具体实施方式

最近的数据表明重复RNA表达可以在包括黑素瘤和结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌和肺癌在内的多种恶性肿瘤中驱动先天免疫应答(Rooney等人,Cell 160,48-61(2015)；Chiappinelli等人,Cell 162,974-986(2015)；Roulois等人,Cell 162,961-973(2015)；Leonova等人,Proc Natl Acad Sci U S A 110,E89-98(2013)；Tanne等人,Proc NatlAcad Sci U S A 112,15154-15159(2015))。

本文描述的是临床级RNA-ISH分析以及通过RNA-seq对癌症中重复RNA进行定量的方法(参见附录1；Desai等人,JCI Insight 2,e91078(2017)；和Ting等人,Science 331,593-596(2011))。此外，癌症基因组数据集(TCGA)中的计算RNA-seq分析表明，许多重复RNA目前未被标准的mRNA-seq数据集捕获。还观察到总RNA-seq数据中重复RNA的相关性(见附录2，和Solovyov等人,bioRxiv,BIORXIV/2017/145946(2017))。

本文描述的是通过免疫组织化学用于评估免疫浸润(包括T细胞亚群(CD3、CD4、CD8、FOXP3)的白细胞；巨噬细胞亚群(CD68、CD163)；B细胞(CD20)；NK亚群(CD56、CD16))，同时通过RNA原位杂交(RNA-ISH)用于评估重复RNA(HSATII、LINE1、HERV-H、和HERV-K)的测定。我们已经在112个结肠癌组中证明HERV-H表达和FOXP3+调节性T细胞的负相关性(图1和2)(参见附录1)以及HSATII表达和CD8+效应子T-细胞的负相关性(图3和4)(另请参阅附录2)。

在免疫疗法领域，已经看到CD8+T细胞浸润通常与对免疫疗法(CTLA4或PD1/PDL1)的应答有关。FOXP3+调节性T细胞被认为阻断抗肿瘤T细胞应答，尽管该数据存在更多矛盾(Manjili MH和Butler SE Immunological Investigators 2016；Ward-Hartstonge KA和Kemp RA.Clinical&Translational Immunology 2017)。

我们预测HSATII低肿瘤与高CD8 T细胞浸润相关，而HERV-H高肿瘤与低FOXP3+细胞相关，后者对免疫疗法应答最大。如本文所示，包括黑素瘤在内的HSATII低癌症对包括抗PD1/PDL1和抗CTLA4疗法在内的免疫疗法产生应答。此外，癌症中的HSATII高信号与CD163+肿瘤相关巨噬细胞正相关，其通常与免疫抑制或无应答的肿瘤微环境有关。

总而言之，这些数据表明可以例如在循环肿瘤细胞(CTC)、外泌体(例如细胞外囊泡)、细针抽吸或微芯活检中使用肿瘤细胞中的重复RNA表达，以提供对肿瘤免疫微环境的评估。这些小活检通常很小，以致于无法评估免疫细胞的浸润状态，并且无法确定肿瘤是免疫“热”还是“冷”。因此，这些重复RNA免疫标志物是肿瘤免疫微环境的替代物(surrogate)。鉴于接受免疫疗法药物的绝大多数患者都是转移性癌症患者，只有少量的活检样本，这对癌症具有重要意义。

如本文所用，术语“癌症”是指例如以恶性肿瘤生长为特征的病理性疾病状态。在一些实施方案中，本文所述的方法导致受试者中肿瘤细胞增殖的延迟或抑制。在一些实施方案中，本文所述的方法导致受试者中肿瘤细胞死亡或杀死增加。在一些实施方案中，本文描述的方法导致肿瘤细胞生长或转移速率的抑制。在一些实施方案中，本文描述的方法导致受试者中肿瘤尺寸减小。在一些实施方案中，本文描述的方法导致受试者中肿瘤负荷减少。在一些实施方案中，本文描述的方法导致受试者中转移数目的减少。

如本文所用，“预防性治疗”是指减少处于患病风险的受试者中疾病的体征或症状的发生率或预防(即，降低其风险)处于患病风险的受试者中疾病的体征或症状，以及“治疗性治疗”，其意指在诊断出患有疾病的受试者中减少疾病的体征或症状、降低疾病的进展、降低疾病的严重性。

癌症的存在，所述癌症例如上皮来源的实体瘤，例如，如ICD-O(国际疾病分类-肿瘤学)代码(修订版3)第(8010-8790)节所定义的，例如早期癌症，与由于上皮癌细胞中卫星重复序列的转录和加工的增加而导致大量卫星的存在相关(参见，例如，Ting等人(2011)Science 331(6017):593-6；Bersani等人(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112(49):15148-53；和美国公开No.2017/0198288A1，其每个的全部内容通过引用明确地并入本文)。

使用重复RNA的水平预测对疗法的应答并选择疗法

申请人已经确定癌细胞中的重复RNA例如HSATII、LINE-1、HERV-K、HERV-H RNA的水平与特定免疫细胞群的存在之间的相关性。如本文所述，具有高HSATII RNA水平的癌细胞与CD163+肿瘤相关巨噬细胞的存在正相关。不希望受理论的束缚，认为肿瘤中高HSATIIRNA水平与HSATII RNA的输出(例如，通过外泌体)相关，导致在肿瘤环境中存在高HSATIIRNA水平(例如，在外泌体中)，这吸引巨噬细胞，然后发挥保护作用，减弱抗肿瘤免疫应答。预计这些癌症将对靶向巨噬细胞的疗法或降低外泌体对HSATII RNA转移水平的疗法产生应答，从而导致细胞中HSATII和坏死性细胞死亡的增加。然后，这减少输出到巨噬细胞以影响它们的HSATII RNA的量。因此，本文所述的方法可以包括向鉴定为患有具有高HSATIIRNA水平(即，高于选定阈值的HSATII RNA水平)的癌症的受试者施用巨噬细胞靶向疗法。在一些实施方案中，该方法可包括向受试者施用降低细胞中HSATII RNA的输出水平/增加细胞中HSATII RNA的水平的治疗，例如一种以上的HSATII抑制性核酸；逆转录抑制剂；诸如DNMT抑制剂等DNA低甲基化剂；组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂；或含溴结构域和末端外基序(BET)抑制剂；或靶向巨噬细胞，例如CD11b、CSF-1R、CCL2、神经纤毛蛋白-1、ANG2、IL-4、IL-4Rα、IL-13、Fc-γR、IL-6、IL-6R、TNF-α、CD40的治疗。这些治疗中的任何一种都可以单独、一起、或同时与彼此或另一种抗癌疗法如细胞毒性化疗施用，或在其之前施用。在一些实施方案中，在确定受试者患有具有高HSATII RNA水平的癌症之后(例如，使用如本文所述的测定)，在足以改变HSATII RNA水平(例如，降低细胞中HSATII RNA的输出水平/增加细胞中HSATII RNA的水平)和/或增加巨噬细胞的水平的时间内，例如至少2天、5天、7天、10天、14天、18天、21天、28天、30天或更长时间内，施用降低从癌细胞输出的HSATII RNA的水平的治疗和/或降低巨噬细胞的分子活性的水平的治疗。任选地，再次确定HSATII RNA水平和/或巨噬细胞水平。一旦细胞中HSATII水平升高、肿瘤环境中外泌体中的HSATII水平降低或巨噬细胞水平降低(即高于或低于阈值)，这些方法就可以包括对患有HSATII低癌症(即，具有低于阈值的HSATII水平的癌症)的受试者施用如本文所述的治疗。

HSATII低肿瘤与存在高水平的CD8+T细胞浸润相关，并且具有高HERV-H水平的细胞与不存在或低水平的Foxp3+调节性T细胞相关；因此，本文所述的方法可以包括对被鉴定为患有具有低HSATII RNA水平和/或高HERV-H水平的癌症的受试者施用CD8+靶向疗法，例如增强抗肿瘤应答的免疫疗法。

在一些实施方案中，本文所述的方法用于治疗患有上皮来源的癌症(即上皮癌)的受试者。上皮来源的癌症可包括胰腺癌(例如，胰腺腺癌)、肺癌(例如，非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、黑素瘤或结肠癌。还已经显示卫星在肿瘤前或早期癌症病变，包括导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)、胰腺上皮内瘤变(PanIN)、原位导管癌(DCIS)、巴雷特食管(Barrett’s Esophagus)中上升(参见例如，Sharma(2009)N.Engl.J.Med.361(26):2548-56；勘误:N Engl J Med.362(15):1450)。因此，该方法作为预防浸润性癌症发展的手段可用于潜在地治疗早期肿瘤前癌症。在一些实施方案中，癌症是微卫星不稳定癌症(例如，MSI结直肠癌)。在一些实施方案中，癌症是微卫星稳定癌症(例如，MSS结直肠癌)。参见，例如，Vilar和Gruber,Nat Rev Clin Oncol.2010年3月；7(3):153-62。

如本文所用，“高重复RNA水平”是指高于参考水平或阈值例如代表统计学确定的阈值的参考的水平，例如高于该参考可以使用本文所述的方法来诊断或治疗癌症；相反，“低重复RNA水平”是指低于参考水平或阈值的水平；这可以与用于鉴定具有高重复RNA水平的癌症的参考水平或阈值相同或不同。

在一些实施方案中，参考水平是同一样品中正常细胞，例如与癌细胞相邻的正常细胞，例如正常相邻基质信号中的水平。在一些实施方案中，高水平定义为大于正常相邻基质细胞信号的肿瘤细胞信号，而低水平定义为小于或等于在相邻基质细胞中所见的肿瘤细胞信号。

合适的参考水平可以通过本领域已知的方法确定。在一些实施方案中，该方法包括在来自受试者的样品，例如包含来自受试者的肿瘤细胞或肿瘤组织的活检样品中，检测高重复RNA水平，例如高于阈值的重复RNA水平的存在。重复RNA水平可以通过本领域已知的任何方法，包括Northern印迹、RNA原位杂交(RNA ISH)、RNA表达测定，例如微阵列分析、RT-PCR、深度测序、克隆、Northern印迹和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来确定(参见国际公开号WO 2012/048113，通过引用其整体并入本文)。在一些实施方案中，代替检测高重复RNA的水平，该方法包括检测重复DNA的拷贝数。与正常细胞相比，拷贝数的增加，和/或重复RNA水平的增加，表明该癌症对本文所述的治疗敏感。因此，该方法可以包括检测和/或鉴定具有高重复RNA水平和/或增加的重复拷贝数的癌症，和/或选择患有具有高重复RNA水平和/或增加的重复拷贝数的癌症的受试者以供本文所述方法的治疗。

在一些实施方案中，该方法包括确定癌症的TP53状态，以及选择在TP53等位基因中具有突变的癌症(或不选择具有野生型TP53的癌症)。TP53的参考基因组序列可在NG_017013.2(范围5001–24149，RefSeqGene)；NC_000017.11(范围7668402-7687550，参考GRCh38.p2原始组装(Primary Assembly))上找到。该方法可以包括例如，通过将样品中TP53的序列与参考序列，例如，代表正常(野生型)或非癌细胞中的参考、或代表来自癌症的细胞如恶性细胞中的序列的疾病参考进行比较，获得包含来自受试者的细胞的样品，并评估样品中本领域已知或本文所述的TP53中突变的存在。与使用本文所述方法治疗的敏感性相关的TP53中的突变是在一个以上位置与参考序列(例如，如本文所提供)不同的序列。在一些实施方案中，所述突变是本领域已知与癌症相关的突变。国际癌症研究机构维护在人类癌症中发现的TP53突变的数据库，可在线访问p53.iarc.fr(R18版，2016年4月)；另请参见Petitjean等人(2007)Hum.Mutat.28(6):622-9和Bouaoun等人(2016)Hum.Mutat.37(9):865-76。在一些实施方案中，该突变是在密码子175、245、248、249、273或282处的突变。参见，例如，Olivier等人(2010)Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2(1):a001008。

TP53中突变的存在和/或重复RNA水平和/或重复拷贝数可以使用本领域已知的方法进行评估，例如，使用聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、定量或半定量实时RT-PCR、数字PCR，即BEAMing(珠，乳液，扩增，磁力)，Diehl(2006)Nat Methods 3:551-559)；RNA酶保护分析；Northern印迹；各种类型的核酸测序(Sanger，焦磷酸测序，下一代测序)；荧光原位杂交(FISH)；或基因阵列/芯片)；RNA原位杂交(RNA ISH)；RNA表达测定，例如微阵列分析；多重基因表达分析方法，例如RT-PCR、RNA测序和包括RNA表达微阵列在内的寡核苷酸杂交测定；基于杂交的数字条码定量测定，例如系统(NanoStringTechnologies,Inc.,Seattle,WA；Kulkarni(2011)Curr.Protoc.Mol.Biol.Chapter 25:Unit25B.10)，以及利用分支DNA信号放大的基于裂解物的杂交测定，例如QuantiGene 2.0单重和多重测定(Affymetrix,Inc.,Santa Clara,CA；参见,例如,Linton等人(2012)J.Mol.Diagn.14(3):223-32)；SAGE、高通量测序、多重PCR、MLPA、Luminex/XMAP、或分支DNA分析方法。参见，例如，国际公开号WO 2012/048113，通过引用其整体并入本文。

在一些实施方案中，使用RNA ISH。某些RNA ISH平台利用在通过相互杂交的多个多核苷酸的分支链技术(例如，bDNA)形成分支结构(例如分支核酸信号放大)的测定中放大信号的能力。除了其高灵敏度外，与免疫组织化学相比，该平台还具有最小的非特异性背景信号(参见，例如Urbanek等人(2015)Int.J.Mol.Sci.16(6):13259-86)。

在一些实施方案中，该测定是美国专利号7,709,198、7,803,541和8,114,681；和美国公开号2006/0263769中所述的bDNA测定，这些文献描述了一般的bDNA方法；特别参见'198专利的14:39至15:19。在一些实施方案中，该方法包括使用利用分支链DNA测定的改良的RNA原位杂交(ISH)技术，以直接检测和评估样品中生物标志物mRNA的水平(参见，例如，美国专利号7,803,541B2；Canales等人(2006)Nat.Biotechnol.24(9):1115-22；Ting等人(2011)Science 331(6017):593-6)。进行该测定的试剂盒可从Affymetrix,Inc.商购获得(例如，用于组织和细胞样品的 ViewRNA测定)。

RNA ISH可以例如使用 ViewRNA技术(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行。 ViewRNA ISH基于分支DNA技术，其中信号放大是通过一系列连续步骤(例如，以单重形式或双重形式)实现的。因此，在一些实施方案中，该方法包括进行如美国公开号2012/0052498中所述的测定(其描述用于通过bDNA信号放大来检测核酸和蛋白质的方法，包括提供包含或怀疑包含靶核酸和靶蛋白的样品；将各自包含不同的L-1序列的至少两个标记扩展探针、靶蛋白的特异性抗体和至少两个标记探针系统与包含或怀疑包含靶核酸和靶蛋白的样品一起孵育，其中抗体包含预扩增子探针，并且其中至少两个标记探针系统各自包含可检测的不同标记；并检测样品中可检测的不同标记)；美国公开号2012/0004132；美国公开号2012/0003648(其描述扩大核酸检测信号的方法，该方法包括将一个以上的标记扩展探针与靶核酸杂交；将预扩增子与一个以上的标记扩展探针杂交；将一个以上的扩增子与预扩增子杂交；将一个以上的标记辐条探针(label spoke probe)与一个以上的扩增子杂交；以及将一个以上的标记探针与一个以上的标记辐条探针杂交)；或美国公开号2012/0172246(其描述检测靶核酸序列的方法，包括提供包含或怀疑包含靶核酸序列的样品；将各自包含不同的L-1序列的至少两个标记扩展探针、以及标记探针系统与包含或怀疑包含靶核酸序列的样品孵育；并检测标记探针系统是否与样品相关)。每个杂交的靶特异性多核苷酸探针依次充当预扩增子多核苷酸的杂交靶，该预扩增子多核苷酸又与一个以上的扩增子多核苷酸杂交。在一些实施方案中，在合适的预扩增子多核苷酸与2种标记扩展剂结合之前，将两种以上的靶特异性探针(标记扩展剂)与靶杂交，但是在其他实施方案中，单个标记扩展剂也可以与预扩增子一起使用。因此，在一些实施方案中，该方法包括将一种以上的标记扩展剂探针与样品一起孵育。在一些实施方案中，靶特异性探针(标记扩展剂)处于ZZ取向、十字形取向或其他(例如，混合的)取向；参见，例如美国公开号2012/0052498中的图10A和10B。每个扩增子分子提供与多个可检测的标记探针寡核苷酸，例如色原或荧光团共轭多核苷酸的结合位点，从而创建一个完全组装的信号放大“树”，该树具有多个用于标记探针的结合位点；结合位点的数目可以根据树的结构和所使用的标记方法而变化，例如从16至64个结合位点直至3000至4000的范围。在一些实施方案中，存在300至5000个探针结合位点。结合位点的数量可以优化为足够大以提供强信号，但要足够小以避免与超大结构相关的问题，即足够小以便避免空间效应且以便相当容易地进入固定/透性化细胞，如果不存在靶则将其洗去，这是因为较大的树将需要较大的组件，尽管随后进行了洗涤步骤这些组件也可能会卡在细胞的孔中(例如，透性化过程中产生的孔，细胞核的孔)，并导致产生噪音。

在一些实施方案中，标记探针多核苷酸与能够与合适的色原相互作用的酶例如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)缀合。在使用碱性磷酸酶(AP)缀合的多核苷酸探针的情况下，依次添加适当的诸如固红色或固蓝色底物等底物后，AP分解底物以形成沉淀物，允许原位检测特异性靶RNA分子。碱性磷酸酶可以与许多底物，例如，固红、固蓝、或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)一起使用。因此，在一些实施方案中，该方法包括在bDNA信号放大方法中，例如，如美国专利号5,780,277和7,033,758中一般性描述使用碱性磷酸酶缀合的多核苷酸探针。也可以使用其它酶和色原底物对，例如辣根过氧化物酶(HRP)和3,3'-二氨基联苯胺(DAB)。许多合适的酶和色原底物是本领域已知的，可用于为测定中产生的可检测信号提供多种颜色，并且所用酶和底物的适当选择可以促进单个样品中靶和标记的多重化。对于这些实施方案，可以使用已知的成像方法，例如，使用CISH方法的明场显微镜来检测标记的探针。

其他实施方案包括使用荧光团-缀合物探针，例如Alexa Fluor染料(LifeTechnologies Corporation,Carlsbad,California)与标记探针缀合。在这些实施方案中，可以使用已知的成像方法，例如荧光显微镜(例如，FISH)来检测标记的探针。合适的荧光团的选择还可以基于例如所选荧光团的发射光谱来促进靶和标记的多重化。

在一些实施方案中，测定类似于在美国公开号2012/0100540、2013/0023433、2013/0171621、2012/0071343；或2012/0214152中描述的那些(上述各项的全部内容通过引用其整体并入本文)。

在一些实施方案中，在不使用bDNA的情况下进行RNA ISH测定，并且重复RNA(例如，HSATII、LINE-1、HERV-K或HERV-H)或TP53特异性探针由本文所述的一种以上的标记直接或间接(例如，经由抗体)标记。

可以手动进行或在自动化仪器、例如Leica BOND系列仪器或Ventana DISCOVERYULTRA或DISCOVERY XT仪器上进行测定。

如本文所用，“试验样品”是指获自感兴趣受试者的生物学样品，包括来自肿瘤的一种或多种细胞，例如组织。(Lehninger Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,现行版)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York；Bernard(2002)Clin.Chem.48(8):1178-85；Miranda(2010)Kidney International 78:191-9；Bianchi(2011)EMBO Mol Med 3:495-503；Taylor(2013)Front.Genet.4:142；Yang(2014)PLoS One 9(11):e110641)；Nordstrom(2000)Biotechnol.Appl.Biochem.31(2):107-12；Ahmadian(2000)Anal.Biochem.280:103-10。在一些实施方案中，高通量方法，例如本领域已知的蛋白质或基因芯片(参见，例如Ch.12,Genomics,Griffiths等人编辑，Modern Genetic Analysis,1999,W.H.Freeman andCompany；Ekins和Chu(1999)Trends in Biotechnology 17:217-8；MacBeath和Schreiber(2000)Science 289(5485):1760-3；Simpson,Proteins and Proteomics:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002；Hardiman,Microarrays Methodsand Applications:Nuts&Bolts,DNA Press,2003)，可用于检测TP53中突变的存在和/或水平。

在一些实施方案中，适合于检测核酸的结构或序列中的改变，例如缺失、扩增或取代的存在的技术可以用于检测重复RNA(例如，HSATII、LINE-1、HERV-K或HERV-H)或TP53中的改变。

在一些实施方案中，RT-PCR可用于检测突变和拷贝数变体(CNV)。通过RT-PCR进行表达谱分析的第一步是将RNA模板逆转录为cDNA，然后在PCR反应中使其进行指数扩增(Ausubel等人(1997)Current Protocols of Molecular Biology,John Wiley andSons)。为了最小化误差和样品间差异的影响，通常使用内标进行RT-PCR，该内标在组织中以恒定水平表达，并且不受实验处理的影响。最常使用的是本领域已知的看家基因。

在一些实施方案中，该方法可以包括检测TP53的蛋白水平，并将该蛋白水平与正常细胞中的参考蛋白水平进行比较。TP53中的突变通常会导致蛋白表达水平降低，因此与野生型参考水平或阈值水平相比，蛋白表达水平降低可以用作突变状态的代表；可以选择其中tp53水平降低的癌症进行本文所述方法的治疗(或可以将TP53水平与野生型参考或阈值相比正常或基本不降低的癌症排除在本文所述方法的治疗)。可以使用本领域已知的方法来评估蛋白质的水平，例如，使用蛋白质的标准电泳和定量免疫测定法，包括但不限于蛋白免疫印迹；酶联免疫吸附测定(ELISA)；生物素/亲和素类型测定；蛋白阵列检测；放射免疫测定；免疫组织化学(IHC)；免疫沉淀测定；FACS(荧光激活细胞分选)；质谱(Kim(2010)Am.J.Clin.Pathol.134:157-62；Yasun(2012)Anal.Chem.84(14):6008-15；Brody(2010)Expert Rev.Mol.Diagn.10(8):1013-22；Philips(2014)PLOS One 9(3):e90226；Pfaffe(2011)Clin.Chem.57(5):675-687)。所述方法通常包括直接或间接提供信号的可检测标记，例如荧光、化学发光、放射性和酶或染料分子。如本文所用，术语“标记”是指可检测物质，例如放射性试剂或荧光团(例如藻红蛋白(PE)或靛菁绿(Cy5))与抗体或探针的偶联(即物理连接)，以及通过与可检测物质的反应性间接标记探针或抗体(例如辣根过氧化物酶，HRP)。

在一些实施方案中，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，其中微量滴定板的孔涂有针对待测蛋白的抗体。然后将含有或怀疑含有生物标志物的样品施加到孔中。在足够的时间后，在此期间将形成抗体-抗原复合物，将板洗涤以除去任何未结合的部分，添加可检测地标记的分子。再次，在足够的孵育时间之后，洗涤板以去除任何过量的未结合的分子，并且使用本领域已知的方法确定标记的分子的存在。也可以使用诸如竞争性ELISA或竞争性测定以及夹心ELISA等ELISA方法的改变版本，因为它们是本领域技术人员众所周知的。

在一些实施方案中，可以使用免疫组织化学(IHC)方法。IHC提供一种原位检测生物标志物的方法。可以检测生物标志物的存在和确切的细胞位置。通常，将样品(例如，活检样品)用福尔马林或多聚甲醛固定，包埋在石蜡中，并切成切片用于染色和随后通过光学显微镜检查。当前的IHC方法通常使用直接或间接标记。当进行免疫荧光(IF)时，也可以通过荧光显微镜检查样品，以作为IHC的改变版本。

质谱法，特别是基质辅助的激光解吸/电离质谱法(MALDI-MS)和表面增强的激光解吸/电离质谱法(SELDI-MS)，对于检测本发明的生物标志物是有用的。(参见美国专利号5,118,937、5,045,694；5,719,060；和6,225,047)。

样品可以是例如活检，例如穿刺活检或切除标本，取自已知或怀疑为肿瘤或癌的肿块。

参考水平或预定水平可以是单个截止值(阈值)，例如中位数或均值，或如下的水平：限定一组例如临床试验群体的上下四分位数、三分位数、或其它部分的边界，即在统计学上确定与其它部分不同。它可以是一系列截止值(或阈值)，例如置信区间。可以根据比较组来确定，例如与一个特定组中发展疾病风险或疾病存在的关联性较与另一个特定组中患疾病风险或疾病存在的关联性成倍数的高或低(例如，约2倍、4倍、8倍、16倍或更多)。它可以是一个范围，例如其中受试者的人群(例如，对照受试者)被均等(或不均等)地划分为组，例如低风险组、中风险组和高风险组，或分为四分位数，最低四分位数是风险最低的受试者，而最高四分位数是风险最高的受试者，或分为n个分位数(即n个规则间隔的区间)，其中n个分位数中的最低的是风险最低的受试者，而n个分位数中最高的是风险最高的受试者。

在一些实施方案中，受试者的水平大于参考水平的量足以将受试者与对照受试者区分开，并且任选地统计学上显著大于对照受试者的水平。在受试者中的拷贝数“等于”参考拷贝数的情况下，“相等”是指近似相等(例如，在统计学上没有差异)。

预定值可以取决于所选择的受试者(例如，人类受试者)的特定人群。本领域普通技术人员仅需进行常规实验即可选择适当的范围和类别。

在表征可能性或风险时，可以建立许多预定值。

合适的施用治疗途径的选择将取决于多种因素，包括但不限于特定的治疗和/或癌症的位置。在一些实施方案中，通过口服、肠胃外、静脉内、局部、腹膜内、皮下、颅内、鞘内或通过吸入施用治疗。在一些实施方案中，通过连续输注施用治疗。

逆转录酶抑制剂(RTI)

申请人惊奇地发现，当使用降低免疫抑制的治疗时，抗肿瘤应答增强免疫疗法难以治疗的HSATII高癌细胞变得更加敏感。在一些实施方案中，治疗包括施用逆转录酶抑制剂(RTI)，例如核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)、核苷酸类似物逆转录酶抑制剂、或非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。在一些实施方案中，治疗包括核苷类似物逆转录酶抑制剂、核苷酸类似物逆转录酶抑制剂、和/或非核苷逆转录酶抑制剂的组合。在一些实施方案中，治疗不包括NRTI。

许多逆转录酶抑制剂是本领域已知的，并且可以如本文所述使用，包括齐多夫定(ZDV)、去羟肌苷(ddI)、司他夫定(d4T)、扎西他滨(DDC)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韦(ABC)、替诺福韦(TDF)、恩曲他滨(FTC)、依曲韦林布洛卡韦(etravirine lobucavir)、恩替卡韦(ETV)、阿普西他滨、西萨夫定、右艾夫他滨、阿洛夫定(alovudine)、氨多索韦、依夫他滨、拉西韦、和斯坦匹丁。另外的逆转录酶抑制剂公开于例如美国公开号2017/0267667、2016/0145255、2015/0105351、2007/0088015、2013/0296382、2012/0225894、2012/0053213、2012/0029192、2009/0162319、和2007/0021442，其每一个的全部内容通过引用并入本文。不希望受任何特定理论的束缚，鉴于HSATII的GC含量高，使用鸟苷和胞苷类似物对治疗包含高HSATII RNA水平的癌症特别有利。在一些实施方案中，RTI是胞苷类似物(例如扎西他滨(ddC)；拉米夫定(3TC)；和恩曲他滨(FTC)。在一些实施方案中，RTI是鸟苷类似物(例如阿巴卡韦(ABC)和依替卡韦(ETV)。

HDAC抑制剂

在一些实施方案中，该方法包括施用HDAC抑制剂，许多是在本领域中已知的，包括辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA/伏立诺他/容立莎)、曲古抑菌素A(TSA)、和PXD-101(基于异羟肟酸的泛HDAC抑制剂)；酯肽(FK228/罗米地辛(romidepsin)/)(HDAC1/2的天然环肽抑制剂)；MS-275和MGCD0103(它们是合成的苯甲酰胺衍生物)；和丙戊酸和苯丁酸钠(它们是相对低效的脂肪族酸)。参见，例如，Kim和Bae,Am J Transl Res.2011年1月；3(2):166–179。

BET抑制剂

在一些实施方案中，方法包括施用BET抑制剂，许多是在本领域中已知的，包括(+)-JQ1、I-BET762、OTX015、I-BET151、CPI203、PFI-1、MS436、CPI-0610、RVX2135、FT-1101、BAY1238097、INCB054329、TEN-010、GSK2820151、ZEN003694、BAY-299、BMS-986158、ABBV-075、GS-5829、和PLX51107；参见，例如Pérez-Salvia和Esteller,Epigenetics.2017；12(5):323–339。

DNA低甲基化剂

在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用DNA低甲基化剂。DNA甲基化是调节基因转录沉默的表观遗传修饰。基因组甲基化模式可在肿瘤中发生改变(Smet等人(2010)Epigenetics 5(3):206-13)，并且在B细胞恶性肿瘤中是显著的(Debatin等人(2007)Cell 129(5):853-5；Martin-Subero(2006)Leukemia 20(10):1658-60)。如下所述，例如用DNA低甲基化剂(例如5-五氮杂胞苷)处理。不希望受任何特定理论的束缚，相信用DNA低甲基化剂处理可激活HSATII的转录，从而使细胞易于接受NRTI处理。

在一些实施方案中，DNA低甲基化剂是DNA甲基转移酶抑制剂。在一些实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂是5'-氮杂胞苷(Aza)、地西他滨((DAC)、克拉屈滨(2CdA)、或其组合(Wyczechowska等人(2003)Biochem Pharmacol.65:219-25；Yu等人(2006)Am.J.Hematol.81(11):864-9；和Garcia-Manero(2008)Curr.Opin.Oncol.20(6):705-10)。另外的DNA低甲基化剂描述于例如美国公开号2011/0218170A1、2005/0119201和2015/0258068中，其各自的全部内容通过引用并入本文。

HSATII抑制性核酸

在一些实施方案中，本文所述的方法包括进一步向受试者施用特异性靶向HSATII的抑制性核酸(例如，LNA分子)。例如，在美国公开号2017/0198288中公开了靶向HSATII的抑制性核酸及其使用方法，其全部内容明确地通过引用并入本文。

免疫治疗剂

在一些实施方案中，所述方法包括向使用本文所述方法鉴定的受试者施用免疫治疗剂。免疫治疗剂包括那些靶向肿瘤诱导的免疫抑制的疗法；参见例如Stewart和Smyth(2011)Cancer Metastasis Rev.30(1):125-40。

增强CD8+ T细胞抗肿瘤应答

在一些实施方案中，本方法包括选择和/或施用增强抗肿瘤免疫应答的疗法。增强CD8+细胞应答的免疫疗法的实例包括但不限于设计为诱导T淋巴细胞识别癌细胞的过继性T细胞疗法或癌症疫苗制剂，以及检查点抑制剂，例如抗CD137抗体(例如BMS-663513)、抗PD1抗体(例如纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)/MK-3475、皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011))、抗PDL1抗体(例如BMS-936559，MPDL3280A)、或抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗(ipilumimab)；参见，例如，Krüger等人(2007)Histol Histopathol.22(6):687-96；Eggermont等人(2010)Semin Oncol.37(5):455-9；Klinke(2010)Mol.Cancer.9:242；Alexandrescu等人(2010)J.Immunother.33(6):570-90；Moschella等人(2010)Ann NY Acad Sci.1194:169-78；Ganesan和Bakhshi(2010)Natl.Med.J.India 23(1):21-7；和Golovina和Vonderheide(2010)Cancer J.16(4):342-7)。

可用于本文所述方法的示例性抗PD-1抗体包括那些与人PD-1结合的抗体；NCBI登录号NP_005009.2提供示例性的PD-1蛋白序列。示例性抗体描述于美国专利号8,008,449；9,073,994；和美国公开号2011/0271358，包括例如PF-06801591、AMP-224、BGB-A317、BI754091、JS001、MEDI0680、PDR001，REGN2810、SHR-1210、TSR-042、派姆单抗、纳武单抗、阿维鲁单抗(avelumab)、皮地利珠单抗、和阿特珠单抗(atezolizumab)。

可以在本文所述的方法中使用的示例性抗CD40抗体包括那些与人CD40结合的抗体；NCBI登录号NP_001241.1、NP_690593.1、NP_001309351.1、NP_001309350.1和NP_001289682.1提供示例性CD40蛋白前体序列。示例性抗体包括国际公开号WO 2002/088186；WO 2007/124299；WO 2011/123489；WO 2012/149356；WO 2012/111762；WO 2014/070934；美国公开号2013/0011405；2007/0148163；2004/0120948；2003/0165499；和美国专利号8,591,900；包括，例如达西珠单抗(dacetuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、布莱斯鲁单抗(bleselumab)、替奈昔单抗(teneliximab)、ADC-1013、CP-870893、Chi Lob 7/4、HCD122、SGN-4、SEA-CD40、BMS-986004、和APX005M中描述的那些。在一些实施方案中，抗CD40抗体是CD40激动剂，而不是CD40拮抗剂。

可以在本文所述的方法中使用的示例性抗PD-L1抗体包括那些与人PD-L1结合的抗体；NCBI登录号NP_001254635.1、NP_001300958.1和NP_054862.1提供示例性PD-L1蛋白序列。示例性抗体描述于美国公开号2017/0058033；国际公开号WO 2016/061142A1；WO2016/007235A1；WO 2014/195852A1；和WO 2013/079174A1，包括，例如BMS-936559(MDX-1105)、FAZ053、KN035、阿替珠单抗(Tecentriq，MPDL3280A)、阿维鲁单抗(Bavencio)、和德瓦鲁单抗(Durvalumab)(Imfinzi，MEDI-4736)。

在一些实施方案中，免疫疗法可以拮抗细胞表面受体以增强抗癌免疫应答。例如，增强抗癌免疫应答的拮抗性单克隆抗体可以包括靶向CTLA-4的抗体(伊匹单抗，参见Tarhini和Iqbal(2010)Onco Targets Ther.3:15-25和美国专利号7,741,345、或曲美木单抗(tremelimumab))或靶向PD-1的抗体(纳武单抗，Topalian等人(2012)N.Engl.J.Med.366(26):2443-54和国际公开号WO 2013/173223、派姆单抗/MK-3475、和皮地利珠单抗(CT-011))。

一些免疫疗法增强T细胞募集到肿瘤部位的能力(例如内皮素受体A/B(ETRA/B)的阻断作用，例如用马西替坦(Macitentan)或ETRA和ETRB拮抗剂BQ123和BQ788的组合，参见Coffman等人(2013)Cancer Biol Ther.14(2):184-92)，或增强CD8 T细胞记忆细胞形成(例如，使用雷帕霉素和二甲双胍，参见，例如Pearce等人(2009)Nature 460(7251):103-7；Mineharu等人(2014)Mol.Cancer Ther.13(12):3024-36；和Berezhnoy等人(2014)Oncoimmunology 3:e28811)。免疫疗法还可包括施用一种以上的：过继细胞转移(ACT)，其涉及转移离体扩增的自体或同种异体的肿瘤应答性淋巴细胞，例如具有佐剂的树突细胞或肽；癌症疫苗，例如基于DNA的疫苗、细胞因子(例如IL-2)、环磷酰胺、抗白介素2R免疫毒素和/或前列腺素E2抑制剂(例如使用SC-50)。在一些实施方案中，该方法包括施用包含肿瘤脉冲的树突细胞的组合物，例如，如国际公开号WO 2009/114547及其引用的参考文献所述。另见Shiao等人(2011)Genes&Dev.25:2559-72。

减少肿瘤保护性免疫抑制

在一些实施方案中，本方法包括选择和/或施用减少肿瘤保护性免疫抑制的疗法；这些疗法可以主要靶向免疫调节性细胞类型，例如调节性T细胞(Tregs)或M2极化的巨噬细胞，例如通过减少免疫调节性细胞类型的数目、改变其功能或防止其肿瘤定位。例如，Treg靶向疗法包括抗GITR单克隆抗体(TRX518)、环磷酰胺(例如节律剂量)、三氧化二砷、紫杉醇、舒尼替尼(sunitinib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、PLX4720、基于蒽环类的化学疗法、达克珠单抗(Daclizumab)(抗CD25)；免疫毒素，例如Ontak(地尼白介素(denileukindiftitox))；淋巴细胞清除(lymphoablation)(例如化学或放射淋巴细胞清除)和选择性靶向VEGF-VEGFR信号轴的药物，例如VEGF阻断抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、或VEGFR酪氨酸激酶活性的抑制剂(例如乐伐替尼(lenvatinib))或ATP水解作用的抑制剂(例如，使用外核苷酸酶抑制剂，例如ARL67156(6-N,N-二乙基-D-β,γ-二溴亚甲基ATP三钠盐)、8-(4-氯苯硫基)cAMP(pCPT-cAMP)和相关的环状核苷酸类似物(8-[4-氯苯硫基]cGMP；pCPT-cGMP)和国际公开号WO 2007/135195中描述的那些、以及针对CD73或CD39的单克隆抗体(mAb))。多西他赛(Docetaxel)对M2巨噬细胞也有作用。参见，例如，Zitvogel等人(2013)Immunity 39:74-88。

在另一个实例中，M2巨噬细胞靶向疗法包括氯膦酸盐-脂质体(Zeisberger,等人(2006)Br.J.Cancer 95:272-81)、基于DNA的疫苗(Luo等人(2006)J.Clin.Invest.116(8):2132-41)、和M2巨噬细胞靶向促凋亡肽(Cieslewicz等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(40):15919-24)。也可以使用以下靶向巨噬细胞：CSF-1R抑制剂(例如PLX3397、AMG820 IMC-CS4/LY3022855、或RG7155/RO5509554)或其他小分子或阻断性单克隆抗体(例如抗CD11b(例如罗维珠单抗(Rovelizumab))；CCL2(例如卡鲁单抗(Carlumab))；ANG2(例如奈斯瓦单抗(Nesvacumab))；IL4(例如帕考珠单抗(Pascolizumab))；IL4-Ra(例如杜普单抗(Dupilumab))；IL13(例如，利勃珠单抗(Lebrikizumab)、曲洛单抗(Tralokinumab)、GSK679586)；FcγR(例如利妥昔单抗(Rituximab)(CD20)；依鲁替尼(Ibrutinib)(BTK)；R788(Syk))；神经纤毛蛋白-1(例如，MNRP1685A)；IL-6(例如，克拉扎珠单抗(Clazakizumab)、奥昔单抗(Olokizumab)、西妥昔单抗(Siltuximab)、西鲁库单抗(Sirukumab)、IL-6R(例如，托珠单抗(Tocilizumab)、沙利鲁单抗(Sarilumab))；TNF-α(例如，MAPK抑制剂，例如阿达木单抗(Adalimumab)、塞妥珠单抗(Certolizumab)、依那西普(Etanercept)、哥利木单抗(Golimumab)、英夫利昔单抗(Infliximab))；或CD40(例如CP-870,893)。参见，例如，Ruffell和Coussens,CancerCell.2015年4月13日；27(4):462–472及其中引用的参考文献。

一些有用的免疫疗法针对免疫的代谢过程，并且包括腺苷受体拮抗剂和小分子抑制剂，例如伊曲茶碱(istradefylline)(KW-6002)和SCH-58261；吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，例如小分子抑制剂(例如1-甲基-色氨酸(1MT)、1-甲基-d-色氨酸(D1MT)、和Toho-1)或IDO特异性siRNA，或天然产物(例如，油菜素或exiguamine)(例如，参见，Munn(2012)Front.Biosci.(Elite Ed).4:734-45)或中和IDO代谢产物的单克隆抗体，例如针对N-甲酰犬尿氨酸的mAb。

在一些实施方案中，免疫疗法可以拮抗细胞因子和趋化因子例如IL-10、TGF-β、IL-6、CCL2和与癌症中的免疫抑制相关的其他因子的作用。例如，TGF-β中和疗法包括抗TGF-β抗体(例如非苏木单抗(fresolimumab)、英夫利昔单抗、勒德利木单抗(lerdelimumab)、GC-1008)、反义寡脱氧核苷酸(例如曲贝德生(trabedersen))和TGF-β的小分子抑制剂(例如LY2157299)(Wojtowicz-Praga(2003)Invest.New Drugs 21(1):21-32)。拮抗免疫抑制细胞因子的疗法的另一个实例可以包括抗IL-6抗体(例如西妥昔单抗)(Guo,等人，Cancer Treat Rev.38(7):904-910(2012)。也可以使用针对IL-10或其受体的mAb，例如在Llorente等人,Arthritis&Rheumatism,43(8):1790–1800,2000(抗-IL-10mAb),或Newton等人,Clin Exp Immunol.2014Jul；177(1):261-8(抗白介素10R1单克隆抗体)中描述的那些人化版本。也可以使用针对CCL2或其受体的mAb。在一些实施方案中，例如，如美国专利号8,476,246所述，将细胞因子免疫疗法与常用的细胞毒性化学治疗剂(例如吉西他滨(gemcitabine)、多西他赛、顺铂(cisplatin)、他莫昔芬(tamoxifen))组合。

在一些实施方案中，免疫疗法可以包括被认为引发“危险”信号的试剂，例如刺激针对癌症的免疫应答的“PAMPs”(病原相关分子模式)或“DAMPs”(损伤相关分子模式)。参见，例如，Pradeu和Cooper(2012)Front Immunol.3:287；Escamilla-Tilch等人(2013)Immunol.Cell.Biol.91(10):601-10。在一些实施方案中，免疫疗法可以激动toll样受体(TLRs)以刺激免疫应答。例如，TLR激动剂包括疫苗佐剂(例如3M-052)和小分子(例如咪喹莫特(imiquimod)、胞壁酰二肽、CpG、和米法莫肽(mifamurtide)(胞壁酰三肽))、以及云芝多糖和内毒素。参见，Galluzi等人(2012)Oncoimmunol.1(5):699-716,Lu等人(2011)Clin.Cancer Res.17(1):67–76,和美国专利号8,795,678和8,790,655。在一些实施方案中，免疫疗法可涉及施用引起抗癌免疫应答的细胞因子，参见Lee&Margolin(2011)Cancers3:3856-93。例如，可以施用细胞因子IL-12(Portielje等人(2003)CancerImmunol.Immunother.52:133-44)或作为基因疗法(Melero等人(2001)Trends Immunol.22(3):113-5)。在另一个实例中，干扰素(IFN)，例如IFNγ，可以作为辅助疗法施用(Dunn等人(2006)Nat.Rev.Immunol.6:836-48)。

药物组合物

本文所述的方法可包括施用包含本文所述治疗剂的药物组合物和制剂。

在一些实施方案中，组合物与药学上可接受的载体一起配制。药物组合物和制剂可以肠胃外、局部、口服或通过局部施用，例如通过气雾剂或透皮施用。药物组合物可以以任何方式配制，并且可以根据病况或疾病和疾病程度、每个受试者一般医学状况、得到的优选的施用方法等以多种单位剂型施用。在科学和专利文献，例如，参见Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,2005中很好地描述了关于药物的配制和施用技术的细节。

治疗剂可以作为单一活性剂在药物组合物中施用或与其他活性剂组合施用。可以以任何方便的方式将组合物配制成用于人或兽药的施用方式。组合物中也可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如月桂硫酸酯钠和硬脂酸镁、以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂。

组合物的制剂包括适合于皮内、吸入、口服/鼻内、局部、肠胃外、直肠和/或阴道内施用的那些。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分(例如，治疗剂)的量将根据所治疗的宿主、特定的施用方式，例如皮内、肠胃外、静脉内、或通过吸入而不同。与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是化合物产生治疗效果的量。

本发明的药物制剂可以根据本领域已知的用于制造药物的任何方法来制备，并且可以包含甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。可以将制剂与适合制造的无毒药学上可接受的赋形剂混合。制剂可以包含一种以上的稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，并且可以以这样如液体、粉末、乳剂、冻干粉末、喷雾剂、乳膏、洗剂、控释制剂、片剂、丸剂、凝胶剂、贴片、植入物等形式提供。

可以使用本领域公知的药学上可接受的载体以适当的和合适的剂量来配制用于口服施用的药物制剂。此类载体使药物能够以适合受试者摄入的单位剂型配制为片剂、丸剂、散剂、糖衣丸、胶囊、液体、锭剂、凝胶、糖浆、浆液、混悬剂等。可以将用于口服的药物制剂配制成固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并在需要时加入合适的其他化合物后加工颗粒的混合物以获得片剂或糖衣丸芯。合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白填料，包括例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨糖醇；来自玉米、小麦、大米、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白，例如明胶和胶原蛋白。可以添加崩解剂或增溶剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸、或其盐，例如海藻酸钠。推入配合式胶囊(push-fit capsule)可以包含与填料或粘合剂如乳糖或淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁、以及任选的稳定剂混合的活性剂。在软胶囊中，可以将活性剂溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或带有或不带有稳定剂的液态聚乙二醇中。

水性混悬剂可包含与适于制造水性混悬剂，例如用于水性皮内注射剂混合的活性剂(例如，本发明的核酸序列)。此类赋形剂包括悬浮剂如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶，以及分散剂或润湿剂如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。水性混悬剂还可包含一种以上的防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种以上的着色剂、一种以上的调味剂和一种以上的甜味剂，例如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可以调节制剂的渗透性。

在一些实施方案中，油基药物用于本文所述的治疗性阻断剂的施用。油基混悬剂可通过将活性剂悬浮在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或例如液体石蜡等的矿物油；或这些的混合物中来配制。参见例如，美国专利号5,716,928，其描述使用精油或精油组分来提高口服施用的疏水性药物化合物的生物利用度并降低个体间和个体内的可变性(也参见美国专利号5,858,401)。油混悬剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂以提供可口的口服制剂，例如甘油、山梨糖醇或蔗糖。这些制剂可以通过添加例如抗坏血酸等的抗氧化剂来保存。作为可注射油介质的实例，参见Minto(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281:93-102。

药物制剂也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是如上所述的植物油或矿物油，或它们的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶阿拉伯胶和黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂也可以包含甜味剂和调味剂，如在糖浆剂和酏剂的制剂中。这样的制剂还可以包含缓和剂、防腐剂或着色剂。在替代实施方案中，本发明的这些可注射的水包油乳剂包含石蜡油、脱水山梨糖醇单油酸酯、乙氧基化脱水山梨糖醇单油酸酯和/或乙氧基化脱水山梨糖醇三油酸酯。

药物化合物还可以通过鼻内、眼内和阴道内途径施用，包括栓剂、吹入剂、散剂和气雾剂(例如，类固醇吸入剂，参见例如，Rohatagi(1995)J.Clin.Pharmacol.35:1187-1193；Tjwa(1995)Ann.Allergy Asthma Immunol.75:107-111)。栓剂可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下为固体，但在体温下为液体，因此会在体内融化释放药物。这样的材料是可可脂和聚乙二醇。

在一些实施方案中，药物化合物可以通过局部途径透皮递送、配制成涂药棒、溶液、混悬剂、乳剂、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、凝胶剂、涂剂、散剂、和气雾剂。

在一些实施方案中，药物化合物也可以作为微球递送以在体内缓慢释放。例如，微球可以通过皮内注射缓慢皮下释放的药物来施用。参见Rao(1995)J.BiomaterSci.Polym.Ed.7:623-645；作为可生物降解和可注射的凝胶制剂，参见，例如，Gao(1995)Pharm.Res.12:857-863(1995)；或作为用于口服施用的微球，参见，例如，Eyles(1997)J.Pharm.Pharmacol.49:669-674。

在一些实施方案中，药物化合物可以肠胃外施用，例如通过静脉内(IV)施用或施用到器官的体腔或内腔中。这些制剂可包含溶解在药学上可接受的载体中的活性剂溶液。可以使用的可接受的介质(vehicle)和溶剂是水和林格氏溶液(Ringer's solution)(一种等渗的氯化钠)。此外，无菌固定油可用作溶剂或悬浮介质(medium)。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，例如油酸等脂肪酸同样可以用于注射剂的制备中。这些溶液是无菌的，并且通常没有不良物质。这些制剂可以通过常规的，公知的灭菌技术进行灭菌。制剂可以包含近似生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以在很大范围内变化，并且将根据所选择的特定施用方式和受试者的需要，主要基于体液量、粘度和体重等进行选择。对于IV施用，制剂可以是无菌可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质悬浮液。可以使用那些合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂来配制该悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如1,3-丁二醇溶液中的悬浮液。施用可以通过推注或连续输注(例如，在指定的时间段内基本上不间断地引入血管中)。

在一些实施方案中，可以将药物化合物和制剂冻干。包含寡核苷酸的稳定的冻干制剂可以通过冻干包含本发明的药物和填充剂，例如甘露醇、海藻糖、棉子糖和蔗糖或其混合物的溶液来制备。制备稳定的冻干制剂的工艺可以包括冻干约2.5mg/mL蛋白、约15mg/mL蔗糖、约19mg/mL NaCl、和pH大于5.5但小于6.5的柠檬酸钠缓冲液。参见，例如，美国20040028670。

组合物和制剂可以通过使用脂质体来递送。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面带有对靶细胞具有特异性的配体，或优先针对特定器官的脂质体的情况下，可以将活性剂集中在体内递送到靶细胞中。参见，例如，美国专利号6,063,400；6,007,839；Al-Muhammed(1996)J.Microencapsul.13:293-306；Chonn(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708；Ostro(1989)Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587。如本发明中所使用的，术语“脂质体”是指由以一个双层或多个双层排列的两亲性脂质组成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和含有待递送的组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，被认为与带负电荷的DNA分子相互作用形成稳定的复合物。pH敏感或带负电荷的脂质体被认为捕获DNA而不是与其复合。阳离子脂质体和非阳离子脂质体均已用于将DNA传递至细胞。

脂质体还可以包括“空间稳定的”脂质体，即，包含一种以上的特殊脂质的脂质体。当掺入脂质体中时，相对于缺乏此类特殊脂质的脂质体，这些特殊脂质导致脂质体的循环寿命增加。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体的形成囊泡的脂质部分的一部分包含一种以上的糖脂或被一种以上的亲水性聚合物如聚乙二醇(PEG)部分衍生化的那些脂质体。脂质体及其用途进一步记载于美国专利号6,287,860。

可以施用本发明的制剂用于预防性和/或治疗性治疗。在一些实施方案中，对于治疗应用，将组合物以足以治愈、减轻或部分阻止病症或其并发症的临床表现的量施用于处于本文所述病症的风险或具有本文所述病症的受试者；这可以称为治疗有效量。

足以完成此操作的药物组合物的量是治疗有效剂量。对于该用途有效的剂量方案和量，即剂量方案，将取决于多种因素，包括疾病或病况的阶段、疾病或病况的严重程度、受试者的健康的一般状况、受试者的身体状况、和年龄等。在计算受试者的剂量方案时，还考虑施用方式。

剂量方案还考虑本领域公知的药代动力学参数，即，活性剂的吸收率、生物利用度、代谢和清除等(参见，例如，Hidalgo-Aragones(1996)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.58:611-617；Groning(1996)Pharmazie 51:337-341；Fotherby(1996)Contraception 54:59-69；Johnson(1995)J.Pharm.Sci.84:1144-1146；Rohatagi(1995)Pharmazie 50:610-613；Brophy(1983)Eur.J.Clin.Pharmacol.24:103-108；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005)。技术水平允许临床医生确定每个个体受试者、活性剂和所治疗疾病或病况的剂量方案。为用作药物的类似组合物提供的指南可以用作确定剂量方案的指南，即，实施本发明方法所施用的剂量方案和剂量水平是正确和适当的。

可以根据例如以下单次或多次施用制剂：受试者所需和耐受的剂量和频率、每次施用后产生的治疗效果的程度和量(例如，对肿瘤大小或生长的影响)等。制剂应提供足够量的活性剂，以有效治疗、预防或改善病况、疾病或症状(例如，癌症)。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1

所有结合的RNA-ISH和IHC测定如下进行：免疫细胞的单克隆抗体(T细胞亚群CD3、CD4、CD8、FOXP3；巨噬细胞CD68、CD163；B细胞CD20；NK细胞CD16，CD56)和用于重复RNA(HSATII、HERV-K、HERV-H、LINE1)的RNA ISH探针顺序应用于单个组织切片上，并使用对比色原来显示抗体：棕色(二氨基联苯胺[DAB])表示免疫标志物和RNA：红色(固红)表示重复RNA。将石蜡包埋的切片安装在包被的载玻片上，并在烘箱中在60℃下放置60分钟。使用Leica Bond Rx自动免疫染色仪进行顺序双重染色方案。使用作为基于EDTA的专有Leica溶液(pH 8.0-8.5)的HIER2试剂，在大约100℃下进行去石蜡(View RNA Dewax1方案)和板载抗原修复20分钟。按照方案在Leica抗体稀释液中稀释每个免疫细胞亚群的单克隆抗体。对于ISH部分，将View-RNA eZL检测试剂盒(Affymetrix)与BDZ 6.0软件(Leica Biosystems)一起用于Bond RX免疫组织化学和ISH染色系统。第2部分的Bond RX用户可选设置如下：ViewRNA eZ-1检测1-plex(Red)方案；ViewRNA Dewax1准备方案；ViewRNA酶2(10)；ViewRNA探针杂交3小时，在这些设置下，用于FFPE组织的RNA暴露条件由以下组成：与Bond酶预处理试剂盒中的蛋白酶K以1:1000稀释(Leica Biosystems)孵育10分钟。在ViewRNA探针稀释液(Affymetrix)中将RNA重复Ez探针以1:40稀释。运行后，将载玻片用水冲洗，在室温下风干30分钟，然后使用Dako Ultramount(Dako，Carpinteria，CA)安装，并使用标准的高亮度显微镜观察。在细胞质和细胞核中的点状斑样红色杂交信号被定义为重复RNA的阳性信号，并且淋巴细胞中的棕色细胞质应答性被认为是免疫标志物阳性。

实施例2

免疫疗法领域已发现CD8+T细胞浸润通常与免疫疗法(CTLA4或PD1/PDL1)的应答相关(Taube JM等人Mod Pathol.2017 Dec 1.doi:10.1038/modpathol.2017.156)。FOXP3+调节性T细胞被认为阻断抗肿瘤T细胞应答，尽管该数据之间的矛盾更大(参见，例如，Manjili和Butler,Immunol Invest.2016 Nov；45(8):759-766；Ward-Hartstonge和Kemp,Clin Transl Immunology.2017 Sep 15；6(9):e154)。

我们预测HSATII低肿瘤与高CD8 T细胞浸润相关，而HERV-H高肿瘤与低FOXP3+细胞相关，后者对免疫疗法的应答最强。

如本文所示，HSATII低黑素瘤对包括抗PD1/PDL1和抗CTLA4疗法在内的免疫疗法产生应答(图5)。简而言之，采用HSATII RNA-ISH结合CD3 T细胞IHC分析来评估一组20名接受过福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织的抗PD1/PDL1或抗CTLA4疗法的黑素瘤患者。通过病理学家手动计数400x200微米区域中的细胞的量化来评估肿瘤的HSATII RNA水平(高vs低)和CD3 T细胞浸润。在HSATII高vs低肿瘤中，CD3 T细胞浸润显著较低(p<0.02)。根据标准临床影像学标准(CT扫描变化)确定HSATII表达与免疫疗法应答之间存在相关性，其中HSATII低肿瘤对这些检查点免疫疗法药物有应答，而HSATII高肿瘤对这些检查点免疫疗法药物没有应答。

此外，本数据表明，在人类结肠癌组中，HSATII高信号与CD163+肿瘤相关巨噬细胞正相关(图6和7)，这通常与免疫抑制或无应答肿瘤微环境相关(Ruffelll和Coussens,Cancer Cell.2015 Apr 13；27(4):462–472)。简而言之，将组织微阵列上的原发性结肠癌用HSATII RNA-ISH结合CD163巨噬细胞IHC测定进行染色。通过病理学家手动计数400x200微米区域中的细胞的量化来评估肿瘤的HSATII RNA水平(高vs低)和CD163巨噬细胞浸润。在HSATII高结肠癌中，CD163巨噬细胞显著更高(****p<0.0001)。

实施例3

HSATII和CD163+巨噬细胞在胰腺导管腺癌(PDAC)中呈正相关。HSATII高表达与更高的CD163+巨噬细胞相关。因此，肿瘤细胞中的HSATII是巨噬细胞浸润的替代标志物，可用于选择在肿瘤免疫微环境中靶向巨噬细胞的药物的患者。这一发现与图6和图7中结肠癌的数据一致。

显示通过IHC对由HSATII高(高，中)和低(低，阴性)表达区分的PDAC肿瘤中CD8+T细胞的定量(图8)。

实施例4

HSATII和CD8+T细胞在胰腺导管腺癌(图9)、肝内胆管癌(图11)、和肝细胞癌(图12)中呈负相关，证明该标志物可作为细胞溶解性免疫细胞浸润的替代物，这将有助于确定适合免疫检查点抑制的肿瘤(抗CTLA4和/或抗PD1/PDL1)。这扩展了发表的结肠癌的数据(Solovyov等人Cell Reports 2018)。

在由HSATII高(高，中)和低(低，阴性)表达区分的PDAC(图10)和ICC(图13)肿瘤中进行CD8 T细胞的定量。

实施例5

实验步骤

我们从TCGA中选择38个具有总RNA冷冻实体瘤RNA-Seq数据的样品。这些样品由12个LUAD、10个COAD、5个BRCA、4个KIRC、4个UCEC、3个BLCA肿瘤组成。在这38个样品中，有29个样品具有匹配的poly(A)RNA-Seq数据。总RNA和poly(A)制备的等分试样均来自同一实体样品。这些样品由11个LUAD、6个COAD、5个BRCA、4个KIRC、3个BLCA肿瘤组成。这种配对样品的存在使人们对测序方案及其对计算的基因表达的影响进行技术比较。

总RNA和poly(A)制备方案使用不同的核糖体RNA(rRNA)消耗策略。总RNA方案采用RiboZero试剂盒去除rRNA。poly(A)使用poly(A)捕获程序来分离聚腺苷酸化的转录本，从而将rRNA排除在外。经过初步质量过滤后，我们将人类基因组的读段和重复元件的Repbase数据库的读段进行比对(Bao等人，2015)。定量映射到带注释的基因组特征的读段数，并计算表达。

使用edgeR包的calcNormFactors函数中应用的TMM方法，以log2-CPM(每百万读段计数)为单位计算样品中基因表达并将其标准化(Robinson等人，2010)。仅将编码基因用于标准化。尤其是，此过程确保完成rRNA读段的计算减法。标准化程序的目的是确定一些参考量(例如，看家基因表达)，可以在不同样品之间进行比较以建立样品特异性标准化因子。特别地，TMM标准化程序假设大多数基因没有差异表达，或者除某些异常值外，过表达和失表达的影响大致相等。当我们考虑编码基因的方案特异性差异时，这些假设是合理的。确实，大多数编码基因预期被两种方案检测到，而重复元件则并非如此。滤出低表达基因(至少两个样品中每百万读段不具有至少10个读段的基因)。所有数据集均使用相同的方案。

使用limma包计算两个方案之间的计算表达式差异(Smyth,2004；Ritchie等人,2015)。表达数据与通过voom转换计算的权重结合使用(Law等人,2014)。尽管使用相同的计算程序(如在limma软件包中实施的成对t检验)，但这种“差异表达”检验测定的是两种测序方案之间的技术差异，而不是各个组织之间的生物学差异。该差异表示为倍数变化的二进制对数(logFC)。

如下对计算的基因表达的方差进行卡方检验。我们只考虑使用poly(A)和总RNA方案两者的中值表达超过log2(10)的基因。对于每个实体样品，我们计算poly(A)方案和总RNA方案的表达值之间的差异。然后，我们计算这些差异的方差。我们对方差进行卡方检验，以验证这些差异是否与样本无关。我们要求两个生物病况(例如肿瘤和正常组织)FC＝2之间的线性倍数变化是可检测的，我们假设每种病况的n＝3个重复。这导致检验中使用的方差的截止。使用Benjamini&Hochberg方法计算调整后的p值(FDR)。

我们进行方差和基因组中重复长度的log之间的线性回归分析。对于秩相关ρ，我们在log((1+ρ)/(1-ρ))和基因组中重复长度的log之间进行线性回归分析(逻辑回归分析)。

基于表达的重复元件的聚类按如下进行。我们创建了1000个引导数据集，并在每个数据集上进行聚类。之后，我们计算一致性聚类。使用(Greenbaum等人,2012)中开发的方法计算作用于序列基序的熵力。

基因本体富集分析是使用PANTHER提供的网络工具进行的(Thomas等人,2003；Mi等人,2009)。我们将“GO生物过程完成”注释集(GO本体数据库检索于2017年1月26日)与PANTHER过表达试验(20160715版)一起使用，并进行邦费罗尼校正。

GSEA分析使用预先列序的基因清单进行。列表中的基因根据差异表达分析中的t统计量列序。该列表包括所有表达的基因，不一定是差异表达的基因。我们承认我们使用基因集富集分析、GSEA软件、和分子特征数据库(MsigDB)，http://www.broad.mit.edu/gsea/(Subramanian等人,2005)。

结果

ERV类表达可与阳性抗PD-L1免疫疗法应答相关。

预先存在的肿瘤T细胞炎症可以是对诸如抗PD-L1/PD-1或抗CTLA-4抗体等的癌症免疫疗法应答的强预测因子(Chen等人Nature 2017,541:321-330)。最近有几项研究强调了肿瘤ERV表达、“病毒防御基因”的表达与抗肿瘤应答之间的联系(Chiapinelli等人Cell2015,162,974-986；Roulois等人Cell 2015,162:961-973；Badal等人JCI Insight 2017,2,e92102)。我们假设肿瘤中化学诱导的表观遗传失调导致ERV的表达，进而刺激先天免疫PRR并产生抗肿瘤先天免疫应答。在这些研究之一(Chiapinelli等人2015)中，内源性ERV的存在与用抗CTLA-4疗法治疗的患者的临床获益相关。我们检查来自PD-L1阻断治疗患者的少数可用肿瘤免疫疗法RNA-seq数据集之一(Snyder等人2017)。在这组尿路上皮癌患者中，我们试验ERV表达也与疗法的临床获益相关的假设。与先前的抗CTLA4研究相反，我们在抗PDL1治疗的肿瘤中首次进行该分析。

我们使用repeatmasker/Repbase注释利用ERV重复的表达进行分层聚类，揭示高和低ERV表达水平的两个不同的簇。在这种情况下，ERV重复表达与患者对PD-L1免疫疗法的应答之间存在显著关联(p＝0.024，Fisher精确检验)。因此，患者生存分析表明，ERV重复的高表达与总体生存率(图14B，p＝0.012)和无进展生存率(图14C，p＝0.025)相关。我们对临床获益与总ERV重复表达进行逻辑回归分析，

其中E_ERV是ERV重复的总表达，p是临床获益的可能性。E_ERV的系数是显著的(p值＝0.04)。

我们对总生存率进行了Cox回归分析(风险＝-2.9*E_ERV+0.4*年龄+3.2*met；其中E_ERV是ERV重复的总表达，年龄是患者的年龄，当存在肝转移时met为1，否则为0)。E_ERV和met的系数是显著的(p＝0.001和p＝0.003)。我们对无进展生存率进行Cox回归分析(风险＝-1.5*E_ERV-1.9*年龄+1.8*met)。E_ERV和met的系数是显著的(p＝0.009和p＝0.02)。在这两种情况下，我们都对比例风险假设进行检验，该假设成立。

有趣的是，与该组中的病毒防御标记相比，ERV重复的表达是对免疫疗法应答的更好预测因子，该研究并未以类似方式将患者分开(图14A)。我们使用患者的年龄、肝转移的存在以及病毒防御基因或ERV之一的表达作为自变量，对危险比例进行一系列的Cox回归分析。ERV表达的影响与生存率提高相关，并且在统计学上是显著的(p＝0.001，FDR＝0.02)。病毒防御基因的作用在统计学上不显著。此外，正如我们显示的那样，ERV重复的Repeatmasker/Repbase注释产生的读段数比Ensembl中注释的ERV基因的读段数高，因此我们建议临床研究通过询问特定重复序列的类的整体重复表达，而不是在Ensembl中注释的特定ERV基因或其相关免疫类揭示更准确的关联。值得一提的是，在Ensembl中注释的ERV基因的读段计数低于具有最高读段数的RNA-Seq、ERV3和ERV3K的标准每百万10个读段的阈值。这两个基因的表达与平均ERV表达相关。这暗示，由于重复元件的大量转录，与相关免疫基因的表达相比，它们是对免疫疗法产生应答的更可靠的预测因子，而相关免疫基因的表达需要更大的样品量才能解决同类研究。

此外，我们调查(Hugo等人)的数据集，并使用年龄、非同义突变数和病毒防御基因或ERV之一的表达作为自变量进行类似的系列Cox回归分析。病毒防御基因和ERV的表达均未对危险比例产生统计学上的显著影响。值得注意的是，与(Snyder等人)的数据集不同，该数据集中的几乎所有肿瘤都是转移性的。同样，该数据集用于黑素瘤，与尿路上皮癌相比，ERV表达模式不同，这会使它们的存在更加难以评估。总而言之，这表明存在与不同表型相关的独特重复类，这些不同表型是组织背景相关的，值得进一步研究。

其它实施方案

应当理解，尽管已经结合本发明的详细描述记述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。