Tox3基因过表达作为肝癌预后标志物中的应用
阅读说明：本技术 Tox3基因过表达作为肝癌预后标志物中的应用 (Application of TOX3 gene overexpression as liver cancer prognosis marker ) 是由 陈红松 房琼璇 陈冬波 邓康健 廖维甲 谢兴旺 陈谱 于 2020-11-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了TOX3基因过表达作为肝癌预后标志物中的应用。本发明利用全基因组CRISPR激活文库筛选发现TOX3可以抑制检查点抑制剂CD155的表达。进一步利用TCGA肝癌RNA-seq数据进行免疫浸润分析,发现TOX3的表达水平与肝癌组织中NK细胞的浸润频率显著正相关,结合CD155对NK细胞的抑制作用,进一步提示TOX3可能通过抑制CD155激活NK细胞,从而有利于肝癌患者的预后。因此TOX3在肝癌中作为预后指标具有一定的潜在应用价值。(The invention discloses application of TOX3 gene overexpression as a liver cancer prognosis marker. The invention discovers that TOX3 can inhibit the expression of checkpoint inhibitor CD155 by utilizing whole genome CRISPR activation library screening. Further, TCGA liver cancer RNA-seq data is used for immune infiltration analysis, the expression level of TOX3 is found to be in significant positive correlation with the infiltration frequency of NK cells in liver cancer tissues, and the inhibition effect of CD155 on the NK cells is combined, so that TOX3 is further prompted to activate the NK cells by inhibiting CD155, and the prognosis of a liver cancer patient is facilitated. Therefore, the TOX3 has certain potential application value as a prognostic index in liver cancer.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及TOX3基因过表达作为肝癌预后标志物中的应用。
背景技术
原发性肝癌(HCC)是临床中最常见、最具侵袭性的恶性肿瘤之一，全世界每年约有50万例新发患者，并呈逐年上升趋势。肝癌具有多血管、恶性程度高、生长速度快、转移范围广和复发率高等特点，临床治疗效果不理想。治疗原发性肝癌最为有效的治疗手段就是手术切除，但术后复发率较高，5年内肿瘤复发率达40％，而且大多数患者就诊时已到疾病晚期，因不符合手术治疗指征及存在术后高复发率等问题丧失了根治性治疗的机会，因此，寻求新的预后指标和潜在治疗靶点是当务之急。
免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，可以调节免疫反应的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏，在肿瘤的发生、发展过程中，免疫检查点成为免疫耐受的主要原因之一。近年来的研究已证实，肿瘤细胞可凭借诸如对自身表面抗原修饰及改变肿瘤组织周围微环境等途径来逃避机体免疫系统的监控、识别与攻击而继续分裂生长，这就是肿瘤的免疫逃逸。肿瘤的免疫逃逸机制与机体对肿瘤的免疫应答之间存在着极为复杂的关系，其中TIGIT/CD155是近来受到广泛关注的重要的免疫检查点通路。
CD155是Nectin样分子家族中的第五个成员，并且起着脊髓灰质炎病毒受体的作用，因此，CD155也被称为necl-5或PVR(脊髓灰质炎病毒受体)。作为免疫球蛋白样的粘附分子，CD155参与细胞粘附与迁移，同时调节自然杀伤细胞和T细胞介导的免疫。CD155在各种正常人体组织中几乎不表达或弱表达，但通常在人类恶性肿瘤细胞中过度表达。CD155过表达促进肿瘤细胞侵袭和迁移，并与肿瘤进展和预后不良有关，具体临床表现包括淋巴结转移、肿瘤浸润淋巴细胞减少、组织病理学分级较差等。在肿瘤进展期，NK细胞表面的TIGIT/CD96表达明显升高，同时与NK细胞表面的刺激性激活因子(DNAM-1)竞争结合CD155，由于TIGIT/CD96与CD155具有更高的亲和力，两者结合促进NK细胞功能衰竭，进而介导肿瘤免疫逃逸。目前针对CD155抗体单药已经在黑色素瘤、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌等多个癌种中开展了临床试验(https://clinicaltrials.gov)。
有研究者已经证实肝癌组织中CD155的表达高于癌旁组织，且与肝癌分期、无病生存期(DFS)和总生存期时间(OS)有很强的相关性，在阻断CD155表达后能够逆转NK细胞耗竭，使其恢复抗肿瘤活性(Sun H,et al.Hepatology,2019；70:168-183)；另有研究表明随着肝癌分化程度的降低，肝癌患者癌组织中CD155表达也随之升高，这都提示CD155可能在肝癌发生发展中发挥重要作用(Duan X,et al.Molecular medicine reports,2019；20:3773-3781)。尽管在肝癌肿瘤微环境内细胞表达的CD155具有关键作用，但对CD155调节的研究仍然有限。
CRISPR系统是存在于细菌纲和古细菌纲中的一种天然免疫系统，其全称为“成簇规律间隔短回文重复序列”(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)，可以通过识别和剪切入侵病毒基因组中的特定核酸序列，进而清除病毒、保护细菌细胞。基于CRISPR系统的作用方式，可将其改造成强大而灵活的基因编辑工具。在CRISPR-Cas9系统中，tracrRNA/crRNA复合物引导核酸酶Cas9蛋白剪切与crRNA配对的靶序列双链DNA，实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single guide RNA)，引导Cas9对DNA的定点切割(Ponting CP.Cell,2009；136:629-641)。
spCas9具有RuvC和HNH核酸内切酶结构域，负责切割DNA引起双链断裂。突变HNH和RuvC结构域的核酸酶缺陷型Cas9(dCas9)不能切割DNA，但是保留了sgRNA引导下识别和结合靶DNA的能力。如果dCas9蛋白融合VP64等转录激活蛋白，可在sgRNA引导下结合特定基因启动子区，激活基因转录。如果dCas9蛋白融合KRAB等转录抑制蛋白，则可在sgRNA引导下结合特定基因启动子区，抑制基因转录。基于这一技术构建的高通量CRISPR文库，可在全基因水平进行编码基因或者非编码基因的功能性遗传筛选，是迄今为止最为强大的正向遗传性筛选工具。
发明内容
本发明的目的是提供TOX3基因过表达作为肝癌预后标志物中的应用。
本发明构思如下：基于CD155是重要的肿瘤免疫调控基因，本发明首次应用人全基因组编码基因CRISPR转录激活文库(Kira S Makarova,et al,Nat Rev Microbiol,2011,9(6):467-77)筛选能够抑制CD155表达的关键基因，经高通量测序数据后，通过生物信息学分析发现能够特异性激活转录因子TOX3表达的sgRNA被显著富集，提示TOX3过表达可以显著抑制细胞内CD155的表达水平。由此推测TOX3下调CD155表达，进而减弱对NK细胞的抑制，最终增强抗肝癌的免疫效应、改善患者的预后。
已知TOX家族包含TOX、TOX2、TOX3和TOX4四个成员，TOX主要在胸腺中表达，研究表明TOX在多种免疫细胞如CD4+T淋巴细胞、NK细胞等的发育以及淋巴结的形成过程中发挥重要作用(Liao J,et al.The International journal of biological markers,2018；1724600818755633)；TOX2在下丘脑-垂体-性腺生殖轴发挥重要作用；TOX3在中枢神经系统、回肠、大脑额叶及顶叶高表达，对神经细胞的生存发挥重要作用，同时也是乳腺癌易感基因位点。
以往文献报道TOX家族与T细胞免疫应答密切相关，研究发现TOX是耗竭CD8+T细胞的中心调控因子(Khan O,et al.Nature,2019；571:211-218)。在肝细胞癌中耗竭CD8+T细胞中TOX表达上调，下调CD8+T细胞中TOX的表达可以增加CD8+T细胞的浸润，减少CD8+T细胞衰竭，改善CD8+T细胞对PD-1抗体治疗的敏感性。其发生机制在于TOX与细胞质中的PD-1结合，进而促进PD-1的内吞循环，使其在细胞表面维持丰富的PD-1表达，研究还发现TOX在外周CD8+T细胞中高表达与抗PD-1抗体反应差及预后不良有关(Seo H,et al.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,2019；116:12410-12415)。另有研究表明Tox2通过调节染色质可及性来驱动滤泡辅助性T细胞(Tfh)的发育(Xu W,et al.Immunity,2019；51:826-839e825)。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供TOX3基因过表达作为肝癌预后标志物中的应用。TCGA肝癌数据库标准化后cutoff值的count数为467。TOX3基因表达高于467，则肝癌患者的预后较好。
本发明采用的技术方案如下：
1、利用流式细胞术筛选出CD155高表达的HCT116细胞系，使用人全基因编码基因CRISPR转录激活文库感染HCT116细胞系；
2、高通量测序及生物信息学分析方法筛选能够下调肿瘤细胞中CD155表达的编码基因TOX3；
3、肝癌临床样本验证TOX3与CD155的关系。本发明中，TOX3基因在NCBI上的参考序列编号为Gene ID:27324。
第二方面，本发明提供TOX3基因作为标志物在制备肝癌预后评价试剂中的应用。
第三方面，本发明提供TOX3基因在下调肿瘤细胞中CD155表达中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用人全基因组编码基因CRISPR转录激活文库筛选能够抑制CD155表达的关键基因，应用生物信息学分析高通量测序数据后，发现能够特异性激活转录因子TOX3表达的sgRNA被显著富集，提示TOX3过表达可以显著抑制细胞内CD155的表达水平。随后，本发明用肝细胞癌病理组织切片进行TOX3免疫组化染色发现，TOX3同时在实质细胞及非实质细胞上表达。为了进一步探索TOX3表达与CD8+T细胞、CD155的关系，我们采用多标免疫组化实验方案，多标记染色技术及基于酪胺信号放大技术衍生而来的组织切片多标染色方法，将TOX3、CD3、CD8、CD155同时放入同一个体系，在肝癌病理组织切片上进行检测。我们发现肝癌组织中TOX3的表达水平与CD155的表达水平呈一定的负相关。进一步对44例病人的肝癌组织芯片(配对的癌和癌旁组织病理切片)进行多标染色发现，基于细胞阳性率的分析，实质细胞区域中，TOX3+CD155-细胞的比例在癌组织(14.92％)的表达显著高于癌旁组织(10.29％)，提示在肿瘤组织中TOX3可能具有抑制CD155的作用。
本发明进一步利用TCGA肝癌RNA-seq数据进行免疫浸润分析，发现TOX3的表达水平与肝癌组织中NK细胞的浸润频率显著正相关，结合CD155对NK细胞的抑制作用，进一步提示TOX3可能通过抑制CD155激活NK细胞，从而有利于肝癌患者的预后。因此TOX3在肝癌中作为预后指标具有一定的潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明的技术路线图。
图2为本发明较佳实施例中CRISPR文库筛选流程图。
图3为本发明较佳实施例中CD155过表达文库筛选的过程。
图4为本发明较佳实施例中CRISPR文库筛选的基因气泡图(左)以及筛选基因KEGG富集图(右)。
图5为本发明较佳实施例中免疫组化分析结果；其中，A：TOX3、PD-L1及CD155在肝癌病理组织切片的表达情况，B-C：肝癌样本中，TOX3在非实质细胞和实质细胞的表达。
图6为本发明较佳实施例中多标免疫组化结果；其中，A和B：肝癌组织中TOX3表达强，而CD155表达弱；C和D：肝癌组织中TOX3表达弱，CD155表达强。
图7为本发明较佳实施例中TOX3+CD155-细胞在肝癌组织实质细胞(A)和非实质细胞(B)区域的表达情况。
图8为本发明较佳实施例中肝癌样本中TOX3与NK细胞的相关性。
图9为本发明较佳实施例中TOX3在Grade 2级及具有小血管浸润灶组肝癌病人中的生存分析情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1应用全基因组CRISPR激活文库筛选发现TOX3可以抑制检查点抑制剂CD155的表达
尽管有关免疫检查点的抗体药物已经逐步在临床上开始应用，但对于这些免疫检查点的调控机制仍然研究较少。本发明基于CRISPR文库建立一套筛选调控免疫检查点的关键基因技术，通过这项技术我们筛选到了CD155的关键调节基因TOX3，这将为CD155单抗药物在临床的应用提供理论基础，确定TOX3在肝癌中作为预后指标的潜在价值，这也为非直接单抗阻断TIGIT/CD155轴的方式开发抗肿瘤药物带来了更多选择。
具体方法如下：
(一)利用流式细胞术筛选出CD155高表达的HCT116细胞系，使用人全基因编码基因CRISPR转录激活文库感染HCT116细胞系；
(二)高通量测序及生物信息学分析方法筛选能够下调肿瘤细胞中CD155表达的编码基因TOX3；
(三)肝癌临床样本验证TOX3与CD155的关系。
本发明的技术路线见图1，CRISPR文库筛选流程见图2。
将第5天富集的细胞进行高通量测序，结果见图3。
1、高表达CD155的人消化系统肿瘤细胞系的确定
为了确定高表达CD155的人消化系统肿瘤细胞系，以期进行后续的文库细胞的构建以及筛选等实验，我们通过流式细胞术分析的方法，从HCT116、MHCC-97H、、HepG2、Huh7、SK-HEP-1这5种人肿瘤细胞系中进行筛选。根据流式细胞术分析的结果显示，以细胞未染CD155抗体为对照组，染CD155抗体为实验组，通过流式细胞术分析每种人肿瘤细胞系CD155的阳性率，发现这5种细胞系基本100％表达CD155。我们选择HCT116细胞系进行后续实验。
2、HCT116细胞各类抗生素筛选条件的确定
根据梯度设定的6个不同浓度的Blasticidin、Hygromycin，对HCT116细胞进行不同天数的处理，每天记录细胞的存活率，最终确定了这3种抗生素筛选HCT116细胞的最适浓度及作用时间。结果显示，15μg/mL Blasticidin(BSD)处理4d和300μg/mL Hygromycin处理3d，可使HCT116细胞的死亡率达到100％。
3、利用人全基因组编码基因的转录激活文库的CRISPR文库筛选抑制CD155表达的编码基因
1)从Addgene公司购买靶向人全基因组编码基因的转录激活文库(#1000000106)，首先进行CRISPR质粒文库的电转扩增和质粒提取：然后使用文库主质粒、psPAX2和pVSVG辅助质粒共同转染293T细胞进行慢病毒包装，使用20ml注射器将10％蔗糖溶液，缓慢地注入离心瓶底部，体积比为4:1(病毒上清4份，蔗糖溶液1份)，4度，14000rpm离心2小时对病毒液进行纯化浓缩，使用化学发光法(CMIA)测定慢病毒滴度。
2)构建HCT116-MPH稳定细胞系。利用纯化的MPH病毒原液感染HCT116细胞系，感染细胞48小时后，加入终浓度为300ug/ml Hygromycin进行抗生素筛选，连续抗性筛选6天左右(空白对照全部杀亡)。对于存活的HCT116-MPH稳定表达细胞系进行扩增培养。
3)CRISPR文库慢病毒转导MOI测定及细胞文库建立。测定MOI为0.4所需的病毒量，首先接种4×105HCT116-MPH，培养至细胞30％融合)，分别加入不同量的SAM慢病毒(A：0.1×105,B：0.2×105,C：0.5×105,D：1×105和E：2×105TU)，保留1个未感染孔作为对照，感染过夜后，消化感染孔和未感染对照孔细胞，将细胞均分为两份并分别接种至两个孔中，添加15μg/mL Blasticidin进行抗性筛选，一旦未感染对照孔的细胞被全部杀死，则分别计数每个孔的细胞数，并计算MOI值；用相应MOI的病毒量进行大规模细胞转导，用Blasticidin筛选7-14天，建立HCT116-SAM细胞文库。
4、流式细胞术分选富集HCT116-SAM文库细胞中低表达CD155的细胞。经过4次分选，富集CD155阴性表达的HCT116-SAM文库细胞，以减少背景细胞，提高真正下调CD155表达的目的细胞比例。
5、富集下调CD155表达的HCT116-SAM文库细胞的sgRNA PCR扩增、建库和高通量测序。
(1)利用细胞基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,Cat:DP304)提取HCT116-SAM文库细胞基因组DNA。
(2)PCR扩增sgRNA序列。
使用试剂为PlatinumTM SuperFiTM Green PCR Master Mix(Invitrogen，Cat.:12359050)。
SAM-sgRNA需经过两轮PCR扩增以获得足够的特定序列产量。
SAM-sgRNA引物：
Primer-F1：5’-GACTATCATATGCTTACCGTAAC-3’；
Primer-R1：5’-TTTTAACTTGCTAGGCCCTG-3’；
Primer-F2：5’-GTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATA
TCTTGTGGAAAGGACGAAACACC-3’；
Primer-R2：5’-ATTTTAACTTGCTAGGCCCTGCAGACATGGGTGATC
CTCATGTTGGCCTAGCTCTAAAAC-3’；
GAPDH引物：
Primer-F：5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’；
Primer-R：5’-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’
a.按照表1配制第1轮PCR反应体系：
表1 SAM-sgRNA第1轮PCR反应体系
b.设置第1轮PCR反应条件(表2)：
表2 SAM-sgRNA第1轮PCR反应条件
c.按照表3配制第2轮PCR反应体系：
表3 SAM-sgRNA第2轮PCR反应体系
d.设置第2轮PCR反应条件(表4)：
表4 SAM-sgRNA第2轮PCR反应条件
e.将两轮PCR产物进行电泳：1.5％琼脂糖凝胶，每孔上5μL PCR产物，每块胶加5μL100bp Marker，150V，30min；
f.凝胶成像系统中显影并保存结果。
(3)SAM-sgRNA一代测序
一代测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。
分别取10uL PCR产物及相应的引物送一代测序(Sanger测序)，初步验证HCT116-SAM文库细胞的构建及筛选过程中是否成功转导了sgRNA，并通过一代测序结果中出现的套峰情况初步判断sgRNA的多样性。
(4)SAM-sgRNA高通量测序分析
高通量测序分析委托苏州金唯智生物科技有限公司进行，主要包括：
①样品的核酸质量检测和样品纯化；
②合格样品进行文库构建及质控；按照实验说明书对基因组DNA进行片段化，末端修复、3’末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建；所建文库使用2.0Fluorometer检测浓度，Agilent2100检测文库的大小，根据质检结果，确认样品可以上机测序；
③使用HiSeq 2×150bp平台进行测序，测序长度为2×150bp，每个测序文库提供1.0Gb的数据量；
④对高通量测序所得的数据进行初步处理分析，提供Raw data。测序得到RawReads进行过滤处理后，得到可用于数据分析的clean Reads。去除平均质量Q<20的reads(碱基错误率大于0.01)、去除reads中所含有的接头序列、去除reads中含有的模糊的N碱基，是由于测序强度不够,机器无法识别的碱基、去除长度小于50的测序片段(reads)。
(5)生物信息学分析确定候选的关键基因
①以p<0.05和log2 Fold Change>1为标准，确定下调CD155表达的HCT116-SAM文库细胞和DMSO处理的对照组文库细胞之间显著差异的sgRNA；
②根据富集的sgRNA数进行排序，排在末位为1，倒数第二位为2，依次类推，然后将序号数最大的sgRNA的得分Sscore.x记为1分，序号数为1的sgRNA的得分Sscore.x的得分记为0分，再结合每个基因所富集到的sgRNA的Sscore.x进行累计积分，得出每个富集的基因的Sscore.y的得分；
③用DESeq2软件根据富集的sgRNA种类数及Sscore.y得分对HCT116-SAM文库中所富集的候选基因进行统计图的绘制。
④利用DAVID数据集对富集的显著候选关键基因进行GO分析，并采用Fisher精确检验法和Benjamin-Hochberg多重假设检验进行校正；
⑤利用Kolmogorov-Smirnov检验进行候选关键基因的基因集富集分析，在整个已排序基因列表中确定KEGG信号通路的富集情况。
图4为CRISPR文库筛选的基因气泡图(左)以及筛选基因KEGG富集图(右)。从图中可以看出，用R包DESeq2分析原始数据得到差异基因，使用ggplot2绘制气泡图，KEGG分析发现筛选基因主要富集在代谢相关通路上(图4)。其中TOX3经排序位于筛选基因的第一位。
根据染色强度和染色面积共同作为测量指标，染色强度分为根据阳性标记的显色程度分为：蓝色，阴性(0分)；淡黄色，弱阳性(1分)；棕黄色，中等阳性(2分)；深棕色，强阳性(3分)；根据染色面积分为：<30％1分；30％-50％2分；50％-80％3分；>80％4分。将染色强度的得分乘以染色面积的得分，最终得到该片的染色得分。免疫组化分析结果见图5，从图中可以看出，肝癌免疫组化标本验证CD155和TOX3的表达情况，在肝细胞癌病理组织切片上进行CD155和TOX3免疫组化染色发现，TOX3在实质细胞和非实质细胞上表达。
临床样本(桂林医学院附属医院肝胆外科的肝癌手术切除标本，已签署知情同意书，分期为TNM I-TNM III期患者)多标免疫组化结果分析见图6(图6中，PVR即CD155)，从图中可以看出，肝癌组织中TOX3的表达水平与CD155表达水平负相关。
多标免疫组化实验方法如下：
1、脱蜡水合
a)新鲜二甲苯浸片10min，重复3次。
b)梯度乙醇浸片：100％5min；95％5min；70％2min。
c)灭菌水洗片1min，重复3次。
d)10％中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次。
2、微波修复抗原
a)将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1×工作液浸没。
b)将修复杯置于微波炉内高火煮沸。
c)低火维持15min(注意补液，防止蒸发过度导致干片)。
d)取出室温自然冷却至室温。
3、封闭
a)去除玻片上残存洗液。
b)用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，覆盖样本区域。
c)室温保湿震荡10min。
4、一抗孵育
a)去除玻片上的封闭液。
b)用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。
c)室温保湿震荡孵育1hr(需针对不同抗体做优化调整)。
d)用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。
5、二抗孵育
a)去除玻片上残存的洗液。
b)直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域。
c)室温保湿孵育10min。
d)用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。
6、荧光染色放大信号
a)去除玻片上残存的洗液。
b)用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul(使用信号放大液按1:100稀释)，浸没样本区域。
c)室温保湿震荡孵育10min。
d)1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min。重复3次。
e)微波修复，室温自然冷却至室温。
f)灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。
g)单染结束，封片观察或追加后续染色。
h)去除玻片上残存洗液，滴加DAPI工作液，室温保湿孵育。
i)1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min。
j)用灭菌水洗片2min。
k)待玻片微干，用移液器在玻片上滴加超强抗淬灭封片剂，浸没样本区域。
l)加盖玻片，指甲油封片。
m)阅片，染色后的组织片在荧光显微镜下观察。
TOX3+CD155-细胞在肝癌组织实质和非实质细胞区域的表达情况见图7，从图中可以看出，对44例病人的肝癌组织切片芯点进行多标染色实验，将每个芯点划分为实质细胞区和非实质细胞区，实质细胞区域中，TOX3+CD155-细胞的比例在癌组织(14.92％)的表达显著高于癌旁组织(10.29％)，提示在肿瘤组织中TOX3可能具有抑制CD155的作用。
肝癌样本中TOX3与NK细胞的相关性见图8，从图中可以看出，利用TCGA数据库中的RNAseq数据，利用QuantiSeq算法推算免疫细胞的浸润频率(从TCIA数据库下载)，并进一步分析肝癌中TOX3的表达水平及其与各种免疫细胞浸润频率的关系，我们发现TOX3的表达水平与肝癌组织中NK细胞的浸润频率显著正相关。
进一步地，从TCGA数据库官网上下载肝癌队列FPKM标准化数据RNA-seq数据集，然后分亚组分析TOX3在Grade 2级及具有小血管浸润灶组肝癌病人中对生存预后有显著影响。TOX3在Grade 2级及具有小血管浸润灶组肝癌病人中的生存分析情况见图9，从图中可以看出，TOX在Grade 2级及具有小血管浸润灶组肝癌病人中对生存预后有显著影响。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：基因标志物的诊断用途