具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1人参皂苷Rg5抗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化病作用研究。

1.材料与仪器。

1.1动物。

SPF级健康成年Wistar雄性大鼠，体重180-220g，由辽宁长生生物技术有限公司提供(许可证号：SCXK(辽)2015-0001)。

1.2试剂。

人参皂苷Rg5(为本实验室从黑参中经提取分离和纯化制备，纯度>95％)；盐酸博来霉素(海正辉瑞制药有限公司，生产批号：16032311)；吡非尼酮(原料药，武汉江民华泰医药化工有限公司，生产批号：203819)；羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号20190610)，TGF-βELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号201906)，NF-κBELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号201906)，MMP-1ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号201906)。实验中所用试剂均为分析纯，购于天津大茂试剂厂。

1.3仪器。

YQ-A3-SS-048高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；FA-1004电子天平(上海精科天平厂)；UV-2100紫外分光光度计(上海UNICO公司)；可调式移液器(美国RAININ(瑞宁)公司)；Caretium酶标仪(深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司)。

1.4主要试剂的配制。

盐酸博来霉素溶液：盐酸博来霉素用生理盐水配置成5mg/mL溶液，现配现用。

2.实验方法。

2.1肺纤维化模型建立方法。

实验大鼠称重后，腹腔注射10％水合氯醛(3mL/kg)，待大鼠进入麻醉状态后对其进行无菌操作下的经口气管插管，注入生理盐水或博来霉素溶液(5mg/kg，约0.2mL)，给完药后迅速拔出插管，对大鼠进行按摩并适当摇晃大鼠身体以促进药物在肺内均匀分布。待大鼠呼吸平稳后，将其放在一个有平缓坡度的支架上，头在高处，等待大鼠苏醒，放回鼠笼。

2.2动物分组与给药方法。

SPF级Wistar大鼠50只(由辽宁长生生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(辽)2015-0001)，体重180-220g，将只大鼠分为空白对照组、模型组、阳性药组、人参皂苷Rg5高、低剂量组，每组10只。按照2.1项下方法构建大鼠肺纤维化模型，对照组大鼠同法注入等体积生理盐水。于造模后次日开始按下表剂量分别对各组动物给药，每天给药1次，连续灌胃给药30天。于第31天处死大鼠前称体重记录，麻醉后腹主动脉取血，失血死亡后进行解剖，将收集的血液用低温离心机于4℃离心10min(3000rpm/min)，取上清，分装后-80℃超低温冰箱中保存，用于测定血清中HYP、NF-κB、MMP-1及TGF-β水平。

表1各组给药剂量。

2.3指标测定。

2.3.1一般状况观察。

每日观察大鼠状况，包括皮毛、精神状态、饮食情况、呼吸频率与方式等。

2.3.2肺系数。

解剖取出肺脏，洗去血渍并去除结缔组织，吸干水分，称取的肺脏即为全肺湿重。计算肺系数[全肺湿重(mg)/体重(g)]。

2.3.3HE染色。

大鼠左肺固定于4％多聚甲醛后进行HE染色，步骤如下。

(1)冲洗：将组织块置于包埋盒中流水24h。

(2)脱水：依次70％酒精过夜，80％酒精2h，90％酒精1h,95％酒精40min，无水乙醇Ⅰ40min，无水乙醇Ⅱ30min。

(3)透明：将脱水后组织浸入二甲苯Ⅰ10min,二甲苯Ⅱ10min。

(4)浸蜡：组织浸入软蜡Ⅰ1h左右，再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min，硬蜡Ⅱ1h。

(5)包埋：将蜡液注入包埋硬具中，将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷台。

(6)切片。

(7)染色：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→

无水乙醇Ⅱ1-3min→90％酒精1min→80％酒精1min→70％酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→伊红3-5min→水洗→70％酒精1-2s→80％酒精3-5min→90％酒精3-5min→95％酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片。

2.3.4血清中NF-κB、MMP-1及TGF-β水平。

ELISA法检测NF-κB、MMP-1及TGF-β水平，测定方法均按照试剂盒说明书进行，操作方法如下。

(1)预先将试剂盒在室温下平衡20min，取出所需板条，用自封袋密封剩余板条放回4℃。

(2)设置标准品孔和样本孔，各标准品孔内分别加不同浓度标准品50μL。

(3)各样本孔先分别加待测样本10μL，再分别加入样本稀释液40μL，空白孔不加。

(4)除空白孔外，各标准品孔与样本孔中每孔分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，然后用封板膜将反应孔封住，37℃恒温箱温育60min。

(5)弃去液体，吸水纸上拍干后每孔加满洗涤液，静置1min，弃去洗涤液再在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。

(6)每孔先分别加入显色剂A50μL，再分别加入显色剂B50μL，37℃避光孵育15min。

(7)每孔分别加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

2.3.6血清中HYP含量测定。

测定方法按照试剂盒说明书进行，具体方法如下。

(1)取血清与水解液于试管中1：2混匀。95℃水解20min，调PH值至6.0-6.8。

(2)取稀释的水解液加适量活性炭(约20mg)，混匀，3500rpm/min离心10min。

(3)取上清1mL作检测，依次加入试剂盒内提供的三种试剂后，混匀，60℃水浴15min。

(4)待冷却后3500rpm/min离心10min，取上清于波长550nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度。

羟脯氨酸含量(μg/mL)＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×5μg/mL×水解液总体积(mL)/取样量(mL)。

3.数据处理。

利用SPSS 17.0统计软件，组间比较采用One-Way ANOVA方法。当方差齐时运用LSD检验，方差不齐时运用Dunnett’s T3检验。(注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。)。

4.实验结果。

4.1大鼠一般体征观察。

与对照组相比，造模后的大鼠出现不同程度的运动迟缓、萎靡少动、呼吸频率加快，呼吸音明显，精神欠佳、毛枯、饮食减少及体重减轻等症状。

4.2肺组织肉眼观察。

肺组织肉眼观察结果如图1所示，空白组大鼠肺组织呈粉红色，质软，光滑，饱满。而模型组大鼠肺脏呈暗红色，质硬，弹性较差，肉眼可见出血点，有瘢痕状纹路。其他组大鼠肺组织呈浅红色，弹性较好，没有明显纤维状纹路，出血点较少。

4.3肺组织病理学切片观察。

结果如图2所示，肺组织病理学切片观察(10×10)；注：A代表空白组，B代表模型组，C代表阳性药组，D代表人参皂苷Rg5低剂量组，E代表人参皂苷Rg5高剂量组，图中标尺大小为100μm。

空白组大鼠肺组织结构正常，肺泡结构清晰，无充血、水肿及急慢性炎症等改变。模型组肺组织原有结构破坏，肺泡间隔增宽，肺间质炎症细胞浸润，成纤维细胞大量增生。阳性组肺组织偶见间质轻度水肿，与模型组相比炎性细胞浸润较少，可观察到部分较明显的肺泡结构。人参皂苷Rg5高剂量组与低剂量组肺泡壁较薄，少部分肺泡细胞出现轻微水肿，炎性细胞浸润较少，肺泡结构较清晰。

4.4肺系数。

肺系数的增加可能是与肺组织结构的异常重塑有关，在众多细胞因子的催化下肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，促进胶原合成与分泌，细胞外基质沉积增多，从而使肺重及肺系数增加，所以以测定肺系数可间接反映肺组织纤维化的程度。

如图3所示，与空白组比较，模型组的肺系数明显升高(P<0.01)。与模型组比较，人参皂苷Rg5高剂量组肺系数明显降低(P<0.01)，而人参皂苷Rg5低剂量组肺系数呈下降趋势，但无统计学差异。

4.5血清中HYP水平。

HYP参与胶原蛋白的合成，是胶原蛋白的主要成分，其含量高达13.4％，故可作为评价机体组织内胶原含量的尺度。如图4所示，与空白组相比，模型组血清中HYP水平显著升高，且差异具显著性统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，人参皂苷Rg5高剂量组与人参皂苷Rg5低剂量组血清HYP水平均明显降低，差异具有显著性统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

4.6血清中NF-κB水平。

NF-κB激活后可以调控能够多种细胞因子，发挥促炎，促纤维化作用，又可影响机体的氧化和抗氧化系统，因此NF-κB的活化可能是肺纤维化发生的重要环节。此外，NF-κB还可促使TNF-α、IL-8与TGF-β等细胞因子通过转录的方式而介导形成肺泡炎进而发展纤维化。

如图5所示，与空白组相比，模型组血清中NF-κB水平显著升高，且差异具显著性统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，阳性组、人参皂苷Rg5高剂量组与人参皂苷Rg5低剂量组血清NF-κB水平均明显降低，差异具有显著性统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。

4.7血清中MMP-1水平。

MMP-1是MMPs中降解I型胶原的关键酶，I型胶原降解减少会导致过量ECM沉积而导致纤维化。如图6所示，与空白组相比，模型组血清中MMP-1水平显著降低，且差异具显著性统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，阳性组、人参皂苷Rg5高剂量组与人参皂苷Rg5低剂量组水平升高，具有显著性统计学差异(P<0.01、P<0.01、P<0.01)。

4.8血清中TGF-β水平。

TGF-β作为一种转化生长因子，可以促进某些细胞如成纤维细胞分化、生长与增殖，其在在肺纤维化形成与发展过程中起关键作用，在肺纤维化的形成与发生过程中，TGF-β通过刺激成纤维细胞与肺泡上皮细胞向肌成纤维细胞与间充质细胞转化，刺激合成大量胶原产生促进肺部细胞外基质沉积，从而促进肺纤维化的发展进程。

如图7所示，与空白组相比，模型组血清中TGF-β水平显著升高，且差异具显著性统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，阳性组、人参皂苷Rg5高剂量组与人参皂苷Rg5低剂量组TGF-β水平均明显降低，差异具有显著性统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。

以上实验结果表明，人参皂苷Rg5能够通过抑制炎症发生与胶原纤维形成并促进胶原纤维的降解等多方面阻碍肺纤维化发展进程，发挥抗肺纤维化病药理作用，可应用于治疗肺纤维化。

实施例2人参皂苷Rg5抗TGF-β诱导的体外肺纤维化模型作用研究。

1.实验材料。

1.1细胞。

人胚肺成纤维细胞株(MRC-5)购于中国医学科学院基础医学研究所。

1.2仪器和试剂。

高糖DMEM培养基(美国Gibco公司，批号：8120246)；胎牛血清(美国Gibco公司，批号：8166872)；青、链霉素(美国Hyclone公司，批号：J160035)；PBS磷酸盐缓冲液(北京Solarbio公司，批号：1015M023)；MTT(北京Solarbio公司，批号：303H0525)；DMSO(美国Sigma公司，批号：520C0313)；十二烷基硫酸钠(批号：J0719A；大连美仑生物技术有限公司)；甘氨酸(批号：S0812A；大连美仑生物技术有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(批号：S0721A；大连美仑生物技术有限公司)；氯化钠(批号：20190428；天津市百世化工有限公司)；RIPA裂解液(批号：072219190802；碧云天生物技术有限公司)；PMSF(批号：042819190617；碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：011819190819；碧云天生物技术有限公司)；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(批号：022219190801；碧云天生物技术有限公司)；彩虹180广谱蛋白marker(批号：PR1910；北京索莱宝科技有限公司)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(批号：081519190903；碧云天生物技术有限公司)；丽春红染色液(批号：030419190826；碧云天生物技术有限公司)；抗α-SMA兔多克隆抗体(批号：I09012510；沈阳万类生物科技有限公司)；抗β-actin兔多克隆抗体(批号：2127；美国Absci公司)；HRP标记的羊抗兔IgG抗体(批号：26A069；沈阳万类生物科技有限公司)；超敏ECL化学发光试剂盒(批号：041019190725；碧云天生物技术有限公司)；Western一抗二抗去除液(强碱性)(批号：032719190814；碧云天生物技术有限公司)；NU-4750型CO₂培养箱(美国NUAIRE公司)；HD₂-BCN-1360B生物洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；AE31EF型倒置显微镜(Motic公司)；Caretium酶标仪(深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司)；U570-86 Premium系列超低温冰箱(-80℃)(美国NBS公司)；TDZ4-WS低速台式离心机(湘仪离心机)；滤器(0.22μm)(Millex.GP)；细胞培养瓶(Corning公司)；96孔无菌培养板(Corning公司)；6孔无菌培养板(Corning公司)；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司)；ChemiScope6600Touch超灵敏多功能荧光化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)。

2.主要试剂的配制。

(1)高糖DMEM完全培养液：取适量高糖DMEM培养基，加10％于56℃灭活的胎牛血清与1％的双抗，0.22μm滤膜过滤，4℃冰箱保存备用。

(2)MTT溶液：称取50mg MTT，用10mL的PBS(pH 7.4，0.01mol/L)将MTT溶解，用0.22μm的微孔滤器过滤除菌，分装，-20℃避光保存备用。

3.实验方法。

3.1人参皂苷Rg5的细胞毒性。

取对数生长期的MRC-5细胞，将细胞浓度调整为3×10⁴个/mL，100μL/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，以终浓度分别为0.001μmol/mL、0.01μmol/mL、0.1μmol/mL、1μmol/mL、10μmol/mL的含人参皂苷Rg5和阳性药的培养液与TGF-β1 10ng/mL培养24h后，同时设定空白对照组、模型组(TGF-β1 10ng/mL)与调零孔，每组3个复孔，采用MTT法测定人参皂苷Rg5细胞毒性。

增殖抑制率(％)＝(1-(A_实验-A_调零)/(A_空白-A_调零))×100％。

3.2人参皂苷Rg5对肺成纤维细胞转分化成肌成纤维细胞的作用。

取对数生长期的MRC-5细胞，调整细胞浓度为1.5x10⁵/mL，2mL/孔接种于6孔板中，培养24h后去除培养液，换入含不同浓度药物的无血清培养液，分别设置空白对照组、模型组、阳性药组、人参皂苷Rg5组，除空白对照组外，其余各组加TGF-β1刺激(终浓度10ng/mL)。培养48h后，按照RIPA裂解液说明书加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)，使PMSF终浓度为1mM，去除培养液后用PBS洗一遍。按照6孔板每孔加入200微升裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。充分裂解后，4℃离心机离心5min，12000r/min，取上清。BCA法检测蛋白浓度，根据蛋白浓度测定值调整上样量，用裂解液将各组蛋白补齐体积配制成等浓度等体积蛋白液，使各组蛋白浓度均为2.5mg/mL，分装-80℃保存。按体积比4：1加蛋白液及5×上样缓冲液，100℃5min加热变性后上样，进行SDS-PAGE电泳，转膜，5％脱脂牛奶中摇床上4℃封闭2h，抗体孵育，WB法检测α-SMA蛋白表达水平。

4.数据处理。

利用SPSS 17.0统计软件，组间比较采用One-Way ANOVA方法。当方差齐时运用LSD检验，方差不齐时运用Dunnett’s T3检验。(注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。)。

5.实验结果。

5.1细胞毒性。

按上述实验方法，得到以下结果。人参皂苷Rg5对TGF-β1刺激后的MRC-5细胞的增殖抑制率如图8所示，当人参皂苷Rg5浓度为10μmol/mL时，抑制率为(30.349±2.125)％，无论与空白对照组或与模型组相比，均具有显著性统计学差异(P<0.01，P<0.01)，表现出明显的细胞毒性。故选用1μmol/mL作为后续实验检测浓度。

5.2α-SMA的表达情况。

α-SMA是肌成纤维细胞活化的重要标志，其表达程度与肺纤维化严重程度呈正相关性，可以用来评价肺纤维化进程。

Western-blot法检测α-SMA蛋白水平，蛋白表达结果如图9图10所示。与空白对照组相比，模型组α-SMA蛋白表达条带增强，相对灰度值升高(P<0.01)。经给药后，与模型组相比，人参皂苷Rg5组α-SMA蛋白表达水平降低，相对灰度值降低程度具统计学差异(P<0.05)，而阳性药对α-SMA蛋白表达具降低趋势但无明显统计学差异，表明人参皂苷Rg5对α-SMA蛋白表达水平的降低作用优于阳性药。

以上实验结果表明，人参皂苷Rg5能够降低肌成纤维细胞中的α-SMA的表达，表明人参皂苷Rg5对TGF-β1诱导肺成纤维细胞中转分化成肌成纤维细胞具有一定的抑制作用，可应用于治疗肺纤维化。

实施例3含人参皂苷Rg5制剂的研究。

1.仪器和试剂。

仪器有TDP-5T单冲压片机(上海冠联制药装备有限公司)；FA-1004型电子天平(上海精科天平厂)；水浴锅(巩义市予化仪器有限责任公司)；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱。实验中所用试剂均为分析纯，购于禹王试剂公司。

2.片剂制备。

取人参皂苷Rg510 g，可压淀粉30g，用7mL 80％乙醇制成软材，以捏之成团，搓之即散做为成型标准成型，将制好的颗粒于60℃烘干处理12h，过10目筛，筛选出颗粒，备用；将制好的颗粒称重，按照颗粒重量0.5％的量加入硬脂酸镁，以不同规格的压片机压片，分别制备片重为200mg/片和100mg/片的片剂，压力在16-18kg/片；片剂中每200mg含苯乙醇苷50mg。结合患者具体症状给药，建议每天服用两次，每次2片(50mg/片)，每日2次。

3.胶囊剂的制备。

以上述制备好的颗粒，采用胶囊机装胶囊，制备200mg/囊的胶囊剂。结合患者具体症状给药，建议服用剂量为每次2粒，每日2次。

4.口服液的制备。

取人参皂苷Rg520g，加水300mL溶解，加橙皮苷4mL，加单糖浆至1000mL得糖浆剂。结合患者具体症状给药，建议服用剂量每次15mL，每日2次。