液相色谱-串联质谱法测定血浆中氯雷他定浓度的方法
阅读说明：本技术 液相色谱-串联质谱法测定血浆中氯雷他定浓度的方法 (Method for determining concentration of loratadine in plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry ) 是由 张鹏 杨丹丹 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药检测领域,涉及液相色谱-串联质谱法测定血浆中氯雷他定浓度的方法,尤其是测定大鼠血浆中氯雷他定浓度的方法。本发明测定大鼠血浆中氯雷他定的含量的方法,具体步骤如下：(1)血浆样品的制备；(2)液液萃取处理；(3)液相色谱-串联质谱法测定。本发明中,向血浆样品中加入内标工作溶液地西泮溶液和氢氧化钠溶液,并采用甲基叔丁基醚对血浆进行萃取,通过液相色谱-串联质谱测定血浆中氯雷他定浓度。本发明的方法能够快速检测大鼠血浆中氯雷他定的含量,测定结果灵敏,快速,精密度好。而且克服了现有技术中其他方法复杂,检测限高等问题。(The invention belongs to the field of medicine detection, and relates to a method for determining the concentration of loratadine in blood plasma by using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method, in particular to a method for determining the concentration of loratadine in blood plasma of rats. The invention relates to a method for measuring the content of loratadine in rat plasma, which comprises the following steps: (1) preparing a plasma sample; (2) liquid-liquid extraction treatment; (3) liquid chromatography-tandem mass spectrometry. In the invention, an internal standard working solution diazepam solution and a sodium hydroxide solution are added into a plasma sample, methyl tert-butyl ether is adopted to extract the plasma, and the concentration of loratadine in the plasma is measured by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The method can quickly detect the content of the loratadine in the plasma of the rat, and has the advantages of sensitive and quick determination result and good precision. And the problems of complexity, high detection limit and the like of other methods in the prior art are solved.)
技术领域
本发明属于医药检测领域，涉及液相色谱-串联质谱法测定血浆中氯雷他定浓度的方法，尤其是测定大鼠血浆中氯雷他定浓度的方法。
背景技术
过敏性疾病作为一种常见的疾病，已渐渐成为全球关注的健康问题，受到了全球医护人员以及政府的关注。据报道，世界卫生组织的数据显示，目前全球有亿人患有过敏性疾病，且该病的发病率近年来迅猛上升。已将过敏性疾病列为二十一世纪需要重点研究和防治的三大疾病之一。临床上用于治疗过敏性鼻炎的抗组胺药物品种多，用药历史悠久。抗组胺药物的作用机理为选择性与组胺靶细胞上的受体结合而发挥抗组胺作用。
氯雷他定是一种高效的、高选择性抑制外周组胺受体的第二代抗组胺药。其化学名称为4-(8-氯-5，6-二氢-11H-苯并[5，6]环庚并[1，2-b]吡啶-11-亚基)-1-哌啶羧酸乙酯，主要用于治疗季节性或常年性过敏性鼻炎，也可以用于缓解慢性荨麻疹及其他过敏性皮肤病的症状。因其对外周神经受体具有高选择性，而对中枢神经系统的受体亲和性较低。同时对乙酰胆碱和肾上腺素受体作用极少，因此氯雷他定与第一代抗组胺药物相比较，不易透过血脑屏障，无明显的中枢抑制和抗胆碱作用。氯雷他定进入体内起效迅速、作用持久，不仅因为氯雷他定有高选择性，而且其在体内的代谢产物地氯雷他定仍有药理学活性。该方法的建立可以应用于药代动力学研究，毒代动力学研究，生物等效性研究等。
发明内容
本发明目的旨在采用一种简单，快速，灵敏度高，精密度好的方法，测定大鼠血浆中氯雷他定的含量。本发明采用液液萃取方法作为样本的前处理技术，采用C18柱，利用液相色谱串联质谱作为检测器对氯雷他定进行检测分析。克服了其他方法复杂，检测限高等问题，快速检测大鼠血浆中氯雷他定的含量，测定结果灵敏，快速，精密度好。
本发明是通过如下方案实现的：
本发明通过对萃取试剂的条件进行优化，对流动相的参数，质谱的参数等进行优化，选用最优的条件，满足了定量检测的要求。
本发明测定大鼠血浆中氯雷他定的含量的方法，具体步骤如下：
(1)血浆样品的制备；
(2)液液萃取处理；
(3)液相色谱-串联质谱法测定；
其中，
步骤(1)中向血浆样品中加入内标工作溶液和氢氧化钠溶液，混匀；所述的内标工作溶液为地西泮溶液，其浓度为：10-20ng·mL-1，加入量为：标准曲线工作溶液中间浓度的响应强度(5-10ng·mL-1)；所述的氢氧化钠溶液，其浓度为：0.5-1mol·L-1，加入量为：与血浆体积比为1：2-3。
步骤(2)中向步骤(1)中的血浆样品中加入萃取剂，涡旋2-3min，3500-4000rpm·min-1离心10-15分钟，提取上清液，氮气吹干，乙腈复溶，涡旋2-3min，13000-15000rpm·min-1离心5-10分钟。血浆体积：萃取剂体积：1：10-20；乙腈复溶加入量为：100μL；
所述的萃取剂选自乙醚，甲基叔丁基醚，乙酸乙酯，正己烷中的一种或多种混合物，优选甲基叔丁基醚；
步骤(3)中液相色谱条件如下：
色谱柱：色谱柱：Phenomenex Kinetex C18(50mm×2.1mm，2.6μm)；
流动相：流动相A(水，含0.2-0.5％甲酸):流动相B(乙腈，含0.2-0.5％甲酸)＝30:70-80:20；洗针液为纯乙腈；等度洗脱；流速：0.2mL·min-1；柱温：35℃；进样量：5μL；自动进样器温度：4℃；
质谱条件如下：
离子源：电喷雾电离源(ESI源)；
检测方式：正离子模式；多反应离子检测(MRM)；
雾化器流量：3L·min-1；加热器流量：10L·min-1；接口温度：300℃；接口电压：4.0KV；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥器流量：10L·min-1；监测离子对：m/z 383.1>337.2(氯雷他定)，m/z 284.9>193.25(地西泮)；碰撞能：30(氯雷他定)，30(地西泮)；停留时间：0.2。
本发明的方法能够快速检测大鼠血浆中氯雷他定的含量，测定结果灵敏，快速，精密度好。而且克服了现有技术中其他方法复杂，检测限高等问题。
附图说明
图1为实施例2中血药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
实施例1方法学考察
(1)储备溶液的制备
精密称量适量氯雷他定，溶解后作为制备标准曲线的储备液以及制备质控样品的储备液。精密称量适量地西泮，作为内标溶液的储备液。
(2)工作溶液的制备
用乙腈稀释上述氯雷他定储备溶液分别制得标准曲线样本工作溶液以及质控样本工作溶液，于4℃条件下棕色容量瓶中储存。用乙腈稀释上述地西泮储备溶液制得内标工作溶液，于4℃条件下棕色容量瓶中储存。氢氧化钠溶液于4℃条件下储存。
(3)模拟血浆样本的制备
制备标准曲线样本，制备质控样本，制备测试样本，制备空白样本，制备定量下限样本，制备定量上限样本；
(4)预制备样本的制备
向上一步得到的标准曲线样本，质控样本，测试样本，定量下限样本，定量上限样本中，加入内标工作溶液和氢氧化钠溶液，混匀；空白基质样本不加入标准溶液及内标溶液；
(5)液液萃取处理过程
步骤(4)中加入萃取剂，涡旋2-3min，3500-4000rpm·min-1离心10-15分钟，提取上清液，氮气吹干，乙腈复溶，涡旋2-3min，13000-15000rpm·min-1离心5-10分钟。血浆体积：萃取剂：1：10-20；乙腈复溶加入量为：100μL；
所述的萃取剂选自乙醚，甲基叔丁基醚，乙酸乙酯，正己烷等的一种或多种混合物：
选用乙醚作为萃取剂，按照步骤(5)进行样品处理，以提取回收率及基质效应作为指标进行考察分析，其提取回收率为84-110％，基质效应超过规定的±15％；
选用甲基叔丁基醚作为萃取剂，按照步骤(5)进行样品处理，以提取回收率及基质效应作为指标进行考察分析，其提取回收率为88-104％，基质效应在规定的±15％以内；
选用乙酸乙酯作为萃取剂，按照步骤(5)进行样品处理，以提取回收率及基质效应作为指标进行考察分析，其提取回收率为46-79％，变化差异较大，基质效应超过规定的±15％；
选用乙醚-正己烷(1：1)作为萃取剂，按照步骤(5)进行样品处理，以提取回收率及基质效应作为指标进行考察分析，其提取回收率为87-126％，基质效应在规定的±15％以内；
选用甲基叔丁基醚-正己烷(1：1)作为萃取剂，按照步骤(5)进行样品处理，以提取回收率及基质效应作为指标进行考察分析，其提取回收率为80-106％，基质效应在规定的±15％以内；
综上，所述的萃取剂选自乙醚，甲基叔丁基醚，乙酸乙酯，正己烷等的一种或多种混合物，优选甲基叔丁基醚；
(7)上清液分析
(8)系列标准曲线和线性范围
系列标准曲线样本工作溶液的浓度为0.02ng·mL-1，0.05ng·mL-1，0.1，0.5ng·mL-1，1.0ng·mL-1，5.0ng·mL-1，10.0ng·mL-1，20.0ng·mL-1，50.0ng·mL-1，100.0ng·mL-1，200.0ng·mL-1。精密量取空白血浆50-100μL，加入系列标准溶液50-100μL，配制相当于氯雷他定血浆质量浓度为0.04、0.1、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0和400.0ng·mL-1的样品溶液；结果表明，氯雷他定在0.04-400.0ng·mL-1的浓度范围内呈良好的线性相关性，定量下限可达0.04ng·mL-1。
(9)方法的精密度与准确度
精密量取空白血浆50-100μL，加入对应的标准溶液50-100μL，配制相当于氯雷他定血浆质量浓度为0.08ng·mL-1，4.0ng·mL-1，300ng·mL-1的质控样品；结果表明，该方法的准确度均在±15％以内，批间精密度分别为7.78％，13.38％，10.70％，批内精密度分别为7.58％，6.34％，6.48％，均符合要求。
(10)提取回收率和基质效应
步骤(9)所配制的质控样品溶液，除不加乙腈外，其余按步骤(5)操作，每一浓度平行6样本分析，得到经预处理的峰面积A；另取空白血浆50-100μL，经步骤(5)操作后获得的上清液加入内标溶液和步骤(9)所配制的质控样品溶液，每一浓度平行6样本分析，得到未经处理的样品峰面积B；精密量取水50-100μL代替空白血浆，加入乙腈，经步骤(5)操作后获得的上清液依次加内标溶液和步骤(9)所配制的质控样品溶液，每一浓度平行6样本分析，获得无基质样品溶液的平均峰面积C。用同一浓度2种不同处理方法的峰面积比值(A/B×100％)，求算氯雷他定的提取回收率；以同一浓度2种不同处理方法的峰面积比值(B/C×100％)计算氯雷他定和内标的基质因子，再通过氯雷他定的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。结果表明，低，中，高三个质控样品的提取回收率分别为104.0％，93.89％，89.50％，内标的提取回收率为87.61％，均符合要求，内源性物质对测定无干扰。
实施例2实际样品的测定
步骤(1)中，吸取上清液进行液质分析，液相色谱条件如下：色谱柱：PhenomenexKinetex C18(50mm×2.1mm，2.6μm)；流动相：流动相A(水，含0.2％甲酸):流动相B(乙腈，含0.2％甲酸)＝55:45；洗针液为纯乙腈；等度洗脱；流速：0.2mL·min-1；柱温：35℃；进样量：5μL；自动进样器温度：4℃；质谱条件如下：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；检测方式：正离子模式；多反应离子检测(MRM)；雾化器流量：3L·min-1；加热器流量：10L·min-1；接口温度：300℃；接口电压：4.0KV；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥器流量：10L·min-1；监测离子对：m/z 383.1>337.2(氯雷他定)，m/z 284.9>193.25(地西泮)；碰撞能：30(氯雷他定)，30(地西泮)；停留时间：0.2。
步骤(2)中，储备液使用乙腈进行溶解，制备好的储备液需放置于4℃冰箱中，密封保存。
步骤(3)中，系列标准曲线样本工作溶液的浓度为0.02ng·mL-1，0.05ng·mL-1，0.1ng·mL-1，0.5ng·mL-1，1.0ng·mL-1，5.0ng·mL-1，10.0ng·mL-1，20.0ng·mL-1，50.0ng·mL-1，100.0ng·mL-1，200.0ng·mL-1。质控样本工作溶液浓度为0.04ng·mL-1，2.0ng·mL-1，150ng·mL-1，内标工作溶液浓度为10-20ng·mL-1，氢氧化钠溶液浓度为0.5-1mol·L-1。
步骤(4)中，血浆样本量为50-100μL；内标工作溶液、氢氧化钠溶液的加入量为50-100μL；标准曲线，质控工作溶液的加入量为50-100μL。
步骤(5)中，向标准曲线，质控，测试样本，定量下限及定量上限样本中，加入内标工作溶液和氢氧化钠50-100μL，混匀；向空白基质中，加入乙腈50-100μL，混匀；
步骤(6)中，加入萃取剂，涡旋2-3min，3500-4000rpm·min离心10-15分钟，提取上清液，氮气吹干，乙腈复溶，涡旋2-3min，13000-15000rpm·min离心5-10分钟。血浆体积：萃取剂：1：20；乙腈复溶加入量为：100μL；
步骤(7)中，所述的萃取剂选自乙醚，甲基叔丁基醚，乙酸乙酯，正己烷等的一种或多种混合物，优选甲基叔丁基醚；
步骤(8)中，液相色谱条件中的等度洗脱，A相与B相比例为55:45。
步骤(9)中，取出预先采集的血浆样品进行实际样品的测定，按照步骤(5)中对血浆样品进行处理操作，取上清液进行分析，同时测定低、中、高3个浓度的质控样品，每个浓度进行多样本分析，以判断每批样品测定结果的可靠性。
步骤(10)中，SD大鼠12只，体重200±20g，随机分为两组。实验前禁食12h，然后分别灌胃给予市售氯雷他定片剂以及氯雷他定纳米混悬剂，给药剂量为10mg·kg-1。分别于给药后0.083，0.167，0.33，0.50，0.75，1，2，4，6，8,12，24h眼眶取血约400μL，放置于预先处理好的离心管中，8000rpm离心10min,分离得血浆，按照步骤(6)进行血浆样品的预处理；按照步骤(1)对实际生物样品进样分析。计算后得到各时间点的血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线图(图1)，经DAS 2.1软件计算药动学参数(表1)。
结果表明，应用该方法测定大鼠血浆中氯雷他定的血药浓度符合相关要求，可用于氯雷他定纳米混悬剂在大鼠体内的药代动力学研究。
表1
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