缀合至载体蛋白。优选地，组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够在至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml的浓度结合大肠杆菌血清型O6多糖，如通过ELISA测定所测定的。因此，可以进行用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清的OPA活性的比较，并且比较它们对血清型O6的应答，以评估反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O6，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出功能性抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O6，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O6的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物在至少50％的主体中引出针对大肠杆菌血清型O6的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在至少60%、70%、80%或至少90%的主体中引出针对大肠杆菌血清型O6的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O6的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加人主体针对大肠杆菌血清型O6的OPA滴度。

在一个方面，组合物包含缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含选自式O1（例如，式O1A、式O1B和式O1C）、式O2、式O3、式O4（例如，式O4:K52和式O4:K6）、式O5（例如，式O5ab和式O5ac（菌株180/C3））、式O6（例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54）、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18（例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1）、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23（例如，式O23A）、式O24、式O25（例如，式O25a和式O25b）、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45（例如，式O45和式O45rel）、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73（例如，式O73（菌株73-1））、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187中的任何一种的结构，其中n为1至100的整数。在一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R2核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R3核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌R4核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包含大肠杆菌K12核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包含KDO部分。优选地，载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合制备。在一个实施方案中，缀合物通过还原性胺化化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基缀合至载体蛋白。优选地，组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂。在一个实施方案中，组合物进一步包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29种额外的缀合物至最多30种额外的缀合物，每种缀合物均包含与载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包含选自任何一种所述式的结构。

组合物的剂量

选择每种剂量中的一种或多种复合糖的量作为在典型疫苗中没有显著的不利副作用的情况下诱导免疫保护应答的量。所述量将取决于采用哪种特异性免疫原及其如何呈递而变化。

可以基于所述缀合物的总多糖（缀合的和未缀合的）计算免疫原性组合物中特定复合糖的量。例如，具有20％游离多糖的复合糖在100 g多糖剂量中将具有约80 g的缀合的多糖和约20 g的未缀合的多糖。复合糖的量可以取决于大肠杆菌血清型而变化。糖浓度可以通过糖醛酸测定进行测定。

免疫原性组合物中不同多糖组分的“免疫原性量”可以趋异，并且每种可以包含约1.0 g、约2.0 g、约3.0 g、约4.0 g、约5.0 g、约6.0 g、约7.0 g、约8.0 g、约9.0 g、约10.0g、约15.0 g、约20.0 g、约30.0 g、约40.0 pg、约50.0 pg、约60.0 pg、约70.0 pg、约80.0pg、约90.0 pg或约100.0 g任何特定的多糖抗原。通常，对于给定的血清型，每种剂量将包含0.1 g至100 g的多糖，特别是0.5 g至20 g，更特别地1 g至10 g，且甚至更特别地2 g至5g。任何以上范围内的任何整数整数均被预期作为本公开内容的实施方案。在一个实施方案中，对于给定的血清型，每种剂量将包含1 g、2 g、3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g、10 g、15g或20 g多糖。

载体蛋白量。通常，每种剂量将包含5 g至150 g的载体蛋白，特别是10 g至100 g的载体蛋白，更特别是15 g至100 g的载体蛋白，更特别是25至75 g的载体蛋白，更特别是30 g至70 g的载体蛋白，更特别是30至60 g的载体蛋白，更特别是30 g至50 g的载体蛋白，且甚至更特别是40至60 g的载体蛋白。在一个实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，每种剂量将包含约25 g、约26 g、约27 g、约28 g、约29 g、约30 g、约31 g、约32 g、约33 g、约34 g、约35 g、约36 g、约37 g、约38 g、约39 g、约40 g、约41 g、约42 g、约43 g、约44 g、约45 g、约46 g、约47 g、约48 g、约49 g、约50 g、约51 g、约52 g、约53 g、约54 g、约55 g、约56 g、约57 g、约58 g、约59 g、约60 g、约61 g、约62 g、约63 g、约64 g、约65 g、约66 g、约67 g、68 g、约69 g、约70 g、约71 g、约72 g、约73 g、约74 g或约75 g的载体蛋白。在一个实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

佐剂

在一些实施方案中，本文公开的免疫原性组合物可进一步包含至少一种、两种或三种佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。抗原可能主要充当递送系统、主要充当免疫调谐剂或者具有强的两种特征。合适的佐剂包括适合供哺乳动物包括人之用的那些。

可以用于人的已知合适的递送系统类型佐剂的实例包括，但不限于，明矾（例如，磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝），磷酸钙，脂质体，水包油乳剂，例如MF59（4.3％w/v角鲨烯，0.5％w/v聚山梨醇酯80（吐温80），0.5％w/v失水山梨糖醇三油酸酯（Span 85）），油包水乳剂，如Montanide和聚(D,L -丙交酯-共-乙交酯)（PLG）微粒或纳米颗粒。

在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含铝盐（明矾）作为佐剂（例如，磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝）。在优选的实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含0.1 mg/mL至1 mg/mL或0.2 mg/mL至0.3 mg/mL的磷酸铝形式的元素铝。在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含约0.25 mg/mL的磷酸铝形式的元素铝。可以在人中使用的已知合适的免疫调谐类型佐剂的实例包括，但不限于，来自Aquilla树的树皮的皂苷提取物（QS21，Quil A），TLR4激动剂，例如MPL（单磷酰脂质A），3DMPL（3-O-脱酰的MPL）或GLA-AQ，LT/CT突变体，细胞因子例如各种白细胞介素（例如，IL-2、IL-12）或GM-CSF，AS01等。

可以在人中使用的具有递送和免疫调谐两种特征的已知合适的免疫调谐类型佐剂的实例包括，但不限于，ISCOMS（参见，例如，Sjölander等人(1998) J. Leukocyte Biol.64:713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 2006/134423和WO 2007/026190）或GLA-EM，其是TLR4激动剂和水包油乳剂的组合。

对于包括但不限于动物实验的兽医应用，人们可以使用完全弗氏佐剂（CFA），弗氏不完全佐剂（IFA），Emulsigen，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺（thr-MDP），N-乙酰-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺（CGP 11637，称为去甲-MDP），N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺（CGP 19835A，称为MTP-PE）和RIBI，其含有在2％角鲨烯/吐温80乳剂中的从细菌提取的三种组分，单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸和细胞壁骨架（MPL+TDM+CWS）。

增强本文公开的免疫原性组合物的有效性的进一步的示例性佐剂包括，但不限于（1）水包油乳剂制剂（具有或不具有其他特定的免疫刺激剂，例如胞壁酰肽（参见下文）或细菌细胞壁组分），如例如（a）SAF，其含有10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普朗尼克（pluronic）嵌段聚合物L121和thr-MDP，它们被微流化（microfluidized）为亚微米乳剂或涡旋以产生较大颗粒大小的乳剂，和（b）RIBI™佐剂系统（RAS）（Ribi Immunochem, Hamilton,Mont.），含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，例如单磷酰脂质A（MPL）、海藻糖二霉菌酸（TDM）和细胞壁骨架（CWS），优选MPL+CWS（DETOX™）；（2）皂苷佐剂，例如可以使用QS21、STIMULON™（Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.）、ABISCO®（Isconova, 瑞典）或ISCOMATRIX®（Commonwealth Serum Laboratories, 澳大利亚），或从其中产生的颗粒，例如ISCOMs（免疫刺激复合物），所述ISCOMS可能没有额外的去污剂（例如，WO 00/07621）；（3）完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）；（4）细胞因子，例如白细胞介素（例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12（例如，WO 99/44636））、干扰素（例如，γ干扰素）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、肿瘤坏死因子（TNF）等；（5）单磷酰脂质A（MPL）或3-O-脱酰的MPL（3dMPL）（参见，例如，GB2220211、EP0689454）（参见，例如，WO 00/56358）；（6）3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合（参见，例如，EP0835318、EP0735898、EP0761231）；（7）聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯（参见，例如，WO 99/52549）；（8）与辛苯聚醇（octoxynol）组合的聚氧乙烯山梨糖醇酐酯表面活性剂（例如，WO 01/21207），或与至少一种额外的非离子表面活性剂例如辛苯聚醇组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂（例如，WO 01/21152）；（9）皂苷和免疫刺激性寡核苷酸（例如，CpG寡核苷酸）（例如，WO 00/62800）；（10）免疫刺激剂和金属盐颗粒（参见，例如，WO 00/23105）；（11）皂苷和水包油乳剂（例如，WO 99/11241）；（12）皂苷（例如，QS21）+3dMPL+IM2（任选地+固醇）（例如，WO 98/57659）；（13）充当免疫刺激剂以增强组合物功效的其他物质。胞壁酰肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺（thr-MDP）、N-25乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺（去甲-MDP）、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE）等。

在本发明的实施方案中，如本文所公开的免疫原性组合物包含CpG寡核苷酸作为佐剂。如本文所用的CpG寡核苷酸是指免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN），且因此除非另外指出，否则这些术语可互换使用。免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸含有一个或多个免疫刺激性CpG基序，其是未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，任选地在某些优选的碱基背景内。CpG免疫刺激性基序的甲基化状态通常是指二核苷酸中的胞嘧啶残基。含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是含有通过磷酸键与3'鸟嘌呤连接的5'未甲基化的胞嘧啶的寡核苷酸，且其通过与Toll-样受体9（TLR-9）结合而激活免疫系统。在另一个实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一个或多个甲基化的CpG二核苷酸，其将通过TLR9激活免疫系统，但不如如果一个或多个CpG基序未甲基化那样强。CpG免疫刺激性寡核苷酸可以含有一个或多个回文序列，其本身又可以包含CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已在许多颁布的专利、公开的专利申请以及其他出版物中描述，包括美国专利Nos. 6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068。

在本发明的实施方案中，如本文所公开的免疫原性组合物包含在WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行中描述的任何一种CpG寡核苷酸。

已经鉴定了不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。这些被称为A、B、C和P类，并且在WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行中更详细地描述。本发明的方法包括使用这些不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。

制剂

本发明的免疫原性组合物可以以液体形式（即，溶液或悬浮液）或冻干形式配制。液体制剂可以在无需在如否则对于本发明的冻干组合物所需要的水性介质中重构的情况下有利地直接从其包装形式施用，且因此对于注射是理想的。

本发明的免疫原性组合物的配制可以使用本领域公认的方法完成。例如，可以将各种缀合物与生理学上可接受的媒介物一起配制以制备组合物。这种媒介物的实例包括，但不限于，水、缓冲盐水、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇）和葡萄糖溶液。本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含本文公开的复合糖和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的组合的任何一种。

在某些实施方案中，免疫原性组合物制剂包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药学上可接受的稀释剂包括无菌水、注射用水、无菌等渗盐水或生物学缓冲液。多糖-蛋白缀合物和/或蛋白免疫原以常规方式与这种稀释剂或载体混合。如本文所用的，措辞药学上可接受的“载体”意图包括与施用于人或其他脊椎动物宿主相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体对本领域技术人员而言是显而易见的，并且将在很大程度上取决于施用途径。

例如，可能存在于免疫原性组合物制剂中的赋形剂包括防腐剂、化学稳定剂和悬浮剂或分散剂。一般，对稳定剂、防腐剂等进行最优化，以确定对于在靶向的受体（例如，人主体）中的功效的最佳制剂。防腐剂的实例包括氯代丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯类、乙基香兰素、甘油、酚和对氯苯酚。稳定成分的实例包括酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、二磷酸一钾、乳糖、乳清蛋白水解物和奶粉。

在实施方案中，本发明的免疫原性组合物为液体形式，优选为水性液体形式。

本公开内容的免疫原性组合物可以包含缓冲液、盐、二价阳离子、非离子型去污剂、冷冻保护剂如糖和抗氧化剂如自由基清除剂或螯合剂中的一种或多种，或其任何多种组合。

在实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缓冲液。在实施方案中，所述缓冲液具有约3.5至约7.5的pKa。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。在某些实施方案中，缓冲液是终浓度为1 mM至10 mM的琥珀酸盐。在一个特定的实施方案中，琥珀酸盐缓冲液的终浓度为约5 mM。

在实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含盐。在一些实施方案中，盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合中的任何一种。在一些实施方案中，盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定的实施方案中，盐是氯化钠。在一个特定的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含150 mM的氯化钠。

在实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含表面活性剂。在一些实施方案中，组合物包含非离子型表面活性剂，包括但不限于聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。在实施方案中，表面活性剂选自聚山梨醇酯20（TWEEN™20）、聚山梨醇酯40（TWEEN™40）、聚山梨醇酯60（TWEEN™60）、聚山梨醇酯65（TWEEN™65）、聚山梨醇酯80（TWEEN™80）、聚山梨醇酯85（TWEEN™85）、TRITON™ N-101、TRITON™ X-100、辛苯聚醇（oxtoxynol）40、壬苯聚醇-9、三乙醇胺、油酸三乙醇胺多肽、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯（PEG-15，Solutol H 15）、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯（CREMOPHOR® EL）、大豆卵磷脂和泊洛沙姆中的任何一种。在实施方案中，表面活性剂选自聚山梨醇酯20（TWEEN™20）、聚山梨醇酯40（TWEEN™40）、聚山梨醇酯60（TWEEN™60）、聚山梨醇酯65（TWEEN™65）、聚山梨醇酯80（TWEEN™80）、聚山梨醇酯85（TWEEN™85）、TRITON™ N-101、TRITON™ X-100、辛苯聚醇40、壬苯聚醇-9、三乙醇胺、油酸三乙醇胺多肽、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯（PEG-15，Solutol H 15）、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯（CREMOPHOR® EL）、大豆卵磷脂和泊洛沙姆。在一些实施方案中，组合物进一步包含以下聚氧乙烯烷基醚中的任何一种，包括但不限于BRIJ 58、BRIJ 35、TRITON X-100、TRITONX-114、NP40、SPAN 85和普朗尼克系列非离子型表面活性剂，例如，PLURONIC 121。在一个特定的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为重量比重量（w/w）至少0.0001％至10％聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为重量比重量（w/w）至少0.001％至1％聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为重量比重量（w/w）至少0.01％至1％聚山梨醇酯80。在其他实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯80（w/w）。在另一个实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为1％聚山梨醇酯80（w/w）。

在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物具有5.5至7.5的pH，更优选5.6至7.0的pH，甚至更优选5.8至6.0的pH。

在一个实施方案中，本发明提供了装满了本文公开的任何一种免疫原性组合物的容器。在一个实施方案中，容器选自小瓶、注射器、瓶、发酵罐、生物反应器、袋、大口瓶、安瓿、药筒和一次性笔中的任何一种。在一个实施方案中，容器选自小瓶、注射器、瓶、发酵罐、生物反应器、袋、大口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。在某些实施方案中，容器被硅化。在实施方案中，本发明的容器由玻璃、金属（例如，钢、不锈钢、铝等）和/或聚合物（例如，热塑性塑料、高弹体、热塑性塑料-高弹体）制成。在实施方案中，本发明的容器由玻璃制成。

在一个实施方案中，本发明提供了装满了本文公开的任何免疫原性组合物的注射器。在某些实施方案中，注射器是硅化的和/或由玻璃制成。

用于注射的本发明的免疫原性组合物的典型剂量具有0.1 mL至2 mL的体积，更优选0.2 mL至1 mL，甚至更优选约0.5 mL的体积。

因此，如上文所定义的容器或注射器用0.1 mL至2 mL的体积，更优选0.2 mL至1mL，甚至更优选约0.5 mL的体积的本文定义的任何一种免疫原性组合物装满。

本发明的组合物可以通过一种或多种已知方法施用给主体，例如肠胃外、跨粘膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、鼻内、皮下、腹膜内，并相应地配制。

在一个实施方案中，本发明的组合物通过液体制剂的表皮注射、肌内注射、静脉内、动脉内、皮下注射或呼吸黏膜内注射施用。本发明的组合物可以配制为单剂量小瓶、多剂量小瓶或预装填注射器。

在另一个实施方案中，本发明的组合物口服施用，并因此被以适合于口服施用的形式配制，即，作为固体或液体制剂。固体口服制剂包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒、小丸等。液体口服制剂包括溶液、悬浮液、分散体、乳剂、油等。用于液体制剂的药学上可接受的载体是水性或非水性溶液、悬浮液、乳剂或油。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。

水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。油的实例是动物、植物或合成起源的那些，例如，花生油、大豆油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、另一种海洋油（marine oil）或来自乳或蛋的脂质。

药物组合物可以是等渗的、低渗的或高渗的。用于输注或注射的药物组合物当其施用时优选基本上是等渗的。对于贮藏，药物组合物可以优选是等渗的或高渗的。如果药物组合物对于贮藏是高渗的，则可以在施用前将其稀释以变为等渗溶液。等渗剂可以是离子型等渗剂，例如盐，或非离子型等渗剂，例如碳水化合物。离子型等渗剂的实例包括但不限于NaCl、CaCl₃、KCl和MgCl₂。非离子型等渗剂的实例包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇和甘油。

还优选至少一种药学上可接受的添加剂是缓冲液。为了一些目的，例如，当药物组合物计划输注或注射时，经常期望所述组合物包含缓冲液，所述缓冲液能够将溶液缓冲至4至10，例如5至9，例如6至8范围内的pH。缓冲液可以例如选自三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、氨基乙酸盐、L-组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲液中的任一种。缓冲液可以此外例如选自用于肠胃外用途的USP相容的缓冲液，特别地，当药物制剂用于肠胃外用途时。例如，缓冲液可以选自以下中的任一种：一元酸，例如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸和乳酸；二元酸，例如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸，多元酸，例如柠檬酸和磷酸；和碱，例如氨、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和三羟甲基氨基甲烷。肠胃外媒介物（用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射）包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖（Ringer's dextrose）、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液（lactated Ringer's）和固定油。静脉内媒介物包括液体和营养物补充剂，电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。实例是在添加或不添加表面活性剂和其他药学上可接受的佐剂的情况下的无菌液体，例如水和油。通常，水，盐水，水性右旋糖和相关的糖溶液，诸如丙二醇或聚乙二醇的甘醇，聚山梨醇酯80（PS-80），聚山梨醇酯20（PS-20）和泊洛沙姆188（PI 88）是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。油的实例是动物、植物或合成起源的那些，例如，花生油、大豆油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、另一种海洋油或来自乳或蛋的脂质。

制剂可以进一步包含表面活性剂。优选的表面活性剂包括，但不限于聚氧乙烯山梨糖醇酐酯表面活性剂（通常称为TWEENs），尤其是PS-20和PS-80；根据DOWFAX™商品名销售的环氧乙烷（EO）、环氧丙烷（PO）和/或环氧丁烷（BO）的共聚物，例如线性EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚醇，其重复乙氧基（氧基-1,2-乙烷二基）基团的数目可以变化，而辛苯聚醇-9（TRITON X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）特别重要；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40）；磷脂，例如磷脂酰胆碱（卵磷脂）；壬基苯酚乙氧基化物，例如TERGITOL™NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（称为BRIJ表面活性剂），例如三甘醇单月桂基醚（BRIJ 30）；和山梨糖醇酐酯（通常称为SPANs），例如山梨糖醇酐三油酸酯（SPAN 85）和山梨糖醇酐单月桂酸酯。用于包括在乳剂中的优选的表面活性剂是PS-20或PS-80。可以使用表面活性剂的混合物，例如PS-80/SPAN 85混合物。聚氧乙烯山梨糖醇酐酯如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯（PS-80）和辛苯聚醇例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（TRITON X-100）的组合也是合适的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚（laureth）9加聚氧乙烯山梨糖醇酐酯和/或辛苯聚醇。

制剂还可以包含pH-缓冲的盐溶液。缓冲液可以例如选自三羟甲基氨基甲烷、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、氨基乙酸盐、L-组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐、HEPES（4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸）、MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）、MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）和三乙醇胺缓冲液中的任何一种。缓冲液能够将溶液缓冲至4至10、5.2至7.5或5.8至7.0的范围中的pH。在某些方面，缓冲液选自磷酸盐、琥珀酸盐、L-组氨酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸盐或柠檬酸盐中的任何一种。缓冲液可以此外例如选自用于肠胃外用途的USP相容的缓冲液，特别地，当药物制剂用于肠胃外用途时。缓冲液的浓度范围从1mM一直到50 mM或从5 mM一直到50 mM。在某些方面，缓冲液是终浓度为5 mM至50 mM的L-组氨酸，或终浓度为1 mM至10 mM的琥珀酸盐。在某些方面，L-组氨酸在20 mM±2 mM的终浓度。

尽管盐溶液（即，包含NaCl的溶液）是优选的，但其他适合于制剂的盐包括但不限于CaCl₃、KCl和MgCl₂及其组合。可以使用非离子型等渗剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇和甘油，来代替盐。合适的盐范围包括，但不限于25 mM至500 mM或40 mM至170 mM。在一个方面，盐水是NaCl，任选地以20 mM至170 mM的浓度存在。在优选的实施方案中，制剂包含具有氯化钠的L-组氨酸缓冲液。

在另一个实施方案中，药物组合物在控释系统中递送。例如，可以使用静脉内输注、经皮贴片（transdermal patch）、脂质体或其他施用方式来施用试剂。在另一个实施方案中，使用聚合物材料；例如在小球体中或植入物中。

活性

在一个实施方案中，本文所述的糖能够诱导调理活性。在另一个实施方案中，本文所述的糖能够诱导调理和吞噬活性（例如，调理吞噬活性）。

本发明人令人惊讶地发现，与野生型糖相比，具有与相应的野生型糖相比重复单元增加的糖在哺乳动物中诱导了免疫应答的增加。本发明人还令人惊讶地发现，与用包含包含载体蛋白和相应的野生型糖的缀合物的组合物施用的哺乳动物相比，包含包含载体蛋白和具有与相应的野生型糖相比重复单元增加的糖的缀合物的组合物在哺乳动物中诱导了免疫应答的增加。在不受机制或理论的约束的情况下，具有重复单元增加的糖可以具有保持的表位的增加，这可以导致免疫应答增加。

调理活性或调理作用是指调理素（例如，抗体或补体因子）借以与抗原（例如，本文所述的糖或其缀合物）结合的过程，其促进抗原附着于吞噬细胞或吞噬性细胞（phagocyticcell）（例如，巨噬细胞、树突细胞和多形核白细胞（PMNL）。一些细菌，如例如由于荚膜的存在而一般不被吞噬的有荚膜的细菌，当被调理性抗体包被时，变得更可能被吞噬细胞识别。在一个实施方案中，糖诱导免疫应答，如例如抗体，其是调理性的。在一个实施方案中，调理活性针对革兰氏阴性细菌，优选针对埃希氏菌属（Echerichia）物种，更优选针对至少一种大肠杆菌菌株。

吞噬活性或吞噬作用是指吞噬性细胞借以吞入材料并将所述材料包围在其细胞质中的过程。在一个实施方案中，糖诱导免疫应答，如例如抗体，其促进吞噬作用。在一个实施方案中，吞噬活性针对革兰氏阴性细菌，优选针对埃希氏菌属物种，更优选针对至少一种大肠杆菌菌株。例如，针对本文所述的分离的糖产生的兔抗体可能能够介导在有补体的情况下表达所述糖的菌株的特定的调理吞噬作用（opsonophagocytosis），如例如通过体外吞噬作用测定所表明的。

在再另一个实施方案中，本文所述的糖能够诱导杀细菌免疫应答。在一个实施方案中，杀细菌活性针对革兰氏阴性细菌，优选针对埃希氏菌属物种，更优选针对至少一种大肠杆菌菌株。

用于测量调理作用、吞噬作用和/或杀细菌活性的方法是本领域已知的，如例如通过测量体内细菌负荷的减少（例如，通过测量用埃希氏菌属攻击的哺乳动物中的菌血症水平）和/或通过测量体外细菌细胞杀伤（例如，体外调理吞噬测定）。在一个实施方案中，与合适的对照相比，如例如与针对热杀伤的革兰氏阴性细菌产生的抗血清相比，糖能够诱导调理、吞噬和/或杀细菌活性。

测量在有功能性抗体和补体的情况下吞噬效应细胞对大肠杆菌细胞的杀伤的调理吞噬测定可能是用于评价大肠杆菌疫苗对特定大肠杆菌血清型（如例如，大肠杆菌血清型O25B）的有效性的替代物。可以通过将大肠杆菌细胞、待测试的热灭活的人血清、分化的HL-60细胞（吞噬细胞）和外源补体来源（例如，小兔补体）的混合物一起温育来进行体外调理吞噬测定。调理吞噬作用在温育过程中继续进行，并在调理吞噬作用时杀伤被抗体和补体包被的细菌细胞。通过将测定混合物铺平板来测定从调理吞噬作用逃脱的存活细菌的菌落形成单位（cfu）。OPA滴度定义为导致比起没有测试血清的对照孔来细菌计数的50％减少的倒数稀度。OPA滴度是从包括所述50％杀伤截断值的两种稀度中内插的。

在这些杀伤类型OPA中，1:8或更高的终点滴度被认为是阳性结果。

在一些实施方案中，由于例如天然暴露于大肠杆菌（例如，在成年主体的情况下），主体在接种之前可具有血清型特异性OPA滴度。

因此，可以进行用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清的OPA活性的比较，并且比较它们对特定大肠杆菌血清型如例如大肠杆菌血清型O25B的应答，以评估反应者的潜在增加。

在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。

用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清的OPA活性的比较也可以通过比较OPA滴度的潜在增加来进行。

因此，可以进行用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清的OPA活性的比较，并且比较它们对特定大肠杆菌血清型如例如大肠杆菌血清型O25B的应答，以评估增加OPA滴度的潜力。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物能够显著增加人主体的OPA滴度。

在一个方面，组合物诱导针对至少一种大肠杆菌血清型的免疫应答。大肠杆菌血清型可以是任何血清型，包括，例如，以下大肠杆菌血清型中的任何一种：O1（例如，O1A、O1B和O1C）、O2、O3、O4（例如，O4:K52和O4:K6）、O5（例如，O5ab和O5ac（菌株180/C3））、O6（例如，O6:K2；K13；K15和O6:K54）、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18（例如，O18A、O18ac、O18A1、O18B和O18B1）、O19、O20、O21、O22、O23（例如，O23A）、O24、O25（例如，O25a和O25b）、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45（例如，O45和O45rel）、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D₁、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73（例如，O73（菌株73-1））、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186和O187。在一个实施方案中，血清型是O25a。在另一个实施方案中，血清型是O25b。在另一个实施方案中，血清型是O1A。在另一个实施方案中，血清型是O2。在另一个实施方案中，血清型是O6。在另一个实施方案中，血清型是O6。在另一个实施方案中，血清型是O17。在另一个实施方案中，血清型是O15。在另一个实施方案中，血清型是O18A。在另一个实施方案中，血清型是O75。在另一个实施方案中，血清型是O4。在另一个实施方案中，血清型是O16。在另一个实施方案中，血清型是O13。在另一个实施方案中，血清型是O7。在另一个实施方案中，血清型是O8。

在优选的实施方案中，组合物诱导针对至少两种大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少3种不同的大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少4种不同大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同的大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少6种不同的大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少7种不同的大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少8种不同的大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少9种不同的大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少10种不同的大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少11种不同的大肠杆菌血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少12种不同的血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少13种不同的血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少14种不同的血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少15种不同的血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少16种不同的血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少17种不同的血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少18种不同的血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少19种不同的血清型的免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对至少20种不同的血清型的免疫应答。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够结合特定的大肠杆菌血清型糖，如例如大肠杆菌血清型O25B糖，如通过ELISA测定所测定的。优选地，增强的免疫应答可以包括IgG1和/或IgG2a和/或IgM产生的增加。

在ELISA（酶联免疫吸附测定）方法中，将来自接种的主体的血清的抗体与已吸附到固相支持体上的多糖一起温育。使用酶缀合的第二检测抗体检测结合的抗体。ELISA测量人血清中存在的类型特异性IgG抗大肠杆菌多糖抗体。当将人血清稀释物添加到类型特异性多糖包被的微量滴定板时，对所述多糖特异的抗体与微量滴定板结合。使用山羊抗人IgG碱性磷酸酶标记的抗体再加上对硝基苯磷酸底物，检测与平板结合的抗体。有色终产物的光密度与血清中存在的抗-O-抗原多糖抗体的量成正比。

在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了人主体针对大肠杆菌血清型O25B、O1、O2和O6的OPA滴度。

在一些实施方案中，本发明的组合物对于初始给药，如例如初始给药后约30天，优选初始给药后约60天将哺乳动物中针对大肠杆菌的抗体的产生增加到至少1,000、优选至少5,000且最多到200,000的几何平均滴度（GMT）水平有效。在优选的实施方案中，组合物对于初始给药后将哺乳动物中针对大肠杆菌血清型O25B的抗体的产生增加到至少1,000、优选至少5,000且最多到200,000的几何平均滴度（GMT）水平有效。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够结合对应于所述组合物中糖的重复单元的大肠杆菌血清型。例如，所述组合物可在至少 0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml的浓度引出IgG抗体，如通过ELISA测定所测定的。因此，可以进行用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清的OPA活性的比较，并且比较它们对各血清型的应答，以评估反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出IgG抗体，所述抗体能够杀伤对应于所述组合物中糖的重复单元的大肠杆菌血清型，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人中引出功能性抗体，所述抗体能够杀伤对应于所述组合物中糖的重复单元的大肠杆菌血清型，如通过体外调理吞噬测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对对应于所述组合物中糖的重复单元的大肠杆菌血清型的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物在至少50％的主体中引出针对对应于所述组合物中糖的重复单元的大肠杆菌血清型的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在至少60%、70%、80%或至少90%的主体中引出针对对应于所述组合物中糖的重复单元的大肠杆菌血清型的至少1:8的滴度，如通过体外调理吞噬杀伤测定所测定的。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对对应于所述组合物中糖的重复单元的大肠杆菌血清型的反应者（即，具有如通过体外OPA所测定的至少1:8的滴度的血清的个体）的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加人主体针对对应于所述组合物中糖的重复单元的大肠杆菌血清型的OPA滴度。

方法

在另一个方面，本发明涉及预防主体例如人主体的感染的方法，包括向所述主体施用有效量的本文所述的组合物（例如，免疫原性组合物）。

在另一个方面，本发明涉及治疗主体例如人主体的感染的方法，包括向所述主体施用有效量的本文所述的组合物（例如，免疫原性组合物）。

在另一个方面，本发明涉及在主体例如人主体中诱导免疫应答的方法，包括向所述主体施用有效量的本文所述的组合物（例如，免疫原性组合物）。

在另一个方面，本发明涉及在主体例如人主体中诱导调理吞噬抗体的产生的方法，包括向所述主体施用有效量的本文所述的组合物（例如，免疫原性组合物）。

如本文所用的，在将本文所述的组合物施用于主体的背景中的术语“有效量”是指具有一种或多种预防和/或治疗效果的组合物的量。在某些实施方案中，“有效量”是指足以实现至少一种、两种、三种、四种或更多种以下作用的组合物的量：（i）降低或改善大肠杆菌感染或与此有关的症状的严重性；（ii）减少大肠杆菌感染或与此有关的症状的持续时间；（iii）预防大肠杆菌感染或与此有关的症状的进展；（iv）引起大肠杆菌感染或与此有关的症状的消退；（v）预防大肠杆菌感染或与此有关的症状的发展或发作；（vi）预防大肠杆菌感染或与此有关的症状的复发；（vii）减少与大肠杆菌感染有关的器官衰竭；（viii）减少患有大肠杆菌感染的主体的住院；（ix）减少患有大肠杆菌感染的主体的住院持续时间；（x）增加患有大肠杆菌感染的主体的存活；（xi）消除主体中的大肠杆菌感染；（xii）抑制或减少主体中的大肠杆菌复制；和/或（xiii）增强或改善另一种疗法的一种或多种预防或治疗效果。

在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物用作药物。本文所述的免疫原性组合物可以用于预防、治疗或改善主体中的细菌感染、疾病或状况的各种治疗或预防方法。特别地，本文所述的免疫原性组合物可用于预防、治疗或改善主体中的大肠杆菌感染、疾病或状况。

因此，在一个方面，本发明提供了预防、治疗或改善主体中与大肠杆菌有关的感染、疾病或状况的方法，包括向所述主体施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。

在一个方面，本发明提供了预防、治疗或改善主体中与大肠杆菌有关的感染、疾病或状况的方法，包括向所述主体施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。

在一个方面，本发明提供了在主体中诱导对大肠杆菌的免疫应答的方法，包括向所述主体施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。

在一个方面，本发明的免疫原性组合物供预防、治疗或改善主体中由大肠杆菌引起的感染、疾病或状况的方法之用。在另一个方面，本发明的组合物供用于保护哺乳动物免于大肠杆菌引起的感染、疾病或状况的方法之用。

在一个实施方案中，本文公开的免疫原性组合物的任何一种供免疫主体抵抗大肠杆菌感染的方法之用。

在一个方面，本发明涉及本文公开的免疫原性组合物在制备用于预防、治疗或改善主体中由大肠杆菌引起的感染、疾病或状况的药物中的用途。

在实施方案中，本发明涉及本文公开的免疫原性组合物在制备用于免疫主体抵抗大肠杆菌感染的药物中的用途。

在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物用作疫苗。更特别地，本文所述的免疫原性组合物可用于预防主体的大肠杆菌感染。因此，在一个方面，本发明提供了预防主体中大肠杆菌感染的方法，包括向所述主体施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。

在一些这种实施方案中，感染选自尿道感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血性尿毒性综合征、新生儿脑膜炎、尿脓毒症、腹腔内感染、脑膜炎、并发的肺炎（complicatedpneumonia）、伤口感染、前列腺活组织检查后相关感染、新生儿/婴儿脓毒症、嗜中性白细胞减少性发热（neutropenic fever）、肺炎、菌血症和脓毒症以及其他血流感染中的任何一种。例如，与新生儿脑膜炎有关的大肠杆菌血清型包括血清型O1、O6、O7、O16、O18和O83。因此，在一个实施方案中，组合物包含缀合物，所述缀合物包含具有选自式O1、式O6、式O7、式O16、式O18、式O83的任一种的结构的糖，及其缀合物的任何组合。作为另一个例子，与菌血症有关的大肠杆菌血清型包括血清型O1、O2、O6、O15和O75。因此，在另一个实施方案中，组合物包含至少一种缀合物，所述缀合物包含具有选自式O1、O2、O6、O15和O75的任一种的结构的糖，及其缀合物的任何组合。作为进一步的例子，将大肠杆菌O1和O2菌株，例如O1:K1:H7或O2:K1:H4、O2:K1:H5、O2:K1:H6和O2:K1:H7鉴定为人和动物中尿道感染、败血病和新生儿脑膜炎的病原体。O1和O2血清群两者构成引起人患者中菌血症和脓毒症的大多数菌株。因此，在一个实施方案中，组合物包含包含具有式O1的糖的缀合物和包含具有式O2的糖的缀合物。

因此，通过用这些用途和方法在哺乳动物中产生免疫应答，可以保护哺乳动物免于大肠杆菌感染，包括ExPEC和非-ExPEC菌株。本发明对于提供针对致病性大肠杆菌的广泛保护特别有用，包括肠致病型，例如EPEC、EAEC、EIEC、ETEC和DAEC致病型。因此，可以保护哺乳动物免于疾病，包括，但不限于腹膜炎、肾盂肾炎、膀胱炎、心内膜炎、前列腺炎、尿道感染（UTIs）、脑膜炎（特别是新生儿脑膜炎）、脓毒症（或SIRS）、脱水、肺炎、腹泻（婴儿腹泻、旅行者腹泻、急性腹泻、持续性腹泻等）、细菌痢疾、溶血性尿毒性综合征（HUS）、心包炎、菌尿等。

在一个方面，待接种的主体是哺乳动物，例如人、猫、羊、猪、马、牛或狗。优选地，待接种的主体是人。在疫苗用于预防性用途的场合，人优选为儿童（例如，学步儿童（toddler）或婴儿）或青少年或成年人；在疫苗用于治疗用途的场合，人优选是青少年或成年人。意图用于儿童的疫苗也可以施用于成年人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。

本发明的疫苗可用于治疗儿童和成年人两者。因此，人患者可能小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选患者是上了年纪的（例如≧50岁、≧60岁且优选≧65岁）、年轻人（例如≦5岁）、住院的患者、卫生保健工作人员、武装部队和军事人员、孕妇、慢性病或免疫缺陷患者。然而，疫苗不仅仅适合于这些组，且可以在群体中更广泛地使用。

本发明的疫苗对于预计进行外科手术的患者或其他医院住院患者特别有用。它们在将要进行导管插入的患者中也有用。它们也可用于青少年女性（例如11-18岁）和患有慢性尿道感染的患者。

在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径施用。在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物通过肌内、腹膜内、皮内或皮下注射施用。在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物通过肌内或皮下注射施用。

在实施方案中，本发明涉及方法，其包括以下步骤：（i）向主体注射免疫有效量的本文定义的免疫原性组合物的任何一种；（ii）从所述主体收集血清样品；（iii）通过体外调理吞噬杀伤测定（OPA）测试所述血清样品针对大肠杆菌血清型O25B的调理吞噬杀伤活性。

主体

如本文所公开的，本文所述的免疫原性组合物可以用于预防、治疗或改善主体中的细菌感染、疾病或状况的各种治疗或预防方法。

在优选的实施方案中，所述主体是人。在最优选的实施方案中，所述主体是新生儿（即，低于三个月龄）、婴儿（即，从三个月至一岁）或学步儿童（即，从一岁至四岁）。

在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物用作疫苗。

在实施方案中，待接种的主体可以小于1岁。例如，待接种的主体可以是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个月龄。在实施方案中，待接种的主体为约2、4或6个月龄。在另一个实施方案中，待接种的主体小于2岁。例如，待接种的主体可以是约12至约15个月龄。在一些情况下，需要少至一剂根据本发明的免疫原性组合物，但是在一些情况下，可以施用第二、第三或第四剂。

在实施方案中，待接种的主体可以小于18岁。例如，待接种的主体可以是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16或约17岁。例如，待接种的主体可以是约10至约18岁。在一些情况下，需要少至一剂根据本发明的免疫原性组合物，但是在一些情况下，可以施用第二、第三或第四剂。

在另一个实施方案中，待接种的主体可以是18岁或更年长的人。例如，待接种的主体可以是约18至约50岁。在一些情况下，需要少至一剂根据本发明的免疫原性组合物，但是在一些情况下，可以施用第二、第三或第四剂。

在本发明的实施方案中，待接种的主体是50岁或更年长的人，更优选55岁或更年长的人。在实施方案中，待接种的主体是65岁或或更年长、70岁或或更年长、75岁或或更年长或80岁或或更年长的人。在实施方案中，待接种的主体是免疫妥协的个体，人。免疫妥协的个体通常被定义为对由传染原的攻击表现出减弱或降低的发动正常体液或细胞防御的能力人。

在本发明的实施方案中，待接种的免疫妥协的主体患有损害免疫系统并导致不足以保护免于或治疗尿道感染的抗体应答的疾病或状况。

在实施方案中，所述疾病是原发性免疫缺陷疾病。优选地，所述原发性免疫缺陷疾病选自联合T-和B-细胞免疫缺陷、抗体缺乏、明确的综合征（well-defined syndromes）、免疫功能障碍疾病、吞噬细胞疾病、先天免疫缺陷、自身炎性疾病（autoinflammatorydisorders）和补体缺陷中的任何一种。

在本发明的特定实施方案中，待接种的免疫妥协的主体患有选自以下中的任一种的疾病：HIV-感染、获得性免疫缺陷综合症（AIDS）、癌症、慢性心脏或肺病症、充血性心力衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬变、脊髓液渗漏（spinal fluid leaks）、心肌病、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺病（COPD）、脾功能障碍（例如镰状细胞病）、脾功能缺乏（无脾）、血液恶性肿瘤、白血病、多发性骨髓瘤、何杰金病、淋巴瘤、肾衰竭、肾病综合征和哮喘。

在本发明的实施方案中，待接种的主体患有营养不良。

在本发明的实施方案中，待接种的主体正在接受降低身体对感染的抵抗力的药物或治疗。

在本发明的实施方案中，待接种的主体是吸烟者。

在本发明的实施方案中，待接种的主体具有低于5 x 10⁹个细胞/升、或低于4 x10⁹个细胞/升、或低于3 x 10⁹个细胞/升、或低于2 x 10⁹个细胞/升、或低于1 x 10⁹个细胞/升、或低于0.5 x 10⁹个细胞/升、或低于0.3 x 10⁹个细胞/升、或低于0.1 x 10⁹个细胞/升的白细胞计数（白细胞计数）。

白细胞计数（白细胞计数）：血液中白细胞（WBC）的数目。WBC通常作为CBC（全血细胞计数）的一部分进行测量。白细胞是血液中抗感染的细胞，且与被称为红细胞的红（带氧）细胞不同。存在不同类型的白细胞，包括嗜中性粒细胞（多形核白细胞；PMN）、杆状核嗜中性细胞（稍微不成熟的嗜中性粒细胞）、T-型淋巴细胞（T-细胞）、B-型淋巴细胞（B-细胞）、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。所有类型的白细胞都反映在白细胞计数中。白细胞计数的正常范围通常是每立方毫米血液4,300至10,800个细胞。这也可以称为白细胞计数，且可以按国际单位表示为4.3 - 10.8 x 10⁹个细胞/升。

在实施方案中，待接种的主体患有嗜中性白细胞减少症。例如，待接种的主体可能具有低于2 x 10⁹个细胞/升、或低于1 x 10⁹个细胞/升、或低于0.5 x 10⁹个细胞/升、或低于0.1 x 10⁹个细胞/升、或低于0.05 x 10⁹个细胞/升的嗜中性粒细胞计数。

低白细胞计数或“嗜中性白细胞减少症”是一种状况，其特征在于循环血液中异常低水平的嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞是特殊类型的白细胞，其帮助于预防和克服感染。癌症患者经历嗜中性白细胞减少症的最常见原因是化学疗法的副作用。化学疗法诱导的嗜中性白细胞减少症增加了患者感染的危险并破坏了癌症治疗。

在实施方案中，待接种的主体具有低于500/ mm³的CD4+细胞计数、或低于300/mm³的CD4+细胞计数、或低于200/ mm³的CD4+细胞计数、低于100/ mm³的CD4+细胞计数、低于75/mm³的CD4+细胞计数、或低于50/ mm³的CD4+细胞计数。

通常将CD4细胞测试报告为按mm³的细胞数目。正常的CD4计数为500-1600，且CD8计数为375-1100。患有HIV的人中CD4计数引人注目地下降。

在本发明的实施方案中，本文公开的任何免疫妥协的主体是人男性或人女性。

方案

在一些情况下，少至一剂根据本发明的免疫原性组合物是有效的，在其他情况下，例如更大的免疫缺陷的状况，可以施用第二、第三或第四剂。初始接种后，主体可接受充分彼此隔开的一次或几次加强免疫。

在实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物的接种时间表是单剂。在另一个实施方案中，所述单剂时间表用于至少2岁的健康人。

在实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物的接种时间表是多剂时间表。在另一个实施方案中，所述多剂时间表包括相隔约1个月至约2个月的时间间隔的一系列2剂。在一个实施方案中，所述多剂时间表包括相隔约1个月的时间间隔的一系列2剂，或相隔约2个月的时间间隔的一系列2剂。

在另一个实施方案中，所述多剂时间表包括相隔约1个月至约2个月时间间隔的一系列3剂。在另一个实施方案中，所述多剂时间表包括相隔约1个月的时间间隔的一系列3剂，或相隔约2个月的时间间隔的一系列3剂。

在另一个实施方案中，所述多剂时间表包括相隔约1个月至约2个月的时间间隔的一系列3剂，再加上第一剂后约10个月至约13个月的第四剂。在另一个实施方案中，所述多剂时间表包括相隔约1个月的时间间隔的一系列3剂，再加上第一剂后约10个月至约13个月的第四剂，或相隔约2个月的时间间隔的一系列3剂，再加上第一剂后约10个月至约13个月的第四剂。

在实施方案中，多剂时间表包括在第一岁时的至少一剂（例如，1、2或3剂），再加上至少一次学步儿童剂量。

在实施方案中，多剂时间表包括从2个月龄开始相隔约1个月至约2个月的时间间隔的一系列2或3剂（例如，剂间28-56天），且再加上12至18个月龄的学步儿童剂量。在实施方案中，所述多剂时间表包括从2个月龄开始相隔约1至2个月的时间间隔的一系列3剂（例如，剂间28-56天），且再加上12至15个月龄的学步儿童剂量。在另一个实施方案中，所述多剂时间表包括从2个月龄开始相隔约2个月的时间间隔的一系列2剂，且再加上12至18个月龄的学步儿童剂量。

在实施方案中，多剂时间表包括在2、4、6和12-15个月龄的4-剂疫苗系列。

在实施方案中，在第0天给予初次剂量（prime dose），并且以范围从约2周一直到约24周的时间间隔给予一次或多次加强，优选具有4-8周的给药时间间隔。

在实施方案中，在第0天给予初次剂量，并且在约3个月后给予加强。

试剂盒和方法

在实施方案中，本发明涉及包括本文公开的免疫原性组合物和信息活页的试剂盒。

在实施方案中，所述信息活页包括组合物引出针对大肠杆菌的功能性抗体的能力。

在实施方案中，所述信息活页包括组合物在人群体中引出针对大肠杆菌血清型O25B的OPA滴度的能力。在实施方案中，所述信息活页包括组合物在人群体中引出针对大肠杆菌血清型O1的OPA滴度的能力。在实施方案中，所述信息活页包括组合物在人群体中引出针对大肠杆菌血清型O2的OPA滴度的能力。在实施方案中，所述信息活页包括组合物在人群体中引出针对大肠杆菌血清型O6的OPA滴度的能力。

在实施方案中，本发明涉及用于生产包括免疫原性组合物和信息活页的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：（i）生产本公开内容的免疫原性组合物，和（ii）在相同的试剂盒中组合所述免疫原性组合物和信息活页，其中所述信息活页记载所述组合物引出针对大肠杆菌的功能性抗体的能力。

在实施方案中，本发明涉及用于生产包括免疫原性组合物和信息活页的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：（i）生产本公开内容的免疫原性组合物，和（ii）在相同的试剂盒中组合所述免疫原性组合物和信息活页，其中所述信息活页记载所述组合物在人群体中引出针对大肠杆菌的抗-O-抗原抗体的能力。

在实施方案中，本发明涉及用于生产包括免疫原性组合物和信息活页的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：（i）生产本公开内容的免疫原性组合物，和（ii）在相同的试剂盒中组合所述免疫原性组合物和信息活页，其中所述信息活页记载所述组合物在人群体中引出针对大肠杆菌的OPA滴度的能力。

在实施方案中，本发明涉及用于生产包括免疫原性组合物和信息活页的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：（i）生产本公开内容的免疫原性组合物；（ii）打印信息活页，其中所述信息活页记载所述组合物引出针对大肠杆菌的功能性抗体的能力；（iii）在相同的试剂盒中组合所述免疫原性组合物和所述信息活页。

在实施方案中，本发明涉及用于生产包括免疫原性组合物和信息活页的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：（i）生产本公开内容的免疫原性组合物；（ii）打印信息活页，其中所述信息活页记载所述组合物在人群体中引出针对大肠杆菌的OPA滴度的能力；（iii）在相同的试剂盒中组合所述免疫原性组合物和所述信息活页。

实施例

为了可以更好地理解本发明，陈述以下实施例。这些实施例仅为了举例说明起见，且不解释为以任何方式限制本发明的范围。以下实施例举例说明了本发明的一些实施方案。

实施例1：大肠杆菌和肠沙门氏菌菌株

表3中列举了临床菌株和衍生物。额外的参考菌株包括：O25K5H1，临床O25a血清型菌株；和肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型菌株LT2。

构建了去除了靶向的可读框但留下了短的scar序列的大肠杆菌菌株中的基因敲除。

为简单起见，水解的O-抗原链和核心糖随后表示为O-多糖（OPS）。

实施例2：用于wzzB、fepE和O-抗原基因簇克隆的寡核苷酸引物

表4寡核苷酸引物

实施例3：质粒

在表5中列举了质粒载体和亚克隆。从纯化的基因组DNA中扩增带有各种大肠杆菌和沙门氏菌属wzzB和fepE基因的PCR片段，并将其亚克隆到Invitrogen PCR®Blunt克隆试剂盒图1中提供的高拷贝数质粒中。所述质粒基于pUC复制子。引物P3和P4用于扩增具有其天然启动子大肠杆菌wzzB基因，并被进行设计以分别与编码UDP-葡糖-6-脱氢酶和磷酸核糖腺嘌呤核苷酸水解酶的近侧和远侧基因中的区域结合（在Genbank MG1655 NC_000913.3中注释的）。使用以前描述的引物扩增含有沙门氏菌属fepE基因和启动子的PCR片段。基于可用的Genbank基因组序列或内部产生的全基因组数据（在GAR2401和 O25K5H1的情况下），设计类似的大肠杆菌fepE引物。低拷贝数质粒pBAD33用于在阿拉伯糖启动子的控制下表达O-抗原生物合成基因。首先对质粒进行了修饰，以促进使用与5'启动子和3' 6-磷酸葡糖酸脱氢酶（gnd）基因同源的通用引物扩增的长的PCR片段的克隆（通过Gibson方法）表5。含有Q25b生物合成操纵子的pBAD33亚克隆在图1中具体说明。

表5

质粒

实施例4：O-抗原纯化

发酵培养液用乙酸处理至1-2％的终浓度（4.1的最终pH）。通过将酸处理的培养液加热至100℃达2小时，来实现OAg的提取和去脂作用。酸水解结束时，将所述批冷却至环境温度，并添加14％NH₄OH至6.1的最终pH。离心中和的培养液并收集离心分离液（centrate）。向所述离心分离液中添加在磷酸钠中的CaCl₂，并将所得到的浆液于室温温育30分钟。通过离心除去固体，并使用10kDa膜将离心分离液浓缩12-倍，继之以针对水的两次渗滤。然后使用碳过滤器纯化含有OAg的保留物（retentate）。将碳滤液用4.0M硫酸铵1:1（v/v）稀释。最终硫酸铵浓度为2M。使用2M硫酸铵作为运行缓冲液用膜进一步纯化硫酸铵处理的碳滤液。在流通物（flow through）中收集OAg。对于长的OAg，将HIC滤液浓缩，且然后使用5kDa膜针对水进行缓冲液更换（20透析体积（diavolumes））。对于短的（天然）OAg多糖，进一步降低MWCO以提高得率。

实施例5：O25b长O-抗原与CRM₁₉₇的缀合

第一组长链O25b多糖-CRM₁₉₇缀合物使用高碘酸氧化继之以使用还原性胺化化学（RAC）的缀合进行生产（表7）。通过改变氧化水平，缀合变体具有三种活化水平（低、中和高）。通过使用氰基氢硼化钠作为还原剂，使在DMSO介质中重构的冻干的活化的多糖与冻干的CRM₁₉₇反应产生缀合物。于23℃进行缀合反应达24小时，继之以使用氢硼化钠封端3小时。缀合猝灭步骤后，使用5mM琥珀酸盐/0.9% NaCl，pH 6.0，用100K MWCO再生的纤维素膜通过超滤/渗滤来纯化缀合物。使用0.22 µm膜进行缀合物的最终过滤。

除非另有明确说明，否则贯穿以下实施例公开的缀合物包含核心糖部分。

1.1. 异源聚合酶链长调节物赋予的长O-抗原表达

最初的大肠杆菌菌株构建集中于O25血清型。目的是超表达异源wzzB或fepE基因，以查看它们是否赋予O25 wzzB基因敲除菌株中更长的链长。首先，通过PCR筛选血液分离物以鉴定O25a和O25b亚型的菌株。下一步，对菌株进行对氨苄青霉素的敏感性的筛选。鉴定了单个氨苄青霉素敏感性O25b分离菌GAR2401，其中引入了wzzB缺失。类似地，在O25a菌株O25K5H1中进行了wzzB缺失。对于对这些突变的遗传互补，将来自GAR 2401和O25K5H1的wzzB基因亚克隆到高拷贝PCR-Blunt II克隆载体中，并通过电穿孔法将其引入两个菌株中。类似地克隆并转移来自大肠杆菌K-12和肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型LT2的额外的wzzB基因；同样，来自大肠杆菌O25K5H1、GAR 2401、O25a ETEC NR-5、O157:H7:K-和肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型LT2的fepE基因。

wzzB敲除菌株O25K5H1（O25a）和GAR2401（O25b）的质粒转化体中LPS表达的遗传互补显示在图2中。细菌在LB培养基中生长过夜，且LPS用酚提取，通过SDS PAGE（4-12％丙烯酰胺）分离并染色。凝胶的每个孔都装载有从相同数目的细菌细胞（约2 OD₆₀₀单位）提取的LPS。LPS的大小是根据内部天然大肠杆菌LPS标准物并通过计数从显示宽的链长分布（相差一个重复单元）的样品亚群中可辨别的梯来估计的。在图3的图A的左侧上，显示了O25aO25K5HΔwzzB的质粒转化体的LPS概况；且在右边，O25b GAR 2401ΔwzzB转化体的相似概况。用O25-特异性血清探测的复制凝胶的免疫印迹显示在图3的图B中。

来自所述实验的结果表明，将同源wzzB基因引入大肠杆菌O25aΔwzzB宿主恢复了短O25 LPS（10-20x）的表达，沙门氏菌属LT2 wzzB也如此。引入来自GAR2401的O25b wzzB基因则不，从而提示来自所述菌株的WzzB酶是缺陷的。大肠杆菌WzzB氨基酸序列的比较提示可能是A210E和P253S取代引起的。重要的是，沙门氏菌属LT2 fepE和来自O25a O25K5H1的大肠杆菌fepE赋予了表达非常长（VL）OAg LPS的能力，而沙门氏菌属LT2 fepE导致大小超过了由大肠杆菌fepE赋予的大小的OAg。

用GAR2401ΔwzzB转化体观察到相似的表达模式：大肠杆菌O25a或K12菌株wzzB恢复了产生短LPS的能力。沙门氏菌属LT2 fepE产生最长的LPS，大肠杆菌fepE产生稍微更短的LPS，而沙门氏菌属LT2 wzzB产生中间大小的长LPS（L）。在用大肠杆菌O25aΔwzzB的转化体的独立实验中评估了其他大肠杆菌fepE基因产生非常长LPS的能力。来自GAR2401、O25aETEC菌株和产生O157志贺氏菌属（Shigella）毒素的菌株的fepE基因也赋予了产生非常长但不与由沙门氏菌属LT2 fepE产生的LPS一样长的LPS的能力（图4）。FepE氨基酸序列的比对在图5中示出。

在血清型O25a和O25b菌株中确立了沙门氏菌属LT2 fepE产生所评价的聚合酶调节物的最长LPS后，我们紧接着试图确定其是否将在其他大肠杆菌血清型中产生非常长的LPS。用沙门氏菌属fepE质粒转化O1、O2、O6、O15和O75血清型的野生型菌血症分离菌，并提取LPS。示于图6中的结果证实沙门氏菌属fepE可以赋予在与血液感染有关的其他流行血清型中产生非常长的LPS的能力。结果还表明，基于质粒的沙门氏菌属fepE的表达看来似乎超过了由内源wzzB在这些菌株中正常施加的链长控制。

1.2. 在共同的大肠杆菌宿主菌株中O-抗原的基于质粒的表达。

从生物加工开发的观点来看，在共同的大肠杆菌宿主而不是多种菌株中产生不同血清型的O-抗原的能力将大大简化各个抗原的生产。为此，通过PCR扩增了来自不同血清型的O-抗原基因簇，并将其克隆到在阿拉伯糖调节的启动子控制下的低拷贝数质粒（pBAD33）中。所述质粒与大肠杆菌中的沙门氏菌属LT2 fepE质粒相容（可以共存），这是因为它带有不同的（p15a）复制子和不同的选择标记（氯霉素对卡那霉素）。在第一个实验中，将pBAD33O25b操纵子质粒亚克隆与沙门氏菌属LT2 fepE质粒共转染到GAR2401ΔwzzB中，且转化体在有或没有0.2％阿拉伯糖的情况下生长。示于图7中的结果证明以阿拉伯糖依赖性方式产生了非常长的O-抗原LPS。

类似地评价了从其他血清型克隆的O-抗原基因簇，且结果示于图8中。沙门氏菌属LT2 fepE和pBAD33-OAg质粒的共表达导致可检测到的对应于O1、O2（对于四个克隆中的两个）、O16、O21和O75血清型的长链LPS。由于未知的原因，pBAD33-O6质粒未能在测试的所有四种分离菌中产生可检测的LPS。尽管表达水平是可变的，但是结果表明在共同的宿主中表达长链O-抗原是可行的。然而，在一些情况下，可能需要进一步最优化以改善表达，例如通过修饰质粒启动子序列。

来自具有或不具有沙门氏菌属LT2 fepE质粒的不同血清型O25大肠杆菌菌株的LPS概况显示在图11中。研究了两种菌株的O-抗原的发酵、提取和纯化：GAR2831，用于生产天然的短O25b OAg；和GAR2401ΔwzzB/fepE，用于生产长O25b OAg。示于图11的SDS-PAGE凝胶中的相应的短和长形式LPSs以红色突出显示。用乙酸直接从发酵的细菌中提取多糖并纯化。纯化的短和长或非常长的O25b多糖的尺寸排阻层析谱显示在图12中。将两个批次的短多糖（来自GAR2831）的性质与单个非常长的多糖制剂（来自菌株GAR2401ΔwzzB/fepE）进行比较。长O-抗原的分子量是短O-抗原的3.3-倍，且重复单元数目估计为〜65（非常长）对〜20。参见表6。

表6

使用常规还原性胺化方法将非常长的O25b O-抗原多糖与白喉类毒素CRM₁₉₇缀合。制备了具有不同高碘酸活化程度的三种不同批次的复合糖：中（5.5％）、低（4.4％）和高（8.3％）。显示所得到的制剂和未缀合的多糖没有内毒素污染）（表7）。

根据图13A中所示的时间表，四只兔（新西兰白（New Zealand White）雌性）的组各自接种10 mcg的复合糖和20 mcg的QS21佐剂，并进行血清取样（VAC-2017-PRL-EC-0723）。值得注意的是，在细菌复合糖的评价中，10 mcg的剂量处于通常给予兔的范围的下限（20-50 mcg是更典型的）。在独立的研究（VAC-2017-PRL-GB-0698）中，也使用相同剂量（10 mcg多糖+ 20 mcg QS21佐剂）和相同的施用时间表，用未缀合的多糖对一组兔进行了接种。

在LUMINEX测定中评价了对三种O25b复合糖制剂的兔抗体应答，其中羧基珠被用未缀合的O25b长多糖预结合的甲基化人血清清蛋白包被。用藻红蛋白（PE）标记的抗-IgG第二抗体检测血清样品中O25b-特异性IgG抗体的存在。在应答最好的兔（四只一组的每组一只）中第0周（免疫前）、第6周（给药后2，PD2）、第8周（给药后3，PD3）和第12周（给药后4，PD4）采样的血清中观察到的免疫应答概况显示于图14中。在12只兔的任一只中均没有检测到显著的免疫前血清IgG滴度。相反，在来自所有三个组中的兔的接种后血清中均检测到O25b抗原特异性抗体应答，而低活化复合糖组应答趋向于略高于中或高活化复合糖组。在给药后3时间点观察到最大应答。低活化组中的一只兔和来自高活化组的一只兔未能对接种起反应（无反应者）。

为了评估CRM₁₉₇载体蛋白缀合对长O25b OAg多糖的免疫原性的影响，将来自用未缀合的多糖接种的兔的血清中抗体的存在与来自用低活化CRM₁₉₇复合糖接种的兔的血清进行比较图15。显著地，游离多糖不是免疫原性的，与免疫前血清比较在免疫中实际上不引出IgG应答（图A）。相反，在来自用跨过一系列血清稀度（从1:100到1:6400）的O25b OAg-CRM₁₉₇接种的四只兔中的三只的PD4血清中观察到约为免疫前血清水平的十倍的O25b OAg-特异性IgG平均荧光强度值（MFIs）。这些结果证明载体蛋白缀合对于在10 mcg剂量水平产生针对O25b OAg多糖的IgG抗体的必要性。

将在TSA平板上生长的细菌悬浮在PBS中，调整为2.0的OD₆₀₀，并固定在PBS中的4％低聚甲醛中。在4％BSA/PBS中封闭1小时后，将细菌与免疫前和PD3免疫血清在2％BSA/PBS中的连续稀释物一起温育，并用PE-标记的第二F(ab)抗体检测结合的IgG。

在用完整细菌的流式细胞术实验中证明了由O25b OAg-CRM₁₉₇引出的O25b抗体的特异性。在Accuri流式细胞仪中，用PE-缀合的F(ab')₂片段山羊抗兔IgG检测IgG与全细胞的结合。

如图16中所示的，免疫前兔抗体未能结合野生型血清型O25b分离菌GAR2831和GAR2401或K-12大肠杆菌菌株，而匹配的PD3抗体以浓度依赖性方式染色O25b细菌。缺乏表达OAg能力的阴性对照K-12菌株仅显示出非常弱的PD3抗体的结合，这很可能归因于其表面上存在暴露的内部核心寡糖表位。将沙门氏菌属fepE质粒引入野生型O25b分离菌中导致显著增强的染色，这与较长的OAg多糖提供的更高的免疫原性表位密度一致。

结论：描述的结果表明，沙门氏菌属fepE不仅是沙门氏菌属物种中非常长的O-抗原多糖的决定子，而且其还可以赋予不同O-抗原血清型的大肠杆菌菌株生产非常长的OAgs的能力。可以利用所述性质，以通过促进纯化和化学缀合至合适的载体蛋白，以及通过形成更高分子量的复合体潜在地增强免疫原性，来生产具有改进的用于生物加工开发的性质的O-抗原疫苗多糖。

实施例6：最初的兔研究产生了第一多克隆抗体试剂和对RAC O25b OAg-CRM₁₉₇的IgG应答

长链O25b多糖- CRM₁₉₇缀合物是使用高碘酸氧化继之以使用还原性胺化化学（RAC）的缀合来生产的（表7）。也参见表17。

表7

在兔研究1（VAC-2017-PRL-EC-0723）中（也在上面的实施例5中进行了描述）-在10ug的L-、M-或H-活化RAC（+ QS21）的情况下五（5）只兔/组根据图13A中所示的时间表接受组合物。在随后的兔研究（VAC-2017-PRL-GB-0698）中，观察到未缀合的游离O25b多糖不是免疫原性的（参见图18）。

在兔研究2（VAC-2018-PRL-EC-077）中-在L-RAC（AlOH₃、QS21或没有佐剂）的情况下2只兔/组根据图13B中所示的时间表接受组合物。

兔4-1、4-2、5-1、5-2、6-1和6-2接受在实施例5中所述的非常长的未缀合的O25b多糖，且测试第18周血清。

更具体地，将包含50 ug未缀合的O25b、100 ug AlOH₃佐剂的组合物施用于兔4-1。将包含50 ug未缀合的O25b、100 ug AlOH₃佐剂的组合物施用于兔4-2。将包含50 ug未缀合的O25b、50 ug QS-21佐剂的组合物施用于兔5-1。将包含50 ug未缀合的O25b、50 ug QS-21佐剂的组合物施用于兔5-2。将包含50 ug未缀合的O25b、无佐剂的组合物施用于兔6-1。将包含50 ug未缀合的O25b、无佐剂的组合物施用于兔6-2。

实施例7：用O25b RAC缀合物进行的兔研究：dLIA血清稀释滴度

兔研究2（VAC-2018-PRL-EC-077）O25b dLIA血清稀释滴度对来自研究1（VAC-2017-PRL-EC-0723）的应答最好的兔。对于这些实验，执行改良的直接结合Luminex测定，其中将O25b长的O-抗原的聚赖氨酸缀合物被动吸附到Luminex羧基珠上，而不是以前描述的甲基化的血清清蛋白长的O-抗原混合物。聚赖氨酸-O25b缀合物的使用提高了测定的灵敏度和IgG浓度依赖性应答的质量，从而允许通过使用曲线拟合（四参数非线性方程式）测定血清稀释滴度。将来自第一次研究的最高滴度兔血清中的O25b IgG滴度与来自表8中第二次研究兔的血清进行了比较。

表8

在第二次兔研究中较高的剂量（50/20ug对10ug）不改善IgG滴度。

两个月的休息加强IgG应答（在较短的时间间隔的情况下未观察到）。

与QS21或无佐剂相比，明矾看来似乎增强兔中的IgG应答。

确立了以小兔补体（BRC）和HL60细胞作为嗜中性粒细胞来源的调理吞噬测定（OPA），以测量O-抗原复合糖的功能性免疫原性。大肠杆菌GAR2831的预先冷冻的（Pre-frozen）细菌原种于37℃在LB（LB）培养基中生长。将细胞沉淀，并在补加有20％甘油的PBS中悬浮至每毫升1 OD₆₀₀单位的浓度并冷冻。将预先滴定的（Pre-titered）解冻的细菌在含1％明胶的HBSS（Hank氏平衡盐溶液）中稀释至0.5X 10⁵ CFU/ml，且将10 µL（10³ CFU）在U-形底组织培养微量培养板中与20 µL连续稀释的血清组合，并将混合物在5％CO₂培养箱中于37℃以700 rpm BELLCO摇动器（Shaker））摇动30分钟。将10 µl的2.5％补体（小兔血清（Baby Rabbit Serum），PEL-FREEZ 31061–3，在HBG中预稀释）和20 µL HL-60细胞（0.75X10⁷ /ml）和40 µL HBG添加到U-形底组织培养微量培养板，并将混合物在5％CO₂培养箱中于37℃以700 rpm BELLCO摇动器）摇动45分钟。接着，将各100 µL反应中的10 µL转移到通过应用100 µL水、真空过滤且应用150 µL 50％LB制备的预先润湿的MILLIPOREMULTISCREENHTS HV滤板的相应孔中。将滤板真空过滤，并在5％CO₂培养箱中于37℃温育过夜。在第二天，使用IMMUNOSPOT®分析仪和IMMUNOCAPTURE软件，用考马斯（COOMASSIE）染料和脱色（Destain）溶液固定、染色和脱色后，对菌落进行计数。为了确立OPA活性的特异性，将免疫血清在与OPA反应中的其他测定组分组合之前与100 µg/mL纯化的长O25b O-抗原进行预温育。OPA测定包括无HL60细胞或补体的情况下的对照反应，以证明任何观察到的杀伤对这些组分的依赖性。

在测定中评价了来自来自两个兔研究的代表性兔的匹配的免疫前和接种后的血清样品，并测定了血清稀释滴度（表9，图19A-B）。与未缀合的O25b长O-抗原多糖的预温育阻断杀细菌活性，从而证明OPA的特异性（图19C）。表9 OPA滴度

兔2-3如下给药：兔2-3给药：10/10/10/10ug RAC缀合物+ QS21，给药后（PD）4放血。兔1-2如下给药：50/20/20/20ug RAC缀合物+ Al(OH)3，PD4放血。

实施例8：由未缀合的O25b长O-抗原多糖和衍生的O25b RAC/DMSO长O-抗原复合糖引出的O-抗原O25b IgG水平。

在第0、5和13周通过用0.2或2.0 µg /动物的O25b RAC/DMSO长O-抗原复合糖皮下注射对十只CD-1小鼠的组进行给药，而在第3周（给药后1，PD1）、第6周（给药后2，PD2）和第13周（给药后3，PD3）时间点进行放血用于免疫原性测试。通过以O25b-特异性小鼠mAb作为内标的定量Luminex测定（参见实施例7中的细节）测定抗原特异性IgG的水平。在从20x随机选择的未接种的小鼠合并的血清中确定基线IgG水平（虚线）。游离的未缀合的O25b长O-抗原多糖免疫原在任何时间点均不诱导高于基线水平的IgG。相反，在两剂O25b-CRM197 RAC长缀合物复合糖后，观察到IgG应答：截止PD3观察到增强的均匀IgG应答，而在PD2处为中间和更可变的IgG水平。GMT IgG值（ng/ml）用95％CI误差棒（error bar）表示。参见图20。

实施例9：O25b小兔补体（BRC）OPA的特异性。A-B）来自兔2-3和1-2的O25b RAC/DMSO长O-抗原免疫后血清（但非匹配的免疫前对照血清）显示出杀细菌OPA活性。C）通过与100µg/mL长的O-抗原O25b多糖预温育来阻断来自兔1-2的免疫血清的OPA活性。将菌株GAR2831细菌与HL60s、2.5％BRC和血清的连续稀释物于37℃温育1小时，并通过在滤板上计数小菌落（CFUs）计数存活的细菌。参见图19。

实施例10：RAC和eTEC O25b长复合糖比单端复合糖更具免疫原性。用碳青霉烯抗性的氟喹诺酮（fluoroquinlone）抗性的MDR菌株Atlas187913的BRC OPA测定。根据与图21中所示相同的时间表，将20只CD-1小鼠的组用2µg复合糖接种，且在给药后2（PD2）（图A）和给药后3（PD3）（图B）时间点测定OPA应答。棒表示具有95％CI的GMTs。显示了高于未接种的基线的反应者比例。使用具有Welch氏校正的未配对的t-检验（Graphpad Prism）对来自不同组的对数变换的数据进行评价，以评估差异是否在统计学上显著。结果总结在表10中。参见图21。在用2 µg eTEC O1a长复合糖接种的小鼠中，观察到针对O1a，PD2和PD3的OPA滴度（数据未显示）分别大于针对O25b，PD2和PD3的OPA滴度，示于表10中。

表10

实施例11：eTEC化学的OPA免疫原性可通过改变多糖活化水平来改善。用碳青霉烯抗性的氟喹诺酮抗性的MDR菌株Atlas187913的BRC OPA测定。将20只CD-1小鼠的组用0.2µg或2µg所示的长O25b eTEC复合糖接种，且在PD2时间点测定OPA应答。使用具有Welch氏校正的未配对的t-检验（Graphpad Prism）对来自4％活化对17％活化组的合计的对数变换的数据进行评价，以证实在OPA应答中的差异在统计学上显著。对于各个组的GMTs和反应者比例总结在表11中。参见图22。

表11

实施例12：攻击研究表明，长的大肠杆菌O25b eTEC缀合物在三剂后引出保护。根据指示的时间表用2µg剂量免疫的20x CD-1小鼠的组用1 x 10⁹的菌株GAR2831的细菌进行IP攻击。后来的存活被监控六天。用以4％、10％或17％水平活化的eTEC复合糖接种的小鼠组被保护免受致死感染，而未接种的对照小鼠或用2µg未缀合的O25b长多糖接种的小鼠则没有。参见图23。

实施例13：用于制备eTEC连接的复合糖的方法

糖的活化和用胱胺二盐酸化物的硫醇化。糖在无水二甲基亚砜（DMSO）中重构。溶液的水分含量通过Karl Fischer（KF）分析测定，并调整为达到0.1和1.0％的水分含量，一般0.5％。

为了起始活化，以在DMSO中100 mg/mL的浓度新鲜制备1,1'-羰基-二-1,2,4-三唑（CDT）或1,1'-羰基二咪唑（CDI）的溶液。用各种量的CDT/CDI（1-10摩尔当量）活化糖，并使反应于室温（rt）或35℃进行1-5小时。添加水以猝灭活化反应溶液中任何残留的CDI/CDT。进行计算以确定添加的水量，并使最终的水分含量为总含水（aqueous）的2-3％。使反应于室温进行0.5小时。胱胺二盐酸化物是在无水DMSO中以50 mg/mL的浓度新鲜制备的。活化的糖与1-2摩尔当量（mol. eq.）的胱胺二盐酸化物反应。另一方面，活化的糖与1-2摩尔当量的半胱胺盐酸化物反应。使硫醇化反应于室温进行5-20小时，以产生硫醇化的糖。硫醇化水平由添加的CDT/CDI量确定。

活化的硫醇化的糖的还原和纯化。向硫醇化的糖反应混合物添加3-6摩尔当量的三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶液，并使其于室温进行3-5小时。然后通过添加至预先冷却的10mM磷酸二氢钠中将反应混合物稀释5-10-倍，并通过5µm过滤器过滤。针对30-40-倍透析体积的预先冷却的10 mM磷酸二氢钠，对硫醇化的糖进行渗滤。获得活化的硫醇化的糖保留物的等分部分以确定糖浓度和硫醇含量（Ellman）测定。

溴乙酰化的载体蛋白的活化和纯化。通过与溴乙酰化剂如溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（BAANS）、溴乙酰溴或另一种合适的试剂反应，将载体蛋白的游离氨基基团溴乙酰化。

在活化之前，首先将载体蛋白（在0.1M磷酸钠，pH 8.0±0.2中）保持于8±3℃、约pH 7。向蛋白溶液中，以0.25-0.5 BAANS:蛋白（w/w）的比例添加作为原液二甲基亚砜（DMSO）溶液的溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯（BAANS）（20 mg/mL）。将反应于5±3℃温和地混合30-60分钟。所得到的溴乙酰化的（活化的）蛋白例如通过使用10 mM磷酸盐（pH 7.0）缓冲液使用10 kDa MWCO膜通过超滤/渗滤来纯化。纯化后，通过劳里蛋白测定估计溴乙酰化的载体蛋白的蛋白浓度。

活化程度通过与抑制导电性检测（离子层析）偶联的离子交换液相层析通过总溴化物测定进行确定。活化的溴乙酰化的蛋白上结合的溴化物从测定样品制剂中的蛋白切割，并与可能存在的任何游离溴化物一道定量。通过在碱性2-巯基乙醇中加热样品，通过转化为离子溴化物，来释放蛋白上任何剩余的共价结合的溴。

溴乙酰化的CRM₁₉₇的活化和纯化。将CRM₁₉₇用10 mM磷酸盐缓冲的0.9％NaCl pH 7（PBS）以及此外用1 M储备溶液制成的0.1 M NaHCO₃ pH 7.0稀释至5 mg/mL。使用20 mg/mLDMSO的BAANS储备溶液以CRM₁₉₇:BAANS比例1:0.35（w:w）添加BAANS。将反应混合物于3℃至11℃温育30分钟-1小时，然后通过使用10K MWCO膜和10mM磷酸钠/0.9％NaCl，pH 7.0的超滤/渗滤来纯化。通过劳里测定来测定纯化的活化的CRM₁₉₇，以确定蛋白浓度，且然后用PBS稀释至5 mg/mL。将蔗糖添加至5％wt/vol作为冷冻保护剂，并将活化的蛋白冷冻并贮藏于-25℃，直到需要缀合为止。

CRM₁₉₇的赖氨酸残基的溴乙酰化非常一致，从而导致来自39个可用的赖氨酸的15至25个赖氨酸的活化。所述反应产生高得率的活化的蛋白。

活化的硫醇化的糖与溴乙酰化的载体蛋白的缀合。接着添加溴乙酰化的载体蛋白和活化的硫醇化的糖。糖/蛋白输入比例为0.8±0.2。用1 M NaOH溶液将反应pH调节至9.0±0.1。使缀合反应于5℃进行20±4小时。

残留的反应性官能团的封端。载体蛋白上未反应的溴乙酰化的残基通过与2摩尔当量的作为封端试剂的N-乙酰-L-半胱氨酸于5℃反应3-5小时来猝灭。残留的游离巯基基团被4摩尔当量的碘乙酰胺（IAA）于5℃封端20-24小时。

eTEC-连接的复合糖的纯化。缀合反应（IAA-封端后的）混合物通过0.45 µm过滤器过滤。复合糖的超滤/渗滤是针对5 mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH 6.0进行的。然后将复合糖保留物通过0.2 µm过滤器过滤。获得复合糖的等分部分用于测定。剩余的复合糖贮藏于5℃。参见表14、表15、表16、表17和表18。

实施例14：大肠杆菌O25B ETEC缀合物的制备

活化过程-大肠杆菌-O25b脂多糖的活化。冻干的大肠杆菌-O25b多糖在无水二甲基亚砜（DMSO）中重构。冻干的O25b/DMSO溶液的水分含量通过Karl Fischer（KF）分析测定。通过向O25b/DMSO溶液中添加WFI将水分含量调整为达到0.5％的水分含量。

为了起始活化，在DMSO溶液中新鲜制备1,1'-羰基二咪唑（CDI）为100 mg/mL。在硫醇化步骤之前，用各种量的CDI活化大肠杆菌-O25b多糖。CDI反应于室温或35℃进行1-3小时。添加水以猝灭活化反应溶液中任何残留的CDI。进行计算以确定添加的水量，并使最终的水分含量为总含水（aqueous）的2-3％。使反应于室温进行0.5小时。

活化的大肠杆菌-O25b多糖的硫醇化。胱胺二盐酸化物是在无水DMSO中新鲜制备的，且将1-2摩尔当量的胱胺二盐酸化物添加到活化的多糖反应溶液中。使反应于室温进行20±4小时。

活化的硫醇化的大肠杆菌-O25b多糖的还原和纯化。向硫醇化的糖反应混合物添加3-6摩尔当量的三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶液，并使其于室温进行3-5小时。然后通过添加至预先冷却的10 mM磷酸二氢钠中将反应混合物稀释5-10-倍，并通过5µm过滤器过滤。用5KMWCO超滤器膜盒针对40-倍透析体积的预先冷却的10 mM磷酸二氢钠，对硫醇化的糖进行渗滤。获得硫醇化的O25b多糖保留物用于糖浓度和硫醇（Ellman）测定两者。在图25A中提供了活化过程的流程图）。

缀合过程-硫醇化的大肠杆菌-O25b多糖与溴乙酰化的CRM₁₉₇的缀合。CRM₁₉₇载体蛋白通过溴乙酰化被独立活化，如实施例13中所述的，且然后与活化的大肠杆菌-O25b多糖反应用于缀合反应。在反应容器中将溴乙酰化的CRM₁₉₇和硫醇化的O25b多糖混合在一起。糖/蛋白输入比例为0.8±0.2。将反应pH调节至8.0-10.0。使缀合反应于5℃进行20±4小时。

溴乙酰化的CRM₁₉₇和硫醇化的大肠杆菌-O25b多糖上的反应基团的封端。CRM₁₉₇蛋白上未反应的溴乙酰化的残基通过与2摩尔当量的N-乙酰-L-半胱氨酸于5℃反应3-5小时来封端，继之以用4摩尔当量的碘乙酰胺（IAA）于5℃将硫醇化的O25b-多糖的任何残留的游离巯基基团封端20-24小时。

eTEC-连接的大肠杆菌-O25b复合糖的纯化。缀合溶液通过0.45 µm或5 µm过滤器过滤。O25b复合糖的渗滤用100K MWCO超滤器膜盒进行。渗滤是针对5 mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH 6.0进行的。然后将大肠杆菌-O25b复合糖100K保留物通过0.22 µm过滤器过滤并贮藏于5℃。

图25B中提供了缀合过程的流程图。

结果

表12中显示了几批大肠杆菌-O25b eTEC复合糖的反应参数和表征数据。用胱胺二盐酸化物的CDI活化-硫醇化产生了具有41至92％的糖得率和<5至14％游离糖的复合糖。也参见表14、表15、表16、表17和表18。

表12 大肠杆菌-O25b eTEC缀合物的实验参数和表征数据

实施例15：制备大肠杆菌O-抗原多糖-CRM197 eTEC缀合物的程序（适用于来自大肠杆菌血清型O25b、O1a、O2和O6的O-抗原

多糖的活化。

大肠杆菌O-抗原多糖在无水二甲基亚砜（DMSO）中重构。为了起始活化，将各种量的1,1'-羰基二咪唑（CDI）（1-10摩尔当量）添加到多糖溶液，并使反应于室温或35℃进行1-5小时。然后，添加水（2-3％，v/v）以猝灭活化反应溶液中任何残留的CDI。使反应于室温进行0.5小时后，添加1-2摩尔当量的胱胺二盐酸化物。使反应于室温进行5-20小时，且然后用3-6摩尔当量的三(2-羧乙基)膦（TCEP）处理，以产生硫醇化的糖。硫醇化水平由添加的CDI量确定。

然后通过添加至预先冷却的10 mM磷酸二氢钠中将反应混合物稀释5-10-倍，并通过5µm过滤器过滤。针对30-40-倍透析体积的预先冷却的10 mM磷酸二氢钠，对硫醇化的糖进行渗滤。获得活化的硫醇化的糖保留物的等分部分以确定糖浓度和硫醇含量（Ellman）测定。

载体蛋白（CRM₁₉₇）的活化

在活化之前，首先将CRM₁₉₇（在0.1M磷酸钠，pH 8.0±0.2中）保持于8±3℃、约pH8。向蛋白溶液中，以0.25-0.5 BAANS:蛋白（w/w）的比例添加作为原液二甲基亚砜（DMSO）溶液的溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯（BAANS）（20 mg/mL）。将反应于5±3℃温和地混合30-60分钟。所得到的溴乙酰化的（活化的）蛋白例如通过使用10 mM磷酸盐（pH 7.0）缓冲液使用10 kDa MWCO膜通过超滤/渗滤来纯化。纯化后，通过劳里蛋白测定估计溴乙酰化的载体蛋白的蛋白浓度。

缀合

接着将活化的CRM₁₉₇和活化的大肠杆菌O-抗原多糖添加到反应器中并混合。糖/蛋白输入比例为1±0.2。用1 M NaOH溶液将反应pH调节至9.0±0.1。使缀合反应于5℃进行20±4小时。载体蛋白上未反应的溴乙酰化的残基通过与2摩尔当量的作为封端试剂的N-乙酰-L-半胱氨酸于5℃反应3-5小时来猝灭。残留的游离巯基基团被4摩尔当量的碘乙酰胺（IAA）于5℃封端20-24小时。然后，反应混合物使用针对5 mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH 6.0进行的超滤/渗滤进行纯化。然后将纯化的缀合物通过0.2 µm过滤器过滤。参见表14、表15、表16、表17和表18。

实施例16：一般程序-通过还原性胺化化学（RAC）的O-抗原（来自大肠杆菌血清型O1、O2、O6、25b）多糖的缀合

在二甲基亚砜中的缀合（RAC/DMSO）

活化多糖

通过序贯添加计算的量的500 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）和注射用水（WFI），在100mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0±0.2）中进行多糖氧化，以产生2.0 g/L的最终多糖浓度。如果需要，则将反应pH调节至约pH 6.0。pH调节后，将反应温度冷却至4℃。通过添加约0.09-0.13摩尔当量的高碘酸钠来起始氧化。氧化反应于5±3℃进行约20±4小时。

使用5K MWCO超滤盒对活化的多糖进行浓缩和渗滤。针对20-倍透析体积的WFI进行渗滤。然后将纯化的活化的多糖贮藏于5±3℃。纯化的活化的糖尤其通过下述进行表征：（i）通过比色法测定的糖浓度；（ii）通过比色法测定的醛浓度；（iii）氧化程度；和（iv）通过SEC-MALLS的分子量。

将活化的多糖与蔗糖赋形剂配合并冻干

将活化的多糖与蔗糖配合至每克活化的多糖25克蔗糖的比例。然后将配合的混合物的瓶冻干。冻干后，将含有冻干的活化的多糖的瓶贮藏于-20±5℃。将计算的量的CRM₁₉₇蛋白进行壳体冷冻（shell-frozen）并独立冻干。将冻干的CRM₁₉₇贮藏于-20±5℃。

重构冻干的活化的多糖和载体蛋白

将冻干的活化的多糖在无水二甲基亚砜（DMSO）中重构。多糖完全溶解后，将等量的无水DMSO添加到冻干的CRM₁₉₇用于重构。

缀合和封端

在起始用氰基氢硼化钠的缀合之前，在反应容器中将重构的活化的多糖与重构的CRM₁₉₇组合，继之以充分混合以获得澄清溶液。反应溶液中的最终多糖浓度为约1 g/L。通过向反应混合物中添加0.5-2.0 MEq的氰基氢硼化钠并于23±2℃温育20-48小时来起始缀合。通过添加2 MEq的氢硼化钠（NaBH₄）以封端未反应的醛来终止缀合反应。所述封端反应于23±2℃继续3±1小时。

纯化缀合物

将缀合物溶液用冷的5 mM琥珀酸盐-0.9％盐水（pH 6.0）1:10稀释，以备通过使用100-300K MWCO膜的切向流过滤进行纯化。

使稀释的缀合物溶液通过5μm过滤器，并使用5 mM琥珀酸盐/0.9%盐水（pH 6.0）作为介质进行渗滤。渗滤完成后，将缀合物保留物通过0.22μm的过滤器转移。将缀合物进一步用5 mM琥珀酸盐/0.9%盐水（pH 6）稀释至约0.5 mg/mL的靶糖浓度。另一方面，通过使用100-300K MWCO膜的切向流过滤，使用20 mM组氨酸-0.9％盐水（pH 6.5）纯化缀合物。完成最后的0.22μm过滤步骤以获得免疫原性缀合物。参见表14、表15、表16、表17和表18。

实施例17：在水性缓冲液中的缀合（RAC/水性），如适用于大肠杆菌血清型O25B、O1A、O2和O6的

以与基于DMSO的缀合相同的方式进行多糖活化和渗滤。

取决于血清型，将过滤的活化的糖与CRM₁₉₇以范围从0.4一直到2 w/w的多糖与蛋白质量比进行配合。选择所述输入比例以控制所得到的缀合物中的多糖与CRM₁₉₇比例。

然后将配合的混合物冻干。缀合时，将多糖和蛋白混合物取决于血清型以范围从5一直到25 g/L的多糖浓度溶解在0.1 M磷酸钠缓冲液中，pH值取决于血清型调节至6.0至8.0。通过向反应混合物中添加0.5-2.0 MEq的氰基氢硼化钠并于23±2℃温育20-48小时来起始缀合。通过添加1-2 MEq的氢硼化钠（NaBH₄）以封端未反应的醛，来终止缀合反应。

另一方面，将过滤的活化的糖和计算的量的CRM₁₉₇蛋白进行壳体冷冻并独立冻干，且然后在溶解于0.1 M磷酸钠缓冲液中时组合，然后可以如上所述进行后来的缀合。

表13总结了在DMSO和水性缓冲液中制备的两种缀合物的结果

实施例18：用于制备大肠杆菌O-抗原多糖- CRM₁₉₇单端缀合物的程序

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌外膜的常见组分，包含脂质A、核心区域和O-抗原（也称为O-特异性多糖或O-多糖）。O-抗原重复单元的不同血清型在其组成、结构和血清学特征方面有区别。用于本发明的O-抗原附着到核心结构域，所述核心结构域在其链末端含有称为2-酮-3-脱氧辛酸（KDO）的糖单元。与一些基于多糖链随机活化的缀合方法（例如，用高碘酸钠或碳二亚胺活化）不同。本发明公开了一种缀合方法，其包括在解掩蔽硫醇官能团时，用二硫化物胺接头选择性活化KDO，然后将其缀合到溴活化的CRM₁₉₇蛋白，如图24（单端缀合物的制备）中所描绘的。

基于胱胺接头（A1）的缀合

在磷酸盐缓冲液中混合O-抗原多糖和胱胺（50-250摩尔当量的KDO），将pH调节至6.0-7.0。向混合物中添加氰基氢硼化钠（NaCNBH₃）（5-30摩尔当量的KDO），并将混合物于37℃搅拌48-72小时。冷却至室温并用等体积的磷酸盐缓冲液稀释时，将混合物用三(2-羧乙基)膦（TCEP）（1.2摩尔当量的添加的胱胺）处理。然后通过使用5 KDa MWCO膜针对10 mM磷酸二氢钠溶液进行渗滤来纯化混合物，以提供含硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可以通过Ellman测定来测定。

然后通过将上述硫醇活化的O-抗原多糖与溴活化的CRM₁₉₇蛋白以0.5-2.0的比例混合来进行缀合。用1 M NaOH溶液将反应混合物的pH调节至8.0 -10.0。缀合反应于5℃进行24±4小时。载体蛋白上未反应的溴残基通过与2 摩尔当量的N-乙酰-L-半胱氨酸于5℃反应3-5小时来猝灭。然后继之以添加3摩尔当量的碘乙酰胺（与添加的N-乙酰-L-半胱氨酸相关），以封端残余的游离巯基基团。所述封端反应于5℃再进行3-5小时，并且通过添加1MNaOH将两个封端步骤的pH维持在8.0-10.0。在使用30 KDa MWCO膜针对5 mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH 6.0的超滤/渗滤后，获得了所得到的缀合物。参见表14、表15、表16、表17和表18。

实施例19：基于3,3'-二硫代双(丙二酰肼)接头（A4）的缀合

在乙酸盐缓冲液中混合O-抗原多糖和3,3'-二硫代双(丙二酰肼)（5-50摩尔当量的KDO），将pH调节至4.5-5.5。向混合物中添加氰基氢硼化钠（NaCNBH₃）（5-30摩尔当量的KDO），并将混合物于23-37℃搅拌24-72小时。然后将混合物用三(2-羧乙基)膦（TCEP）（1.2摩尔当量的添加的3,3'-二硫代双(丙二酰肼)接头）处理。然后通过使用5 KDa MWCO膜针对10 mM磷酸二氢钠溶液进行渗滤来纯化混合物，以提供含硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可以通过Ellman测定来测定。

然后通过将上述硫醇活化的O-抗原多糖与溴活化的CRM₁₉₇蛋白以0.5-2.0的比例混合来进行缀合。用1 M NaOH溶液将反应混合物的pH调节至8.0 -10.0。缀合反应于5℃进行24±4小时。载体蛋白上未反应的溴残基通过与2 摩尔当量的N-乙酰-L-半胱氨酸于5℃反应3-5小时来猝灭。然后继之以添加3摩尔当量的碘乙酰胺（与添加的N-乙酰-L-半胱氨酸相关），以封端残余的游离巯基基团。所述封端反应于5℃再进行3-5小时，并且通过添加1MNaOH将两个封端步骤的pH维持在8.0-10.0。在使用30 KDa MWCO膜针对5 mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH 6.0的超滤/渗滤后，获得了所得到的缀合物。

实施例20：基于2,2'-二硫代-N,N'-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(氨基氧基)乙酰胺)接头（A6）的缀合

在乙酸盐缓冲液中混合O-抗原多糖和2,2'-二硫代-N,N'-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(氨基氧基)乙酰胺)（5-50摩尔当量的KDO），将pH调节至4.5-5.5。然后将混合物于23-37℃搅拌24-72小时，继之以添加氰基氢硼化钠（NaCNBH₃）（5-30摩尔当量的KDO），并将混合物再搅拌3-24小时。然后将混合物用三(2-羧乙基)膦（TCEP）（1.2摩尔当量的添加的接头）处理。然后通过使用5 KDa MWCO膜针对10 mM磷酸二氢钠溶液进行渗滤来纯化混合物，以提供含硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可以通过Ellman测定来测定。

然后通过将上述硫醇活化的O-抗原多糖与溴活化的CRM₁₉₇蛋白以0.5-2.0的比例混合来进行缀合。用1 M NaOH溶液将反应混合物的pH调节至8.0 -10.0。缀合反应于5℃进行24±4小时。载体蛋白上未反应的溴残基通过与2 摩尔当量的N-乙酰-L-半胱氨酸于5℃反应3-5小时来猝灭。然后继之以添加3摩尔当量的碘乙酰胺（与添加的N-乙酰-L-半胱氨酸相关），以封端残余的游离巯基基团。所述封端反应于5℃再进行3-5小时，并且通过添加1MNaOH将两个封端步骤的pH维持在8.0-10.0。在使用30 KDa MWCO膜针对5 mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH 6.0的超滤/渗滤后，获得了所得到的缀合物。

实施例21：溴活化的CRM₁₉₇的制备

在0.1 M磷酸钠，pH 8.0±0.2溶液中制备CRM₁₉₇，并冷却至5±3℃。向蛋白溶液中，以0.25-0.5 BAANS:蛋白（w/w）的比例添加作为原液二甲基亚砜（DMSO）溶液的溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯（BAANS）（20 mg/mL）。将反应于5±3℃温和地混合30-60分钟。所得到的溴乙酰化的（活化的）蛋白例如通过使用10 mM磷酸盐（pH 7.0）缓冲液使用10 kDa MWCO膜通过超滤/渗滤来纯化。纯化后，通过劳里蛋白测定估计溴乙酰化的载体蛋白的蛋白浓度。

表14：O1a缀合物

表15 O2缀合物

表16 O6缀合物

表17 O25b缀合物

表18 O25b K-12缀合物

实施例22：大肠杆菌O-Ag-TT缀合物的制备

50 mg冻干的大肠杆菌血清型O25b长多糖，批次号709766-30（约6.92 mg/mL，MW：约39kDa）用于破伤风类毒素（TT）缀合。

将大肠杆菌血清型O1a长多糖710958-142-3（约6.3 mg/mL，MW：约44.3 kDa）（50mg，7.94 mL）冻干。

将大肠杆菌血清型O6长多糖710758-121-1（约16.8 mg/mL，MW：约44 kDa）（50mg，2.98 mL）冻干。

将上面列举的每种冻干的多糖溶解在WFI中以使其成为约5-10 mg/mL，向其中添加0.5 mL（1 mL乙腈中100 mg（1-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶（CDAP）的溶液））并于室温搅拌。添加三乙胺（TEA）0.2M（2mL），并于室温搅拌。

破伤风类毒素（TT）的制备：将TT（100 mg，47 ml）浓缩至约20 mL，并使用过滤管用盐水（2x50mL）洗涤两次。此后，将其用HEPES和盐水稀释以使最终的HEPES浓度为约0.25M。

如上所述制备TT，并将反应的pH调节至约9.1-9.2。将反应混合物于RT搅拌。

20-24小时后，用甘氨酸（0.5 mL）猝灭反应。此后，使用MWCO再生的纤维素膜将其浓缩，并针对盐水进行渗滤。过滤和分析。参见表19。

表19

示例性实施方案：

实施例23：来自O-抗原发酵、纯化和缀合的额外的结果

下述示例性方法通常适用于所有大肠杆菌血清型。每种多糖的生产包括分批生产发酵，继之以在下游纯化之前进行化学灭活。

菌株和贮藏。用于短链O-抗原生物合成的菌株是大肠杆菌的临床野生型菌株。长链O-抗原是由已通过Wanner-Datsenko方法人工改造以具有天然wzzb基因的缺失并通过来自沙门氏菌属的“长链”增量剂功能fepE互补的短链生产者的衍生物产生的。fepE功能从其天然启动子在高拷贝的基于colE1的“topo”载体或基于colE1的载体pET30a的低拷贝的衍生物（从其中已缺失了T7启动子区域）上表达。

通过在无动物的LB或基本培养基中使细胞生长至至少3.0的OD₆₀₀，来制备细胞库。然后将培养液在新鲜培养基中稀释，并与80％甘油组合，以获得具有2.0 OD₆₀₀/mL的20%甘油终浓度。

用于种子培养和发酵的培养基。所使用的种子和发酵培养基共有以下配方：KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

种子和发酵条件。从单个种子小瓶以0.1％接种种子。将种子瓶于37℃温育16-18小时，且一般达到10-20 OD₆₀₀/mL。

在10L不锈钢蒸气原位（in place）发酵罐中进行发酵。

发酵罐的接种一般为从10 OD₆₀₀种子1:1000。作为在其期间生长在10 g/L的分批葡萄糖上进行的阶段的分批阶段一般持续8小时。葡萄糖耗尽时，存在溶解氧的突然增加，在所述时刻将葡萄糖进料到发酵中。然后，发酵一般进行16-18小时，收获产生> 120 OD₆₀₀/mL。

对血清型O1a、O2、O6和O25b的短链/长链O-抗原生产的初始评价。将O1a、O2、O6和O25b的野生型菌株在补料基本培养基中以分批模式发酵至OD₆₀₀= 15-20。葡萄糖耗尽时，其导致氧耗量的突然减少，从葡萄糖溶液中应用生长限制性葡萄糖进料达16-18小时。达到124-145 OD₆₀₀单位/mL的细胞密度。接着将收获培养液的pH调节至约3.8，并加热至95℃达2小时。然后将水解的培养液冷却至25℃，达到pH 6.0，并离心以除去固体。然后将所得到的上清液应用于SEC-HPLC柱用于定量O-抗原。获得了2240-4180 mg/L范围内的生产力。发现来自这些批次的纯化的短链O-抗原的分子量范围从10一直到15kDa。还注意到，O2和O6水解产物的SEC层析揭示了独特的和可分离的污染多糖，其在O1a和O25b水解产物中不明显。

O1a、O2、O6和O25b O-抗原的长链形式通过在高拷贝的卡那霉素选择性topo质粒上携带异源互补fepE基因的每个菌株的wzzb缺失形式的发酵获得。尽管具有卡那霉素选择，但是如对于短链那样进行发酵。在124-177 OD₆₀₀/mL观察到的最终细胞密度与3500-9850 mg/L的O-抗原生产力有关。长链O-抗原基于互补的合成至少与亲本短链菌株一样多产，且在一些情况下更为如此。纯化的O-抗原多糖的分子量为33-49 kDa，或为相应的短链大小的约3倍。

注意到对于O2和O6的长链水解产物显示出污染多糖峰的迹象，在长链抗原的情况下，其被观察为主要O-抗原峰上的肩；O1和O25b没有显示出产生污染多糖的迹象，如由短链亲本早期所看到的。

发现生长速率抑制与缺乏fepE的topo复制子的存在有关。另外，Δwzzb突变本身对生长速率没有不利影响，从而表明受干扰的生长速率由质粒载体传递。

用于产生O11、O13、O16、O21和O75 O-抗原的菌株的评价。通过SEC-HPLC评价了血清型O11、O13、O16、O21和O75的多种野生型菌株在发酵中产生不需要的多糖的倾向。对于O11、O13、O16、O21和O75的菌株选择为不存在污染多糖，以及对于它们产生> 1000 mg/L O-抗原的能力和展示出允许Wanner -Datsenko重组工程用于引入Δwzzb性状的抗生素敏感性概况进行选择。

构建了氯霉素选择性形式的topo-fepE和pET-fepE，其允许将fepE引入通常被发现为卡那霉素抗性的O11、O13、O16、O21和O75 Δwzzb菌株中。在有氯霉素选择的情况下发酵所得到的带有topo-fepE和pET-fepE的菌株，并通过SEC-HPLC评价来自酸水解的培养液的上清液。高（topo）和低拷贝（pET）fepE构建体两者均指导了具有与亲本野生型相等的对于各自的生产力的O-抗原的合成。没有观察到潜在干扰多糖的表达。

对带有wzzb质粒的菌株生长速率的评价表明，O11、O13和O21被topo-fepE的存在但不被pET-fepE延迟；菌株O16和O75菌株显示出与复制子的选择无关的可接受的生长速率。

表20

多糖的纯化方法包括酸水解以释放O-抗原。将发酵反应器中血清型特异性大肠杆菌培养物的粗悬浮液直接用乙酸处理至3.5±0.5的最终pH，并将酸化的培养液加热至95±5℃的温度达至少一小时。所述处理切割了寡糖近端的KDO与脂质A之间的不稳定键，从而释放了O-Ag链。在使用NH₄OH中和至pH 7±1.0之前，将含有释放的O-Ag的酸化的培养液冷却至20±10℃。所述过程进一步包括几个离心、过滤和浓缩/渗滤操作步骤。

表21

以下条款描述了本发明的额外的实施方案：

C1. 包含选自式O1（例如，式O1A、式O1B和式O1C）、式O2、式O3、式O4（例如，式O4:K52和式O4:K6）、式O5（例如，式O5ab和式O5ac（菌株180/C3））、式O6（例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54）、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18（例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1）、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23（例如，式O23A）、式O24、式O25（例如，式O25a和式O25b）、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45（例如，式O45和式O45rel）、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73（例如，式O73（菌株73-1））、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187中的任何一种的结构的糖，其中n为1至100的整数。

C2. 根据条款C1的糖，其包含选自式O1（例如，式O1A、式O1B和式O1C）、式O2、式O3、式O4（例如，式O4:K52和式O4:K6）、式O5（例如，式O5ab和式O5ac（菌株180/C3））、式O6（例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54）、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18（例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1）、式O21、式O23（例如，式O23A）、式O24、式O25（例如，式O25a和式O25b）、式O26、式O28、式O44、式O45（例如，式O45和式O45rel）、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73（例如，式O73（菌株73-1））、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D₁、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167和式O172的结构，其中n为20至100的整数。

C3. 根据条款C2的糖，其包含选自式O1（例如，式O1A、式O1B和式O1C）、式O2、式O3、式O4（例如，式O4:K52和式O4:K6）、式O5（例如，式O5ab和式O5ac（菌株180/C3））、式O6（例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54）、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18（例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1）、式O21、式O23（例如，式O23A）、式O24、式O25（例如，式O25a和式O25b）、式O26、式O28、式O44、式O45（例如，式O45和式O45rel）、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73（例如，式O73（菌株73-1））、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173和式62D₁的结构，其中n为20至100的整数。

C4. 根据条款C2的糖，其包含选自式O1（例如，式O1A、式O1B和式O1C）、式O2、式O6（例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54）、式O15、式O16、式O21、式O25（例如，式O25a和式O25b）和式O75的结构。

C5. 根据条款C1的糖，其中所述糖不包含选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101的结构。

C6. 根据条款C1的糖，其中所述糖不包含选自式O12的结构。

C7. 根据条款C4的糖，其中所述糖通过在革兰氏阴性细菌中表达wzz家族蛋白以产生所述糖而产生。

C8. 根据条款C7的糖，其中所述wzz家族蛋白选自wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2。

C9. 根据条款C7的糖，其中所述wzz家族蛋白是wzzB。

C10. 根据条款C7的糖，其中所述wzz家族蛋白是fepE。

C11. 根据条款C7的糖，其中所述wzz家族蛋白是wzzB和fepE。

C12. 根据条款C7的糖，其中所述wzz家族蛋白衍生自肠沙门氏菌（Salmonella enterica）。

C13. 根据条款C7的糖，其中所述wzz家族蛋白包含选自SEQ ID NO: 20、SEQ IDNO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19中的任何一个的序列。

C14. 根据条款C7的糖，其中所述wzz家族蛋白包含与SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19中的任何一个具有至少90％序列同一性的序列。

C15. 根据条款C7的糖，其中所述wzz家族蛋白包含选自SEQ ID NO: 20、SEQ IDNO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19中的任何一个的序列。

C16. 根据条款C1的糖，其中所述糖是合成性地合成的。

C17. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖进一步包含大肠杆菌R1部分。

C18. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖进一步包含大肠杆菌R2部分。

C19. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖进一步包含大肠杆菌R3部分。

C20. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖进一步包含大肠杆菌R4部分。

C21. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖进一步包含大肠杆菌K-12部分。

C22. 根据条款C1至C21中任一项的糖，其中所述糖进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸（KDO）部分。

C23. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R1部分。

C24. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R2部分。

C25. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R3部分。

C26. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R4部分。

C27. 根据条款C1至C16中任一项的糖，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌K-12部分。

C28. 根据条款C1至C21中任一项的糖，其中所述糖不进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸（KDO）部分。

C29. 根据条款C1至C22中任一项的糖，其中所述糖不包含脂质A。

C30. 根据条款C1至C29中任一项的糖，其中所述多糖具有10 kDa-2,000 kDa或50kDa-2,000 kDa的分子量。

C31. 根据条款C1至C30中任一项的糖，其中所述糖具有20-40 kDa的平均分子量。

C32. 根据条款C1至C31中任一项的糖，其中所述糖具有40,000-60,000 kDa的平均分子量。

C33. 根据条款C1至C32中任一项的糖，其中n为31至90的整数。

C34. 包含共价结合载体蛋白的糖的缀合物，其中所述糖衍生自大肠杆菌。

C35. 包含共价结合载体蛋白的根据条款C1至条款C33中任一项的糖的缀合物。

C36. 根据条款C34至条款C35中任一项的缀合物，其中所述载体蛋白选自CRM₁₉₇，白喉毒素片段B（DTFB），DTFB C8，白喉类毒素（DT），破伤风类毒素（TT），TT的片段C，百日咳类毒素，霍乱类毒素，或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A（EPA），麦芽糖结合蛋白（MBP），金黄色葡萄球菌（S. aureus）的解毒的溶血素A，聚集因子A，聚集因子B，霍乱毒素B亚基（CTB），肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）肺炎球菌溶血素和其解毒的变体，空肠弯曲杆菌（C. jejuni）AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白中的任一种。

C37. 根据条款C34至条款C36中任一项的缀合物，其中所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

C38. 根据条款C34至条款C36中任一项的缀合物，其中所述载体蛋白是破伤风类毒素（TT）。

C39. 根据条款C34至条款C38中任一项的缀合物，其中所述缀合物通过还原性胺化来制备。

C40. 根据条款C34至条款C38中任一项的缀合物，其中所述缀合物通过CDAP化学制备。

C41. 根据条款C34至条款C38中任一项的缀合物，其中所述缀合物是单端连接的缀合的糖。

C42. 根据条款C34至条款C38中任一项的缀合物，其中所述糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基与所述载体蛋白缀合。

C43. 据条款C42的缀合物，其中所述糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基与所述载体蛋白缀合，其中所述糖通过氨基甲酸酯共价连接至所述eTEC间隔基，且其中所述载体蛋白通过酰胺键共价连接至所述eTEC间隔基。

C44. 根据条款C42至条款C43中任一项的缀合物，其中所述CRM₁₉₇包含通过eTEC间隔基与所述多糖共价连接的2至20或4至16个赖氨酸残基。

C45. 根据条款C34至条款C44中任一项的缀合物，其中所述糖:载体蛋白比例（w/w）为0.2-4。

C46. 根据条款C34至条款C44中任一项的缀合物，其中糖与蛋白的比例为至少0.5且至多2。

C47. 根据条款C34至条款C44中任一项的缀合物，其中糖与蛋白的比例为0.4-1.7。

C48. 根据条款C41至条款C47中任一项的缀合物，其中所述糖通过3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸（KDO）残基与所述载体蛋白缀合。

C49. 包含共价结合载体蛋白的糖的缀合物，其中所述糖包含选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101的结构，其中n为1至10的整数。

C50. 组合物，其包含根据条款C1至条款C33中任一项的糖和药学上可接受的稀释剂。

C51. 组合物，其包含根据条款C34至条款C49中任一项的缀合物和药学上可接受的稀释剂。

C52. 根据条款C51的组合物，其包含与所述组合物中糖的总量相比至多约25％的游离糖。

C53. 根据条款C50至条款C51中任一项的组合物，其进一步包含佐剂。

C54. 根据条款C50至条款C51中任一项的组合物，其进一步包含铝。

C55. 根据条款C50至条款C51中任一项的组合物，其进一步包含QS-21。

C56. 根据条款C50至条款C51中任一项的组合物，其进一步包含CpG寡核苷酸。

C57. 根据条款C50至条款C51中任一项的组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C58. 组合物，其包含通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基与载体蛋白缀合的衍生自大肠杆菌的糖，其中所述多糖通过氨基甲酸酯共价连接至所述eTEC间隔基，且其中所述载体蛋白通过酰胺键共价连接至所述eTEC间隔基。

C59. 根据条款C58的组合物，其中所述糖是衍生自大肠杆菌的O-抗原。

C60. 根据条款C58的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

C61. 根据条款C58的组合物，其中所述糖是衍生自大肠杆菌的O-抗原。

C62. 组合物，其包含通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基与载体蛋白缀合的根据条款C1至条款C16中任一项的糖，其中所述多糖通过氨基甲酸酯共价连接至所述eTEC间隔基，且其中所述载体蛋白通过酰胺键共价连接至所述eTEC间隔基。

C63. 组合物，其包含（i）与载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，（ii）与载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O1A抗原的缀合物，（iii）与载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O2抗原的缀合物，以及（iv）与载体蛋白共价偶联的O6抗原的缀合物，其中所述大肠杆菌O25B抗原包含式O25B的结构，其中n为大于30的整数。

C64. 根据条款C63的组合物，其中所述O1A抗原、O6抗原和O2抗原分别包含下式：

C65. 根据条款C63的组合物，其中所述载体蛋白选自CRM₁₉₇，白喉毒素片段B（DTFB），DTFB C8，白喉类毒素（DT），破伤风类毒素（TT），TT的片段C，百日咳类毒素，霍乱类毒素，或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A（EPA），麦芽糖结合蛋白（MBP），金黄色葡萄球菌（S. aureus）的解毒的溶血素A，聚集因子A，聚集因子B，霍乱毒素B亚基（CTB），肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）肺炎球菌溶血素和其解毒的变体，空肠弯曲杆菌（C. jejuni）AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白中的任一种。

C66. 制备包含通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基与载体蛋白缀合的糖的缀合物的方法，其包括以下步骤：a）使所述糖与1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)（CDT）或1,1'-羰基二咪唑（CDI）在有机溶剂中反应以产生活化的糖；b）使所述活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应，以产生硫醇化的糖；c）使所述硫醇化的糖与还原剂反应以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化的糖；d）使所述活化的硫醇化的糖与包含一个或多个α-卤乙酰胺基团的活化的载体蛋白反应，以产生硫醇化的糖-载体蛋白缀合物；和e）使所述硫醇化的糖-载体蛋白缀合物与（i）能够将所述活化的载体蛋白的未缀合的α-卤乙酰胺基团进行封端的第一封端试剂；和/或（ii）能够将未缀合的游离巯基残基封端的第二封端试剂反应；由此产生eTEC连接的复合糖，其中所述糖衍生自大肠杆菌。

C67. 根据条款C66的方法，其中所述糖包括根据条款C1至条款C33中任一项的糖。

C68. 根据条款C66至条款C67中任一项的方法，其中所述封端步骤e）包括使所述硫醇化的糖-载体蛋白缀合物与（i）作为第一封端试剂的N-乙酰-L-半胱氨酸和/或（ii）作为第二封端试剂的碘乙酰胺反应。

C69. 根据条款C66至条款C68中任一项的方法，其进一步包括通过与三唑或咪唑反应来配合糖以提供配合的糖的步骤，其中在步骤a）之前将所述配合的糖壳体冷冻、冻干并在有机溶剂中重构。

C70. 根据条款C66至条款C69中任一项的方法，其进一步包括在步骤c）中生产的硫醇化的多糖的纯化，其中所述纯化步骤包括渗滤。

C71. 根据条款C66至条款C70中任一项的方法，其中所述方法进一步包括通过渗滤纯化eTEC连接的复合糖。

C72. 根据条款C66至条款C71中任一项的方法，其中步骤a）中的有机溶剂是选自二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基乙酰胺（DMA）、N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮（pyrimidinone）（DMPU）和六甲基磷酰胺（HMPA）或其混合物中的任何一种的极性非质子溶剂。

C73. 包含KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O的培养基。

C74. 根据条款C73的培养基，其中所述培养基用于培养大肠杆菌。

C75. 用于生产根据条款C1至条款C33中任一项的糖的方法，其包括在培养基中培养重组大肠杆菌；通过在所述培养基中培养所述细胞来产生所述糖；由此所述细胞产生所述糖。

C76. 根据条款C75的方法，其中所述培养基包含选自KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O的任一种的元素。

C77. 根据条款C75的方法，其中所述培养基包含大豆水解产物。

C78. 根据条款C75的方法，其中所述培养基包括酵母提取物。

C79. 根据条款C75的方法，其中所述培养基不进一步包含大豆水解产物和酵母提取物。

C80. 根据条款C75的方法，其中所述大肠杆菌细胞包含选自wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2中的任何一种的异源wzz家族蛋白。

C81. 根据条款C75所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞包含选自wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2中的任一种的肠沙门氏菌wzz家族蛋白。

C82. 根据条款C81的方法，其中所述wzz家族蛋白包含选自SEQ ID NO: 20、SEQID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19中的任何一个的序列。

C83. 根据条款C75的方法，其中所述培养产生＞120 OD₆₀₀/mL的得率。

C84. 根据条款C75的方法，其进一步包括纯化所述糖。

C85. 根据条款C75所述的方法，其中所述纯化步骤包括以下任一种：透析、浓缩操作、渗滤操作、切向流过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超滤、深度过滤和柱层析（离子交换层析、多元离子交换层析、DEAE和疏水作用层析）。

C86. 在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包括向主体施用根据条款C50至条款C62中任一项的组合物。

C87. 根据条款C73的方法，其中所述免疫应答包括抗-大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体的诱导。

C88. 根据条款C73的方法，其中所述免疫应答包括抗大肠杆菌IgG抗体的诱导。

C89. 根据条款C73的方法，其中所述免疫应答包括针对大肠杆菌的杀细菌活性的诱导。

C90. 根据条款C73的方法，其中所述免疫应答包括针对大肠杆菌的调理吞噬抗体的诱导。

C91. 根据条款C73的方法，其中所述免疫应答包括初始给药后至少1,000至200,000的几何平均滴度（GMT）水平。

C92. 根据条款C73的方法，其中所述组合物包含包含式O25的糖，其中n为40至100的整数，其中所述免疫应答包括在初始给药后至少1,000至200,000的几何平均滴度（GMT）水平。

C93. 根据条款C73的方法，其中所述哺乳动物处于选自尿道感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血性尿毒性综合征、新生儿脑膜炎、尿脓毒症、腹腔内感染、脑膜炎、并发的肺炎、伤口感染、前列腺活组织检查后相关感染、新生儿/婴儿脓毒症、嗜中性白细胞减少性发热、和其他血流感染；肺炎、菌血症和脓毒症的状况的任何一种的危险中。

C94. 根据条款C73的方法，其中所述哺乳动物患有选自尿道感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血性尿毒性综合征、新生儿脑膜炎、尿脓毒症、腹腔内感染、脑膜炎、并发的肺炎、伤口感染、前列腺活组织检查后相关感染、新生儿/婴儿脓毒症、嗜中性白细胞减少性发热、和其他血流感染；肺炎、菌血症和脓毒症的状况的任何一种。

C95. 用于（i）在主体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，（ii）在主体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，或（iii）在主体中诱导对肠外致病性大肠杆菌特异性的调理吞噬抗体的产生的方法，其中所述方法包括向所述主体施用有效量的根据条款C50至条款C65中任一项的组合物。

C96. 根据条款C95的方法，其中所述主体处于发展尿道感染的危险中。

C97. 根据条款C95的方法，其中所述主体处于发展菌血症的危险中。

C98. 根据条款C95的方法，其中所述主体处于发展脓毒症的危险中。

C99. 组合物，其包含（i）与载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，（ii）与载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O1A抗原的缀合物，（iii）与载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O2抗原的缀合物，以及（iv）与载体蛋白共价偶联的O6抗原的缀合物，其中所述大肠杆菌O25B抗原包含式O25B的结构，其中n为大于30的整数。

C100. 根据条款C1的组合物，其中所述O1A抗原、O6抗原和O2抗原分别包含下式：

C101. 根据条款C1的组合物，其中所述载体蛋白选自铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A（EPA），CRM197，麦芽糖结合蛋白（MBP），白喉类毒素，破伤风类毒素，金黄色葡萄球菌（S. aureus）的解毒的溶血素A，聚集因子A，聚集因子B，霍乱毒素B亚基（CTB），霍乱毒素，霍乱毒素的解毒的变体，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）肺炎球菌溶血素和其解毒的变体，空肠弯曲杆菌（C. jejuni）AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。

C102. 用于（i）在主体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，（ii）在主体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，或（iii）在主体中诱导对肠外致病性大肠杆菌特异性的调理吞噬抗体的产生的方法，其中所述方法包括向所述主体施用有效量的条款C1的组合物。

C103. 根据条款C102的方法，其中所述主体处于发展尿道感染的危险中。

C104. 根据条款C102的方法，其中所述主体处于发展菌血症的危险中。

C105. 根据条款C102的方法，其中所述主体处于发展脓毒症的危险中。

C106. 包括与大肠杆菌的相应野生型O-多糖相比至少5个重复单元的增加的糖。

C107. 根据条款C106的糖，其中所述糖包含式O25a，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O25a。

C108. 根据条款C106的糖，其中所述糖包含式O25b，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O25b。

C109. 根据条款C106的糖，其中所述糖包含式O2，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O2。

C110. 根据条款C106的糖，其中所述糖包含式O6，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O6。

C111. 根据条款C106的糖，其中所述糖包含式O1，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O1。

C112. 根据条款C106的糖，其中所述糖包含式O17，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O17。

C113. 根据条款C106的糖，其中所述糖包含选自式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187的结构，其中n为5至1000的整数。

C114. 根据条款C106的糖，其中所述大肠杆菌是选自以下的大肠杆菌血清型：O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O25b、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186和O187。

C115. 根据条款C106的糖，其中所述糖通过增加培养物中由革兰氏阴性细菌产生的O-多糖的重复单元来产生，包括在革兰氏阴性细菌中超表达wzz家族蛋白以产生所述糖。

C116. 根据条款C115的糖，其中所述超表达的wzz家族蛋白选自wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2。

C117. 根据条款C115的糖，其中所述超表达的wzz家族蛋白是wzzB。

C118. 根据条款C115的糖，其中所述超表达的wzz家族蛋白是fepE。

C119. 根据条款C115的糖，其中所述超表达的wzz家族蛋白是wzzB和fepE。

C120. 根据条款C106的糖，其中所述糖是合成性地合成的。

C121. 包含与载体蛋白共价结合的根据条款C106的糖的缀合物。

C122. 根据条款C121的缀合物，其中所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

C123. 根据条款C121的缀合物，其中所述糖包含选自式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187的结构，其中n为5至1000的整数。

C124. 根据条款C121的缀合物，其中所述糖包括与相应野生型O-多糖相比至少5个重复单元的增加。

C125. 包含根据条款1的糖的组合物，其进一步包含药学上可接受的稀释剂。

C126. 根据条款C125的组合物，其进一步包含佐剂。

C127. 根据条款C125的组合物，其进一步包含铝。

C128. 根据条款C125的组合物，其进一步包含QS-21。

C129. 根据条款C125的组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C130. 在主体中诱导免疫应答的方法，包括向所述主体施用根据条款C125的组合物。

C131. 含根据条款C121的缀合物的组合物，其进一步包含药学上可接受的稀释剂。

C132. 在主体中诱导免疫应答的方法，包括向所述主体施用根据条款C131的组合物。

C133. 根据条款C130或C132的方法，其中所述免疫应答包括抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体的诱导。

C134. 根据条款C133的方法，其中所述抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体是IgG抗体。

C135. 根据条款C133的方法，其中所述抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体是具有针对大肠杆菌的杀细菌活性的IgG抗体。

C136. 免疫原性组合物，其包含通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯（eTEC）间隔基与载体蛋白缀合的衍生自大肠杆菌的糖，其中所述多糖通过氨基甲酸酯共价连接至所述eTEC间隔基，且其中所述载体蛋白通过酰胺键共价连接至所述eTEC间隔基。

C137. 根据条款C136的免疫原性组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

C138. 根据条款C136的免疫原性组合物，其中所述糖是衍生自大肠杆菌的O-抗原。

C139. 根据条款C136的免疫原性组合物，其中所述糖包含选自式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187的结构，其中n为5至1000的整数。

C140. 根据条款C136的免疫原性组合物，其中所述糖具有75-100％的O-乙酰化程度。

C141. 根据条款C136的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是CRM197。

C142. 根据条款C141的免疫原性组合物，其中所述CRM197包含通过eTEC间隔基与所述多糖共价连接的2至20个赖氨酸残基。

C143. 根据条款C141的免疫原性组合物，其中所述CRM197包含通过eTEC间隔基与所述多糖共价连接的4至16个赖氨酸残基。

C144. 根据条款C136的免疫原性组合物，其进一步包含额外的抗原。

C145. 根据条款C136的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

C146. 根据条款C145的免疫原性组合物，其中所述佐剂是选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的基于铝的佐剂。

C147. 根据条款C136的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C148. 包含复合糖的免疫原性组合物，所述复合糖包含与载体蛋白缀合的衍生自大肠杆菌的糖，其中所述复合糖使用还原性胺化来制备。

C149. 根据条款C148的免疫原性组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

C150. 根据条款C148的免疫原性组合物，其中所述糖是衍生自大肠杆菌的O-抗原。

C151. 根据条款C148的免疫原性组合物，其中所述糖包含选自式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187的结构，其中n为5至1000的整数。

C152. 根据条款C148的免疫原性组合物，其中所述糖具有75-100％的O-乙酰化程度。

C153. 根据条款C148的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是CRM197。

C154. 根据条款C148的免疫原性组合物，其进一步包含额外的抗原。

C155. 根据条款C148的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

C156. 根据条款C155的免疫原性组合物，其中所述佐剂是选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的基于铝的佐剂。

C157. 根据条款C148的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C158. 在主体中诱导免疫应答的方法，其包括向所述主体施用根据条款C136-C157中任一项的组合物。

C159. 根据条款C158的方法，其中所述免疫应答包括抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体的诱导。

C160. 根据条款C133的方法，其中所述抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体是IgG抗体。

C161. 根据条款C133的方法，其中所述抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体是具有针对大肠杆菌的杀细菌活性的IgG抗体。

序列表

<110> Pfizer Inc.

Donald, Robert G.K.

<120> 大肠杆菌组合物及其方法

<130> PC72429

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的序列；LT2wzzB_S

<400> 1

gaagcaaacc gtacgcgtaa ag 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的序列；LT2wzzB_AS

<400> 2

cgaccagctc ttacacggcg 20

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的序列；O25bFepE_S

<400> 3

gaaataggac cactaataaa tacacaaatt aataac 36

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的序列；O25bFepE_A

<400> 4

ataattgacg atccggttgc c 21

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的序列；wzzB P1_S

<400> 5

gctatttacg ccctgattgt cttttgt 27

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的序列；wzzB P2_AS

<400> 6

attgagaacc tgcgtaaacg gc 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的序列；wzzB P3_S

<400> 7

tgaagagcgg ttcagataac ttcc 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的序列；wzzB P4_AS

<400> 8

cgatccggaa acctcctaca c 21

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

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Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

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Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

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Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

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<210> 16

<211> 377

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 16

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Glu Ala His Phe Pro Glu

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Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

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Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

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Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala

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Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

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Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

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Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

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Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

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Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

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Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val

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Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

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<210> 17

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 17

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Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

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Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

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Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

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Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

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Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

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Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg

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210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

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Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

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Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

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Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

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<210> 18

<211> 377

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 18

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

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Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

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Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

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Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

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Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

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Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

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Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

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Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

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Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

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Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

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Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

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Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

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Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

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Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

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Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

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Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

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Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

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Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

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Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

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Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

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Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

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<210> 19

<211> 378

<212> PRT

<213> 肠沙门氏菌（Salmonella enterica）

<400> 19

Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu

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Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys

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Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly

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Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr

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Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala

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Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu

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Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val

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<210> 20

<211> 325

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 20

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

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Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

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Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

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Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 21

<211> 326

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 21

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

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Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

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305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 22

<211> 326

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 22

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

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Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

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Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

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Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

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Gly Arg Phe Ser Phe Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

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Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

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Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

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Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp

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Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ser Lys

325

<210> 23

<211> 326

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 23

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

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Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

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Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

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Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys

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195 200 205

Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

225 230 235 240

Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile

275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 24

<211> 327

<212> PRT

<213> 肠沙门氏菌（Salmonella enterica）

<400> 24

Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

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Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr

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Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

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Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu

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Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn

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Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala

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Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys

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Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp

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210 215 220

Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile

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Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln

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Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp

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Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg

275 280 285

Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg

305 310 315 320

Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu

325