一种甜菜碱半抗原、甜菜碱抗原、其制备方法及单克隆抗体的制备方法
阅读说明：本技术 一种甜菜碱半抗原、甜菜碱抗原、其制备方法及单克隆抗体的制备方法 (Betaine hapten, betaine antigen, preparation method of betaine antigen and preparation method of monoclonal antibody ) 是由 廖智星 李广乐 张娟 马钱瑶 蔡传良 阮仕环 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种甜菜碱半抗原、甜菜碱抗原的制备方法及单克隆抗体的制备方法,将甜菜碱半抗原与载体蛋白相偶联制备出甜菜碱抗原,运用本发明制备的甜菜碱抗原免疫BALB/c小鼠获得脾细胞,再将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得能高效价分泌甜菜碱单克隆抗体的杂交瘤细胞。(The invention provides a preparation method of betaine hapten, a betaine antigen and a preparation method of a monoclonal antibody.)
技术领域
本发明涉及单克隆抗体检测技术领域，具体涉及一种甜菜碱半抗原、甜菜碱抗原、其制备方法及单克隆抗体的制备方法。
背景技术
甜菜碱（Betaine）一种具有重要生理功能的物质，其分子量为117D。其主要生理功能有：1、参与同型半胱氨酸的代谢。胆碱在体内被氧化为甜菜碱，是甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶反应的底物，在该酶的作用下甲基从甜菜碱转移到同型半胱氨酸上，分别产生二甲基甘氨酸和蛋氨酸，从而降低了体内同型半胱氨酸的含量。2、高效的甲基供体。由于甜菜碱特殊的化学结构，使得甜菜碱拥有三个高效的甲基供体可为机体提供甲基。甜菜碱在供甲基过程中，可节约一部分蛋氨酸，降低人体内因蛋氨酸缺乏而导致患病的风险。3、调节脂肪代谢。甜菜碱能提供甲基给甲基氨基乙醇从而而生成胆碱，胆碱在脂类代谢中发挥作用，从而促进脂肪酸氧化和磷脂的合成，提高脂类的运转速度，降低肝脏中甘油三醋的含量，减少脂肪肝发生的风险。4、调节细胞内外渗透压、减少应激反应。在机体内渗透压发生激变时，甜菜碱可作为细胞的渗透保护剂，起到缓冲的作用。当机体内的组织渗透压发生变化时，甜菜碱可被细胞吸收，从而调节细胞内外渗透压，减少盐类进入细胞以及细胞内水分的流失。
目前对于人体中甜菜碱含量的检测的仪器和检测方法各有不同，主要紫外分光光度法、高效液相色谱法、质谱法等。其中，紫外分光光度法准确度一般，检测时受到的干扰因素较多，对样本的类型及前处理要求较高。高效液相色谱法和质谱法中的前处理技术繁琐耗时、需要较多有机溶剂，且样本的需要量较大，并且需要专门技术人员进行操作，检测方法繁杂，检测时间较长，所以不易推广。
发明内容
为解决上述问题，本申请提供一种甜菜碱半抗原、甜菜碱抗原的制备方法及单克隆抗体的制备方法。为实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，一种甜菜碱半抗原，分子式结构如式(Ⅰ)所示：
需要说明的是，甜菜碱半抗原拥有三个甲基，可为生物机体提供甲基，使得甜菜碱可以代替一部分蛋氨酸为机体提供甲基，从而节省一部分的蛋氨酸，降低人体因蛋氨酸缺乏而导致的患病风险。
进一步地，基于前述半抗原的开发，本发明提供一种甜菜碱抗原的制备方法，采用甜菜碱半抗原与载体蛋白通过混合酸酐法偶联得到。
具体地，所述载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白中的任意一种或多种。
具体的，甜菜碱抗原的制备方法包括步骤：
①将1mg甜菜碱半抗原溶解于1mL的二甲基亚砜中，得到浓度为1mg/ml甜菜碱半抗原溶液；
②在所述甜菜碱半抗原溶液中加入1μL三丙胺和1μL氯甲酸异丁酯进行活化反应，在室温下活化反应20分钟，得到活化的甜菜碱半抗原溶液；
③取100μL活化的甜菜碱半抗原溶液，向其中加入10mg载体蛋白进行偶联，制备得所述甜菜碱抗原；
进一步地，对于上述制备的甜菜碱抗原，需要用Sephadex G-25凝胶层析柱进行提纯，提纯后的甜菜碱抗原置于-20℃下保存备用。
根据第二方面，本发明提供一种甜菜碱单克隆抗体，由本发明所述甜菜碱抗原免疫BALB/c小鼠后制备得到，包括如下步骤：
①将甜菜碱抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活BALB/c小鼠腹腔内的脾细胞产生甜菜碱抗体；
②将所述产生甜菜碱抗体的BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌甜菜碱单克隆抗体的杂交瘤细胞。
③将石蜡油注射到所述BALB/c小鼠腹腔内，10～14天后收集腹水，所述采集到的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化,计算分子量和单抗亚类。
具体地，对甜菜碱抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活所述BALB/c小鼠体内的脾细胞产生甜菜碱抗体的步骤包括：
①用100μg所述甜菜碱抗原与福氏完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射BALB/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；
②3周后再用100μg所述甜菜碱抗原与福氏不完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射BALB/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；
③此后每2周用50μg的甜菜碱抗原注BALB/c小鼠的腹腔，期间用载体竞争ELISA法测定血清效价。
具体地，载体竞争ELISA法测定血清效价包括步骤：
①所述甜菜碱抗原用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100 μL包被96孔酶标板，4℃过夜，用PBST清洗3次所述96孔酶标板，每次3分钟；
②加入载体蛋白与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40分钟，洗板3次，每次3分钟；
③加入酶标羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃，30分钟，洗板3次；
④加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15分钟；
⑤加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照。
具体地，将产生甜菜碱抗体的BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌甜菜碱单克隆抗体的杂交瘤细胞的步骤包括：
①采用PEG细胞融合技术将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，得到融合细胞；
②负筛，去除大量针对载体蛋白的阳性孔，得到甜菜碱阴性克隆；
③正筛，用阴性和阳性血清作对照，选择阳性克隆进入下一轮筛选，得到甜菜碱阳性克隆；
④竞争优选杂交瘤细胞；将所述甜菜碱阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体，即为优选出的杂交瘤细胞。
具体地，本发明所使用的碳酸盐缓冲液为0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液。
本发明的有益效果在于：
本发明首次提出了甜菜碱半抗原和甜菜碱抗原，并制备了甜菜碱单克隆抗体，填补了国内外在本领域的技术空白。在此之前没有甜菜碱单克隆抗体制备及相关技术研究，利用本发明提供的甜菜碱半抗原与多种载体蛋白的偶联物制备甜菜碱单克隆抗体，制备过程简便、经济、效价高、灵敏度高、实用前景大。
附图说明
图1为甜菜碱半抗原结构图。
具体实施方式
本发明公开了一种甜菜碱单克隆抗体的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明提供的甜菜碱单克隆抗体的制备方法中所用材料或试剂均可由市场购得。
实施例一
本实施例提供一种甜菜碱单克隆抗体的制备方法。
本方法所制备甜菜碱抗原所运用的载体蛋白是牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumi，BSA)，所制备的甜菜碱抗原为Betaine-BSA，采用混合酸酐法制备免疫原兼检测原Betaine-BSA，操作方法如下：
a、称取1mg Betaine，室温溶解于1mL的二甲基亚砜中，溶解后的终浓度为1mg/ml；
b、上述溶液中分别加入1μl的三丙胺和1μl的氯甲酸异丁酯进行活化反应，室温混匀反应20分钟；
c、上述活化反应完成后取100μL的活化后的Betaine，向其中加入10mg的BSA，室温反应60分钟；
d、采用Sephadex G-25凝胶层析柱纯化上述连接产物，获得的最终产物为Betaine-BSA连接物，使其蛋白终浓度为10mg/ml，置于-20℃下保存备用。
利用甜菜碱抗原进行动物免疫以及效价评定包括步骤：
首次免疫：用100μg Betaine-BSA与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2天；
二次免疫：3周后再用100μg Betaine-BSA与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫；
三次免疫：此后每2周用半量 Betaine-BSA重复腹腔加强免疫。
免疫完成后，要用BSA竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA 程序包括步骤：
A、将Betaine-BSA用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔 100μL包被96孔酶标板，置于冰箱中4℃过夜；
B、将稀释后的Betaine-BSA用PBST洗板3次，每次洗板3分钟；
C、加入1μg/mL的BSA与等量系列稀释的血清共100μL，在37℃的温度下反应40分钟，用PBST板洗板3次；
D、加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，用PBST板洗板3次；
E、加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10-15分钟；
F、加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照，经检测血清中抗体滴度为1:2×105。
当获得能产生甜菜碱单克隆抗体的健康BALB/c雌性小鼠的脾细胞后，进行细胞融合与筛选实验。
对BALB/c雌性小鼠的尾静脉加强免疫1次，3天后取其脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进的正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
(1)负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体BSA用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96 孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3分钟；加入细胞培养上清液100μL，37℃ 反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
(2)正筛选择针Betaine的目标克隆：用甜菜碱筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用Betaine(1μg/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃板内反应40分钟，洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4 000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液， 每孔100μL，37℃下反应10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；
(3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的甜菜碱阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用Betaine-BSA(1μg/mL)包被ELISA板， 洗涤后加入Betaine标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；
当获得能够稳定分泌甜菜碱单克隆抗体的杂交瘤细胞后，需要对BALB/c雌性小鼠进行腹水制备与抗体特性研究，包括如下步骤：
A、注射0.5～1.0mL高压灭菌的石蜡油到若干只10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔；
B、1周后再注入2×106个杂交瘤细胞至雌性BALB/c小鼠腹腔；
C、根据小鼠的腹部膨大情况，10～14天后收集雌性BALB/c小鼠腹腔的腹水，间接采用ELISA法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，并用SDS-PAGE电泳分析；
D、利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量，用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类，计算亲和常数。
需要说明的是，经计算甜菜碱单克隆抗体亲和力为2.0×109L/mol。
实施例二
本实施例提供另一种甜菜碱单克隆抗体的制备方法。
其中本方法所制备的甜菜碱抗原所运用的载体蛋白是卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)，所制备的甜菜碱抗原为Betaine-OVA，采用混合酸酐法制备免疫原兼检测原Betaine-OVA，操作方法如下：
a、称取1mg Betaine，室温溶解于1mL的二甲基亚砜中，溶解后的终浓度为1mg/ml；
b、上述溶液中分别加入1μl的三丙胺和1μl的氯甲酸异丁酯进行活化反应，室温混匀反应20分钟；
c、上述活化反应完成后取100μL的活化后的Betaine，向其中加入10mg的OVA，室温反应60分钟；
d、采用Sephadex G-25凝胶层析柱纯化上述连接产物，获得的最终产物为Betaine-OVA连接物，使其蛋白终浓度为10mg/ml，置于-20℃下保存备用。
利用甜菜碱抗原进行动物免疫以及效价评定包括步骤：
首次免疫：用100μg Betaine-OVA与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2天；
二次免疫：3周后再用100μg Betaine-OVA与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫；
三次免疫：此后每2周用半量 Betaine-OVA重复腹腔加强免疫。
免疫完成后，要用OVA竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA 程序包括步骤：
A、将Betaine-OVA用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔 100μL包被96孔酶标板，置于冰箱中4℃过夜；
B、将稀释后的Betaine-OVA用PBST洗板3次，每次洗板3分钟；
C、加入1μg/mL的OVA与等量系列稀释的血清共100μL，在37℃的温度下反应40分钟，用PBST板洗板3次；
D、加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，用PBST板洗板3次；
E、加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10-15分钟；
F、加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照，经检测血清中抗体滴度为1: 1.2×105。
当获得能产生甜菜碱单克隆抗体的健康BALB/c雌性小鼠的脾细胞后，进行细胞融合与筛选实验。
对BALB/c雌性小鼠的尾静脉加强免疫1次，3天后取其脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进的正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
(1)负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体OVA用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96 孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3分钟；加入细胞培养上清液100μL，37℃ 反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
(2)正筛选择针Betaine的目标克隆：用甜菜碱筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用Betaine(1μg/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃板内反应40分钟，洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4 000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃下反应10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；
(3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的甜菜碱阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用Betaine-OVA (1μg/mL)包被ELISA板， 洗涤后加入Betaine标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；
当获得能够稳定分泌甜菜碱单克隆抗体的杂交瘤细胞后，需要对BALB/c雌性小鼠进行腹水制备与抗体特性研究，包括如下步骤：
A、注射0.5～1.0mL高压灭菌的石蜡油到若干只10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔；
B、1周后再注入2×106个杂交瘤细胞至雌性BALB/c小鼠腹腔；
C、根据小鼠的腹部膨大情况，10～14天后收集雌性BALB/c小鼠腹腔的腹水，间接采用ELISA法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，并用SDS-PAGE电泳分析；
D、利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量，用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类，计算亲和常数。
需要说明的是，经计算甜菜碱单克隆抗体亲和力为8.0×108L/mol。
实施例三
本实施例提供另一种甜菜碱单克隆抗体的制备方法。
其中本方法所制备的甜菜碱抗原所运用的载体蛋白是卵清蛋白(Ovalbumin，KLH)，所制备的甜菜碱抗原为Betaine-KLH，采用混合酸酐法制备免疫原兼检测原Betaine-KLH，操作方法如下：
a、称取1mg Betaine，室温溶解于1mL的二甲基亚砜中，溶解后的终浓度为1mg/ml；
b、上述溶液中分别加入1μl的三丙胺和1μl的氯甲酸异丁酯进行活化反应，室温混匀反应20分钟；
c、上述活化反应完成后取100μL的活化后的Betaine，向其中加入10mg的KLH，室温反应60分钟；
d、采用Sephadex G-25凝胶层析柱纯化上述连接产物，获得的最终产物为Betaine-KLH连接物，使其蛋白终浓度为10mg/ml，置于-20℃下保存备用。
利用甜菜碱抗原进行动物免疫以及效价评定包括步骤：
首次免疫：用100μg Betaine-KLH与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2天；
二次免疫：3周后再用100μg Betaine-KLH与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫；
三次免疫：此后每2周用半量 Betaine-KLH重复腹腔加强免疫。
免疫完成后，要用KLH竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA 程序包括步骤：
A、将Betaine-KLH用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔 100μL包被96孔酶标板，置于冰箱中4℃过夜；
B、将稀释后的Betaine-KLH用PBST洗板3次，每次洗板3分钟；
C、加入1μg/mL的KLH与等量系列稀释的血清共100μL，在37℃的温度下反应40分钟，用PBST板洗板3次；
D、加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，用PBST板洗板3次；
E、加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10-15分钟；
F、加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照，经检测血清中抗体滴度为1: 6×105。
当获得能产生甜菜碱单克隆抗体的健康BALB/c雌性小鼠的脾细胞后，进行细胞融合与筛选实验。
对BALB/c雌性小鼠的尾静脉加强免疫1次，3天后取其脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进的正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
(1)负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体OVA用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96 孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3分钟；加入细胞培养上清液100μL，37℃ 反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
(2)正筛选择针Betaine的目标克隆：用甜菜碱筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用Betaine(1μg/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃板内反应40分钟，洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4 000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃下反应10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；
(3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的甜菜碱阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用Betaine-KLH (1μg/mL)包被ELISA板， 洗涤后加入Betaine标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；
当获得能够稳定分泌甜菜碱单克隆抗体的杂交瘤细胞后，需要对BALB/c雌性小鼠进行腹水制备与抗体特性研究，包括如下步骤：
A、注射0.5～1.0mL高压灭菌的石蜡油到若干只10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔；
B、1周后再注入2×106个杂交瘤细胞至雌性BALB/c小鼠腹腔；
C、根据小鼠的腹部膨大情况，10～14天后收集雌性BALB/c小鼠腹腔的腹水，间接采用ELISA法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，并用SDS-PAGE电泳分析；
D、利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量，用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类，计算亲和常数。
需要说明的是，经计算甜菜碱单克隆抗体亲和力为6.0×109L/mol。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。