一种预防林麝肺炎的三联灭活疫苗的制备方法
阅读说明：本技术 一种预防林麝肺炎的三联灭活疫苗的制备方法 (Preparation method of triple inactivated vaccine for preventing forest musk deer pneumonia ) 是由 黄志鑫 王兴龙 李旭鑫 李哲 张静雅 谢宏林 郑玉清 黄歆然 于 2021-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明的一种预防林麝肺炎的三联灭活疫苗的制备方法,包括如下步骤：步骤1,从发病林麝体内分离获得致病性大肠杆菌、假铜绿单胞菌、肺炎克雷伯菌,上述菌种采用冷冻干燥的方法保存；步骤2,将三种细菌分别置于培养基37℃培养后,扩大培养,对菌液用浓度为4‰的甲醛进行灭活24h；步骤3,将各菌种用灭菌生理盐水稀释到8.0×10～(9)cfu/mL；步骤4,将致病性大肠杆菌、假铜绿单胞菌、肺炎克雷伯菌按照2：2：1比例混合,加入各1万单位的青链霉素,通过搅拌装置混匀得到三联灭活疫苗。该方法制备的疫苗价格低廉,易于操作,免疫效果良好。(The preparation method of the triple inactivated vaccine for preventing the pneumonia of the forest musk deer comprises the following steps of: step 1, separating pathogenic escherichia coli, pseudomonas aeruginosa and klebsiella pneumoniae from pathogenic forest musk deer, and preserving the strains by adopting a freeze drying method; step 2, respectively placing the three bacteria in a culture medium for culture at 37 ℃, performing amplification culture, and inactivating the bacteria liquid for 24 hours by using formaldehyde with the concentration of 4 per mill; step 3, diluting each strain to 8.0 × 10 with sterilized normal saline 9 cfu/mL; step 4, mixing pathogenic escherichia coli, pseudomonas aeruginosa and klebsiella pneumoniae according to the ratio of 2: 2: mixing the components according to the proportion of 1, adding 1 ten thousand units of streptomycin, and uniformly mixing the components by a stirring device to obtain the triple inactivated vaccine. The vaccine prepared by the method has low price, easy operation and good immune effect.)
技术领域
本发明属于畜牧兽医学领域，具体涉及一种预防林麝肺炎的三联灭活疫苗的制备方法。
背景技术
林麝肺炎是由多种细菌引起的林麝的一种急性或慢性的呼吸道病，以流涕、呼吸困难，肺部炎症损伤为特征。随林麝养殖数量的增殖，林麝肺炎流行呈加重趋势，每年因为肺炎导致林麝死亡比例可高达林麝存栏总数的8％，已经发展成为林麝养殖和林麝保护最为重要的制约因素。
根据对大量林麝肺炎死亡病例病因的研究发现，大肠杆菌、假铜绿单胞菌核肺炎克雷伯菌是林麝肺炎死亡病例中最常分离到的细菌种类，因此选择以上3种细菌作为疫苗研究对象，开发林麝肺炎疫苗。
大肠杆菌是一种重要的条件致病性，在环境和动物体内广泛存在，是多种动物和人的重要病原。大肠杆菌可引起林麝肺炎，造成肺脏出血、肺脏实变等发病症状。大肠杆菌包括O抗原、K抗原、H抗原和F抗原四种抗原。O抗原为脂多糖，已有171种，是分群的基础
假铜绿单胞菌是一种重要的条件致病菌，在环境中广泛存在，是多种动物和人的重要病原。可引起林麝急性出血性肺炎或慢性的肺部脓肿。假铜绿单胞菌包括O抗原、H抗原、黏液抗原、R抗原、菌毛抗原等成分。根据O抗原血清学分型，可将该菌分为20种血清型。
肺炎克雷伯氏菌属肠杆菌科，为革兰氏染色阴性的粗短杆菌是重要的条件致病菌。外界抵抗力强，对多数抗生素易产生耐药性。与肠杆菌科其他细菌一样，具O抗原和K抗原(即菌体抗原和荚膜抗原)。
灭活疫苗制备工艺已经在世界范围内广泛应用，并且疫苗免疫效果良好，安全性好，是动物疫病预防的首选。灭活疫苗主要是将病原通过甲醛灭活后，通过皮下或肌肉注射，使动物产生特异性免疫保护力的生物制品。其价格低廉，易于操作，免疫效果良好，在兽医临床上得到广泛应用。
发明内容
因此，本发明提供一种预防林麝肺炎的三联灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1，从发病林麝体内分离获得致病性大肠杆菌、假铜绿单胞菌、肺炎克雷伯菌，上述菌种采用冷冻干燥的方法保存；
步骤2，将三种细菌分别置于培养基37℃培养后，扩大培养，对菌液用浓度为4‰的甲醛进行灭活24h；
步骤3，将各菌种用灭菌生理盐水稀释到8.0×109cfu/mL；
步骤4，将致病性大肠杆菌、假铜绿单胞菌、肺炎克雷伯菌按照2：2：1比例混合，加入各1万单位的青链霉素，通过搅拌装置混匀得到三联灭火疫苗。
优选的，所述搅拌装置包括：传动箱、第一电机、第一转轴、曲柄、第一齿轮、拨杆、导轨、滑块、齿条，
所述传动箱底端设置有开口，所述传动箱底壁设置有第一电机，所述第一电机的输出轴与第一转轴一端同轴连接，第一转轴另一端与曲柄一端连接，第一转轴上同轴设置有第一齿轮，曲柄另一端与拨杆一端垂直连接，所述传动箱的内壁顶部设置有水平方向的导轨，所述导轨上滑动连接有滑块，所述滑块底端设置有齿条，第一L形连接杆一端与所述滑块一端连接，第一L形连接杆另一端上设置有沿长度方向延伸的滑槽，拨杆另一端穿过所述滑槽；
所述齿条的一侧设置有第二齿轮，所述齿条与所述第二齿轮啮合，所述第二齿轮上同轴设置有第二转轴，所述第二转轴一端与所述第二齿轮连接，所述第二转轴另一端穿过第一固定块与水平方向的转杆的中间连接，所述第二转轴与所述第一固定块转动连接，所述第一固定块与所述传动箱内壁连接，所述转杆的两端分别设置有竖直方向的第一连接杆，所述第一连接杆下端与第三齿轮同轴连接，所述第一齿轮的一侧设置有圆环，所述圆环的内圈和外圈都设置有齿牙，所述圆环的外圈与所述第一齿轮啮合，所述圆环的内圈分别与两个第三齿轮啮合，所述第二转轴上套设有套筒，所述套筒与所述第二转轴转动连接，所述套筒的左右两侧分别设置有第二L形杆，所述第二L形杆一端与所述套筒的外壁连接，所述第二L形杆另一端与所述圆环上端连接，两个所述第三齿轮之间设置有第四齿轮，所述第四齿轮分与所述第三齿轮啮合，所述传动箱底端设置有筒体，所述第三齿轮底端设置有竖直方向的第三转轴，所述第三转轴一端与所述第三齿轮同轴连接，所述第三转轴另一端穿过所述开口与第一搅拌叶连接，所述第四齿轮与所述开口之间设置有第二固定块，所述第二固定块与所述传动箱内壁连接，所述第四齿轮底端设置有竖直方向的第四转轴，所述第四转轴一端与所述第四齿轮同轴连接，第四转轴另一端依次穿过所述第二固定块、所述开口与第二搅拌叶连接，所述第四转轴与所述第二固定块转动连接，所述筒体一侧设置有进液管，所述筒体另一侧设置有出液管。
优选的，所述圆环的底端设置有竖直方向的第二连接杆，所述第二连接杆下端穿过所述开口与扫刷连接，所述扫刷的刷毛与所述筒体内壁接触。
优选的，所述进液管和所述出液管上均设置有电磁阀。
优选的，所述传动箱的侧壁上设置有检修口，所述检修口设置有密封板。
优选的，所述密封板与所述传动箱通过螺钉连接。
优选的，所述传动箱的外壁上设置有滤尘网。
优选的，所述筒体底端设置有万向轮。
本发明技术方案具有以下优点：该制备方法具有生物安全性，选用疫苗菌株通过甲醛充分灭活；具有预防大肠杆菌、假铜绿单胞菌和肺炎克雷伯菌引起的林麝肺炎的功能，本疫苗所有疫苗菌株均分离自陕西省，且通过分子分型鉴定确定为流行优势菌株；具有免疫原性强，特异性好的特点，本发明是全菌灭活，可产生强的免疫力；分离菌株来自于大量临床病例的筛选，具有较好的覆盖面，本疫苗制作方法简易，具有成本低的特点。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明中搅拌装置的结构示意图；
图2是本发明中第一L形连接杆及拨杆的安装结构示意图；
图3是本发明中圆环、第一齿轮、第三齿轮、第四齿轮的啮合示意图；
其中，1-传动箱，2-开口，3-第一电机，4-第一转轴，5-曲柄，6-第一齿轮，7-拨杆，8-导轨，9-滑块，10-齿条，11-第一L形连接杆，12-滑槽，13-第二齿轮，14-第二转轴，15-第一固定块，16-转杆，17-第一连接杆，18-第三齿轮，19-圆环，20-套筒，21-第二L形杆，22-第四齿轮，23-筒体，24-第三转轴，25-第一搅拌叶，26-第二固定块，27-第四转轴，28-第二搅拌叶，29-进液管，30-出液管，31-第二连接杆，32-扫刷，33-电磁阀，34-检修口，35-密封板，36-滤尘网，37-万向轮。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需说明的是，当部件被称为“固定于”或“设置于”另一个部件，它可以直接在另一个部件上或者间接在该另一个部件上。当一个部件被称为是“连接于”另一个部件，它可以是直接或者间接连接至该另一个部件上。
需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
实施例一
本发明提供了一种预防林麝肺炎的三联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1.菌种复壮
将三株细菌分别以10LD50剂量接种小鼠，待小鼠发病，断颈处死，无菌条件下打开胸腔，剪开肺脏，用接菌环蘸取划线接种到LB固体培养基上，37℃培养16h，挑取单菌落接种5mL LB液体培养基，220rpm 37℃摇床培养，保存菌种，按照1:1000放大培养。
2.灭活疫苗的制备
(1)菌液的制备和检验
按照需求量准备LB培养基，按照1:1000比例分别接种3种细菌，37℃培养14-18h，活菌计数。
(2)菌液的灭活和浓缩
向培养菌液中按照1:1000加入甲醛溶液，37℃，120rpm作用48h，12000rpm离心收获灭活菌体，用生理盐水洗涤3次，将菌体浓度调整为8.0×109cfu/mL，进行无菌检验。
(3)三价疫苗的制备
将调整好浓度的三种单价灭活菌体按照:2：2：1的比例混合，加入终浓度为各1万单位的青链霉素，通过搅拌装置混匀得到三联灭火疫苗，分别制备3批疫苗，编号为202101，202102，202103。
(4)疫苗分装
无菌检验合格后按照每瓶100Ml进行分装，密封，2-8℃保存。
实施例二
1.安全检查
检验项目(无菌检验，安全性检验、甲醛残留量检验和物理性状检验)均按照《兽医生物制品制造及检验规程》(以下简称为《规程》)方法进行。
1.1无菌检验
参照《规程》进行操作，经无菌检验，202101，202102，202103三批疫苗无菌检验均合格。
1.2物理性状检验
分别在静止与摇匀状态下观察颜色、形态等；摇匀后为均匀乳白色悬液；静置后，上层为澄清液体，下层为白色沉淀；
1.3甲醛残留量检验
参照《规程》进行操作；经检测甲醛残留量为低于0.10％，在《规程》允许范围内。
1.4超剂量接种安全性检验
去5毫升灭活疫苗免疫家兔5只，设立生理盐水对照组，30日内观察接种疫苗试验动物的采食、精神状态、以及局部吸收情况。在注射疫苗30d内，家兔采食、精神状态与对照无明显差异，局部吸收良好。结果表明：本品生物安全性良好。
2.效力检验
2.1林麝三联肺炎疫苗对小鼠免疫攻毒保护实验
将40只小鼠，分成4组，每组10只。第1组、第2组小鼠分别取3，3，4只免疫202101，202102，202103批次三联疫苗0.2mL，14d后接种第二针；第3组、第4组分别接种0.2mL生理盐水。
二免后14d第1、3组接种10LD50大肠杆菌；第2、4组接种10LD50假铜绿单胞菌。接种后14d观察，结果显示免疫组小鼠全部存活，对照组小鼠第4组存活1只。说明疫苗免疫能够为小鼠提供良好的免疫保护，见表1。
表1林麝肺炎三联疫苗对小鼠的保护试验结果
2.2林麝三联疫苗免疫林麝诱导抗体反应
分三个场，对当年出生林麝幼崽进行免疫接种2mL/只，分别在免疫首免后30d、44d、60d、采血，测大肠杆菌和假铜绿单胞菌抗体，见表2和表3。
疫苗物理性状及保存
(1)本品为乳白色悬液；静置后，上层为澄清液体，下层为白色沉淀；
(2)自制疫苗日算起，2-8℃一下，有效期12个月；
(3)本疫苗使用对象为林麝
注意事项：①疫区紧急接种时，仅限肌肉注射；②要先行小群做安全试验，证明安全后，方可大面积使用；③本品饮水、拌料无效；④如出现疫苗接种严重反应，可用0.1％肾上腺素紧急抢救。
实施例三
如图1-3所示，所述搅拌装置包括：传动箱1、第一电机3、第一转轴4、曲柄5、第一齿轮6、拨杆7、导轨8、滑块9、齿条10，
所述传动箱1底端设置有开口2，所述传动箱1底壁设置有第一电机3，所述第一电机3的输出轴与第一转轴4一端同轴连接，第一转轴4另一端与曲柄5一端连接，第一转轴4上同轴设置有第一齿轮6，曲柄5另一端与拨杆7一端垂直连接，所述传动箱1的内壁顶部设置有水平方向的导轨8，所述导轨8上滑动连接有滑块9，所述滑块9底端设置有齿条10，第一L形连接杆11一端与所述滑块9一端连接，第一L形连接杆11另一端上设置有沿长度方向延伸的滑槽12，拨杆7另一端穿过所述滑槽12；
所述齿条10的一侧设置有第二齿轮13，所述齿条10与所述第二齿轮13啮合，所述第二齿轮13上同轴设置有第二转轴14，所述第二转轴14一端与所述第二齿轮13连接，所述第二转轴14另一端穿过第一固定块15与水平方向的转杆16的中间连接，所述第二转轴14与所述第一固定块15转动连接，所述第一固定块15与所述传动箱1内壁连接，所述转杆16的两端分别设置有竖直方向的第一连接杆17，所述第一连接杆17下端与第三齿轮18同轴连接，所述第一齿轮6的一侧设置有圆环19，所述圆环19的内圈和外圈都设置有齿牙，所述圆环19的外圈与所述第一齿轮6啮合，所述圆环19的内圈分别与两个第三齿轮18啮合，所述第二转轴14上套设有套筒20，所述套筒20与所述第二转轴14转动连接，所述套筒20的左右两侧分别设置有第二L形杆21，所述第二L形杆21一端与所述套筒20的外壁连接，所述第二L形杆21另一端与所述圆环19上端连接，两个所述第三齿轮18之间设置有第四齿轮22，所述第四齿轮22分与所述第三齿轮18啮合，所述传动箱1底端设置有筒体23，所述第三齿轮18底端设置有竖直方向的第三转轴24，所述第三转轴24一端与所述第三齿轮18同轴连接，所述第三转轴24另一端穿过所述开口2与第一搅拌叶25连接，所述第四齿轮22与所述开口2之间设置有第二固定块26，所述第二固定块26与所述传动箱1内壁连接，所述第四齿轮22底端设置有竖直方向的第四转轴27，所述第四转轴27一端与所述第四齿轮22同轴连接，第四转轴27另一端依次穿过所述第二固定块26、所述开口2与第二搅拌叶28连接，所述第四转轴27与所述第二固定块26转动连接，所述筒体23一侧设置有进液管29，所述筒体23另一侧设置有出液管30。所述圆环19的底端设置有竖直方向的第二连接杆31，所述第二连接杆31下端穿过所述开口2与扫刷32连接，所述扫刷32的刷毛与所述筒体23内壁接触。所述进液管29和所述出液管30上均设置有电磁阀33。所述传动箱1的侧壁上设置有检修口34，所述检修口34设置有密封板35。所述密封板35与所述传动箱1通过螺钉连接。所述传动箱1的外壁上设置有滤尘网36。所述筒体23底端设置有万向轮37。
上述技术方案的工作原理及有益技术效果：将致病性大肠杆菌、假铜绿单胞菌、肺炎克雷伯菌按照4：4：2比例混合，加入各1万单位的青链霉素后的溶液经进液管29流入至筒体，启动第一电机3，带动拨杆7旋转，拨杆7在滑槽12内滑动，带动齿条10左右往复移动，通过齿条10与第二齿轮13的啮合，带动第二转轴14正反转交替旋转，两个第三齿轮18就绕着第四转轴27正反转交替周转，由于圆环19与第三齿轮18的啮合，第三齿轮18也正反转交替自转，通过第三齿轮18与第四齿轮22的啮合，带动第四齿轮22也正反转交替旋转，且与第三齿轮18的旋转反向始终相反，相应地，第一搅拌叶25在绕着筒体23的轴心正反转交替周转的同时，还绕自己的轴心正反转交替旋转，同时，第二搅拌叶28在绕着自己的轴心正反转交替旋转，且始终与第一搅拌叶25的旋转方向相反，因而，更容易产生漩涡，造成流体的湍动，挺高了搅拌效率。另外，通过第一齿轮6和圆环19的啮合，带动扫刷32不断的旋转，对筒体23的内壁进行扫刷，保持筒体内壁的清洁。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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