阅读说明：本技术 一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法 (Universal swine colibacillosis vaccine and preparation method thereof ) 是由 袁朗 孙华伟 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种通用型猪大肠杆菌病疫苗,包括基础培养基和添加物,所述基础培养基的组分及质量百分比为：胰蛋白胨1.5%-1.9％、酵母提取物0.2%-0.7％、菌体抗原0.2%-0.7％、水解乳蛋白0.2%-0.7％、粘附素抗原0.1%-0.4％、鞭毛抗原0.2%-0.5％、磷酸二氢钾0.1%-0.7％、磷酸氢二钾0.1%-0.7％、表面抗原0.5%-0.9％、氢氧化铝佐剂0.3%-0.5％、脾氨肽0.2%-0.5%、余量为水,所述添加物为裂解血球全血按体积比为0.8%-1.5％,采用胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原和液体佐剂等组成成分,采用多种药物成分以及解血球添加物可以提高疫苗成分的治疗效果和范围,此外添加有脾氨肽可以有效的病猪的免疫力。(The invention provides a universal swine colibacillosis vaccine which comprises a basic culture medium and additives, wherein the basic culture medium comprises the following components in percentage by mass: 1.5 to 1.9 percent of tryptone, 0.2 to 0.7 percent of yeast extract, 0.2 to 0.7 percent of thalli antigen, 0.2 to 0.7 percent of hydrolyzed milk protein, 0.1 to 0.4 percent of adhesin antigen, 0.2 to 0.5 percent of flagellum antigen, 0.1 to 0.7 percent of potassium dihydrogen phosphate, 0.1 to 0.7 percent of dipotassium hydrogen phosphate, 0.5 to 0.9 percent of surface antigen, 0.3 to 0.5 percent of aluminum hydroxide adjuvant, 0.2 to 0.5 percent of spleen amino peptide and the balance of water, wherein the additives are components of lysed whole blood cells according to the volume ratio of 0.8 to 1.5 percent, the tryptone, the yeast extract, the thalli antigen, the hydrolyzed milk protein, the adhesin antigen, the flagellum antigen, the potassium dihydrogen phosphate, the dipotassium hydrogen phosphate, the surface antigen, liquid adjuvant and the like are adopted, and the treatment effect and the range of the components can be improved by adopting various pharmaceutical components and the additives of the lysed blood, in addition, spleen aminopeptide can be added to effectively improve the immunity of sick pigs.)

一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及动物疫苗技术领域，具体为一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法。

背景技术

猪大肠杆菌病是由原性大肠杆菌引起的仔猪肠道传染性疾病。常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和水肿病三种，以发生肠炎、肠毒血症为特征。仔猪黄痢又称早发性大肠杆菌病，1～7日龄仔猪发生的一种急性、高度致死性的肠道传染病。仔猪白痢由大肠杆菌引起的10～30日龄左右仔猪多发的急性消化道传染病。临床上以排腥臭的灰白色粥样稀便为主要特征，发病率高，死亡率低，是一种猪常见的疾病会伴随着较多的并发症，需要通过猪大肠杆菌病疫苗进行预防。

现有的猪大肠杆菌病疫苗在对猪进行预防治疗的过程中存在以下的问题：（1）现有的猪大肠杆菌病疫苗的成分组成较为单一，预防对象针对性较强，无法满足对不同阶段猪的预防治疗，通用性较差；（2）现有的对于猪大肠杆菌病疫苗的培养和制备方式较为固定，影响疫苗的药效。

发明内容

针对上述缺陷，本发明的目的是提供种用于通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法，通过加入多种药物组合成分，改善培育工艺，进而得到了具有高药效和扩大了疫苗的适用范围。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种通用型猪大肠杆菌病疫苗，包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及质量百分比为：胰蛋白胨1.5%-1.9％、酵母提取物0.2%-0.7％、菌体抗原0.2%-0.7％、水解乳蛋白0.2%-0.7％、粘附素抗原0.1%-0.4％、鞭毛抗原0.2%-0.5％、磷酸二氢钾0.1%-0.7％、磷酸氢二钾0.1%-0.7％、表面抗原0.5%-0.9％、氢氧化铝佐剂0.3%-0.5％、脾氨肽0.2%-0.5%、余量为水，所述添加物为裂解血球全血按体积比为0.8%-1.5％。

作为上述技术方案的改进，包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及质量百分比为：胰蛋白胨1.7％、酵母提取物0.5％、菌体抗原0.5％、水解乳蛋白0.5％、粘附素抗原0.3％、鞭毛抗原0.3％、磷酸二氢钾0.5％、磷酸氢二钾0.4％、表面抗原0.7％、液体佐剂0.4％、脾氨肽0.3%、余量为水，所述添加物为裂解血球全血按体积比为1.1％。

作为上述技术方案的改进，所述粘附素抗原采用K88、K99、987P和F41的一种或多种。

作为上述技术方案的改进，所述液体佐剂采用水佐剂，所述水佐剂为氢氧化铝、MONTANIDE™ Gel佐剂。

所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：病菌提取，针对有需求的养殖场，从每一家养殖场的病猪大肠中分别提取相应的细菌，标记并备用，然后将每个养殖场的细菌，进行培养、灭活、离心、重悬，得到大肠杆菌菌体，采取针对性小产量固体培养；

步骤2：大肠杆菌菌体培养：将每个养殖场的细菌，分别在营养平皿上划线，长出细菌后转入鉴别培养基，或直接在鉴别培养基上划线，放入37°C恒温箱中，待长出符合规定的菌落后，挑取相关的多个菌落放入营养肉汤中扩增培养，18-30个小时后，将生长良好的不同养殖场的大肠杆菌菌液分别涂布接种到营养平皿上，根据每个养殖场本批家禽数量将一定量的涂布好的大肠杆菌平皿，放入37°C恒温箱培养18-30个小时；

步骤3：大肠杆菌菌液深度处理及疫苗制作：将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到不同养殖场的大肠杆菌菌液，依次按上述比例放入胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原、液体佐剂、脾氨肽以及裂解血球的混合物放入大肠杆菌菌液内，放入37°C摇床振荡灭活3-5天，进行灭活检测，离心搅拌速率为4000-8000r/min，离心时间为10min；

步骤4：疫苗效果检测：挑取灭活菌液进行营养平皿划线检测，24-48小时后，观察是否有大肠杆菌生长，灭活合格后营养平皿上应没有菌落生成，大肠杆菌疫苗分为大肠杆菌水苗或油乳剂灭活苗，大肠杆菌水苗通过生理盐水直接稀释大肠杆菌菌体制得疫苗。

步骤5：疫苗瓶装处理：按上述配比将药物溶液通过生产线进行瓶装处理并进行真空密封，最后将瓶装药物进行干燥低温存储。

作为上述技术方案的改进，所述添加物采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健壮猪血并无菌脱纤的裂解血球加入基础培养基中。

本发明的有益效果：

（1）本发明采用胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原和液体佐剂等组成成分，采用多种药物成分以及解血球添加物可以提高疫苗成分的治疗效果和范围，此外添加有脾氨肽可以有效的病猪的免疫力。

（2）本方案对于疫苗的培养和制备方式，采用多步骤区分式培养的方式，可以提高疫苗的对于不同阶段猪的治疗效果，使得疫苗成品具有较好的通用性。

具体实施方式

实施例1：

一种通用型猪大肠杆菌病疫苗，包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及质量百分比为：胰蛋白胨1.5%、酵母提取物0.2%、菌体抗原0.2%、水解乳蛋白0.2%、粘附素抗原0.1%、鞭毛抗原0.2%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢二钾0.1%、表面抗原0.5%、氢氧化铝佐剂0.3%、脾氨肽0.2%、余量为水，所述添加物为裂解血球全血按体积比为0.8%。

所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：病菌提取，针对有需求的养殖场，从每一家养殖场的病猪大肠中分别提取相应的细菌，标记并备用，然后将每个养殖场的细菌，进行培养、灭活、离心、重悬，得到大肠杆菌菌体，采取针对性小产量固体培养；

步骤2：大肠杆菌菌体培养：将每个养殖场的细菌，分别在营养平皿上划线，长出细菌后转入鉴别培养基，或直接在鉴别培养基上划线，放入37°C恒温箱中，待长出符合规定的菌落后，挑取相关的多个菌落放入营养肉汤中扩增培养，18个小时后，将生长良好的不同养殖场的大肠杆菌菌液分别涂布接种到营养平皿上，根据每个养殖场本批家禽数量将一定量的涂布好的大肠杆菌平皿，放入37°C恒温箱培养18个小时；

步骤3：大肠杆菌菌液深度处理及疫苗制作：将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到不同养殖场的大肠杆菌菌液，依次按上述比例放入胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原、液体佐剂、脾氨肽以及裂解血球的混合物放入大肠杆菌菌液内，放入37°C摇床振荡灭活3天，进行灭活检测，离心搅拌速率为4000r/min，离心时间为10min；

步骤4：疫苗效果检测：挑取灭活菌液进行营养平皿划线检测，24小时后，观察是否有大肠杆菌生长，灭活合格后营养平皿上应没有菌落生成，大肠杆菌疫苗分为大肠杆菌水苗或油乳剂灭活苗，大肠杆菌水苗通过生理盐水直接稀释大肠杆菌菌体制得疫苗。

步骤5：疫苗瓶装处理：按上述配比将药物溶液通过生产线进行瓶装处理并进行真空密封，最后将瓶装药物进行干燥低温存储。

本发明采用胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原和液体佐剂等组成成分，采用多种药物成分以及解血球添加物可以提高疫苗成分的治疗效果和范围，此外添加有脾氨肽可以有效的病猪的免疫力，对于疫苗的培养和制备方式，采用多步骤区分式培养的方式，可以提高疫苗的对于不同阶段猪的治疗效果，使得疫苗成品具有较好的通用性。

实施例2：

一种通用型猪大肠杆菌病疫苗，包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及质量百分比为：胰蛋白胨1.7％、酵母提取物0.5％、菌体抗原0.5％、水解乳蛋白0.5％、粘附素抗原0.3％、鞭毛抗原0.3％、磷酸二氢钾0.5％、磷酸氢二钾0.4％、表面抗原0.7％、液体佐剂0.4％、脾氨肽0.3%、余量为水，所述添加物为裂解血球全血按体积比为1.1％。

所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：病菌提取，针对有需求的养殖场，从每一家养殖场的病猪大肠中分别提取相应的细菌，标记并备用，然后将每个养殖场的细菌，进行培养、灭活、离心、重悬，得到大肠杆菌菌体，采取针对性小产量固体培养；

步骤2：大肠杆菌菌体培养：将每个养殖场的细菌，分别在营养平皿上划线，长出细菌后转入鉴别培养基，或直接在鉴别培养基上划线，放入37°C恒温箱中，待长出符合规定的菌落后，挑取相关的多个菌落放入营养肉汤中扩增培养，25个小时后，将生长良好的不同养殖场的大肠杆菌菌液分别涂布接种到营养平皿上，根据每个养殖场本批家禽数量将一定量的涂布好的大肠杆菌平皿，放入37°C恒温箱培养25个小时；

步骤3：大肠杆菌菌液深度处理及疫苗制作：将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到不同养殖场的大肠杆菌菌液，依次按上述比例放入胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原、液体佐剂、脾氨肽以及裂解血球的混合物放入大肠杆菌菌液内，放入37°C摇床振荡灭活4天，进行灭活检测，离心搅拌速率为6000r/min，离心时间为10min；

步骤4：疫苗效果检测：挑取灭活菌液进行营养平皿划线检测，36小时后，观察是否有大肠杆菌生长，灭活合格后营养平皿上应没有菌落生成，大肠杆菌疫苗分为大肠杆菌水苗或油乳剂灭活苗，大肠杆菌水苗通过生理盐水直接稀释大肠杆菌菌体制得疫苗。

步骤5：疫苗瓶装处理：按上述配比将药物溶液通过生产线进行瓶装处理并进行真空密封，最后将瓶装药物进行干燥低温存储。

本发明采用胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原和液体佐剂等组成成分，采用多种药物成分以及解血球添加物可以提高疫苗成分的治疗效果和范围，此外添加有脾氨肽可以有效的病猪的免疫力，对于疫苗的培养和制备方式，采用多步骤区分式培养的方式，可以提高疫苗的对于不同阶段猪的治疗效果，使得疫苗成品具有较好的通用性。

实施例3：

一种通用型猪大肠杆菌病疫苗，包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及质量百分比为：胰蛋白胨1.9％、酵母提取物0.7％、菌体抗原0.7％、水解乳蛋白0.7％、粘附素抗原0.4％、鞭毛抗原0.5％、磷酸二氢钾0.7％、磷酸氢二钾0.7％、表面抗原0.9％、氢氧化铝佐剂0.5％、脾氨肽0.5%、余量为水，所述添加物为裂解血球全血按体积比为1.5％。

所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：病菌提取，针对有需求的养殖场，从每一家养殖场的病猪大肠中分别提取相应的细菌，标记并备用，然后将每个养殖场的细菌，进行培养、灭活、离心、重悬，得到大肠杆菌菌体，采取针对性小产量固体培养；

步骤2：大肠杆菌菌体培养：将每个养殖场的细菌，分别在营养平皿上划线，长出细菌后转入鉴别培养基，或直接在鉴别培养基上划线，放入37°C恒温箱中，待长出符合规定的菌落后，挑取相关的多个菌落放入营养肉汤中扩增培养，30个小时后，将生长良好的不同养殖场的大肠杆菌菌液分别涂布接种到营养平皿上，根据每个养殖场本批家禽数量将一定量的涂布好的大肠杆菌平皿，放入37°C恒温箱培养30个小时；

步骤3：大肠杆菌菌液深度处理及疫苗制作：将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到不同养殖场的大肠杆菌菌液，依次按上述比例放入胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原、液体佐剂、脾氨肽以及裂解血球的混合物放入大肠杆菌菌液内，放入37°C摇床振荡灭活3-5天，进行灭活检测，离心搅拌速率为8000r/min，离心时间为10min；

步骤4：疫苗效果检测：挑取灭活菌液进行营养平皿划线检测，48小时后，观察是否有大肠杆菌生长，灭活合格后营养平皿上应没有菌落生成，大肠杆菌疫苗分为大肠杆菌水苗或油乳剂灭活苗，大肠杆菌水苗通过生理盐水直接稀释大肠杆菌菌体制得疫苗。

步骤5：疫苗瓶装处理：按上述配比将药物溶液通过生产线进行瓶装处理并进行真空密封，最后将瓶装药物进行干燥低温存储。

本发明采用胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原和液体佐剂等组成成分，采用多种药物成分以及解血球添加物可以提高疫苗成分的治疗效果和范围，此外添加有脾氨肽可以有效的病猪的免疫力，对于疫苗的培养和制备方式，采用多步骤区分式培养的方式，可以提高疫苗的对于不同阶段猪的治疗效果，使得疫苗成品具有较好的通用性。

实施例4（对比实施例）

一种通用型猪大肠杆菌病疫苗，包括基础培养基，所述基础培养基的组分及质量百分比为：胰蛋白胨1.7％、酵母提取物0.5％、菌体抗原0.5％、水解乳蛋白0.5％、粘附素抗原0.3％、鞭毛抗原0.3％、磷酸二氢钾0.5％、磷酸氢二钾0.4％、表面抗原0.7％、液体佐剂0.4％、余量为水。

所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：病菌提取，针对有需求的养殖场，从每一家养殖场的病猪大肠中分别提取相应的细菌，标记并备用，然后将每个养殖场的细菌，进行培养、灭活、离心、重悬，得到大肠杆菌菌体，采取针对性小产量固体培养；

步骤2：大肠杆菌菌液深度处理及疫苗制作：将生长良好的大肠杆菌平皿取出，在超净台中，用生理盐水浸泡平皿上的大肠杆菌，用涂布器轻轻刮取菌苔，冲洗并收集，得到不同养殖场的大肠杆菌菌液，依次按上述比例放入胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原、液体佐剂、脾氨肽以及裂解血球的混合物放入大肠杆菌菌液内，放入37°C摇床振荡灭活4天，进行灭活检测，离心搅拌速率为6000r/min，离心时间为10min；

步骤3：疫苗效果检测：挑取灭活菌液进行营养平皿划线检测，36小时后，观察是否有大肠杆菌生长，灭活合格后营养平皿上应没有菌落生成，大肠杆菌疫苗分为大肠杆菌水苗或油乳剂灭活苗，大肠杆菌水苗通过生理盐水直接稀释大肠杆菌菌体制得疫苗。

步骤4：疫苗瓶装处理：按上述配比将药物溶液通过生产线进行瓶装处理并进行真空密封，最后将瓶装药物进行干燥低温存储。

本发明采用胰蛋白胨、酵母提取物、菌体抗原、水解乳蛋白、粘附素抗原、鞭毛抗原、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、表面抗原和液体佐剂等组成成分，采用多种药物成分以及解血球添加物可以提高疫苗成分的治疗效果和范围。

具体地，下述以80头猪为实验研究对象，测试实施1-4制备一种通用型猪大肠杆菌病疫苗的使用效果。

实验组	头数	注射药物量	注射次数	治愈率
					实施例1	20	13ml	3	90%
实施例2	20	12ml	3	100%
					实施例3	20	11ml	3	95%
实施例4	20	15ml	3	70%

此外，从上述对比参数可以得知，采用本发明配方及对制备处理工艺，使得一种通用型猪大肠杆菌病疫苗更容易将内部的药性发挥出来，具有更好的通用性对于不同阶段的猪均具有较好的治疗效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。