甘氨酸在预防和/或治疗炎性肠病中的应用
阅读说明：本技术 甘氨酸在预防和/或治疗炎性肠病中的应用 (Use of glycine for the prevention and/or treatment of inflammatory bowel disease ) 是由 武振龙 张云常 杨鹰 于 2020-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药领域,涉及甘氨酸在预防和/或治疗炎性肠病中的用途。具体地,本发明发现甘氨酸可以显著改善由柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)诱导的炎性肠病小鼠模型中的体重降低、疾病指数升高、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和结肠炎症反应,进而发现甘氨酸可以显著缓解小鼠炎性肠病,从而用于预防和/或治疗炎性肠病药物的开发和制备。本发明从营养干预的角度为预防和/或治疗炎性肠病提供一种可行性思路。(The invention belongs to the field of biomedicine, and relates to application of glycine in preventing and/or treating inflammatory bowel diseases. Specifically, the glycine can be used for remarkably improving weight reduction, disease index increase, spleen hyperplasia, colon shortening, colon mucosa hyperplasia and colon inflammatory response in a mouse model of inflammatory bowel disease induced by Citrobacter (Citrobacter rodentium), and further can be used for remarkably relieving the inflammatory bowel disease of mice, so that the glycine can be used for developing and preparing medicaments for preventing and/or treating the inflammatory bowel disease. The invention provides a feasible idea for preventing and/or treating inflammatory bowel diseases from the aspect of nutritional intervention.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，涉及甘氨酸在制备用于预防和/或治疗炎性肠病的药物中的用途。更具体地，本发明涉及甘氨酸在制备用于改善由柠檬酸杆菌(Citrobacterrodentium)诱导的体重降低、疾病指数升高、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和/或结肠炎症反应的药物中的用途。
背景技术
炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性、易复发的胃肠部疾病，临床病症主要表现为腹痛、腹胀、腹泻以及便血。在过去的几十年里，炎性肠病在全球的发病率逐年递增，尤其是在西方国家，这使得炎性肠病成为全球的重要公共健康问题。
根据炎性肠病的发病部位可以将其分为两类：发生在结肠和直肠黏膜的溃疡性结肠炎以及发病部位涉及整个胃肠道的克罗恩氏病。虽然近些年对炎性肠病的研究更加完整和系统，但对其精确的病理学和发病机制的了解还不很透彻。最近的研究表明，遗传因素和环境因素(营养物质的摄入、肠道微生物环境和外界应激)都与炎性肠病的发生和发展相关。
目前，临床上治疗炎性肠病的主要方法有：传统药物及免疫抑制剂治疗、生物制剂治疗、微生态制剂治疗、抗生素治疗和手术治疗。这些治疗方法虽然对炎性肠病有一定的治疗效果，但每种方法都存在一些不足，如伴有一定的副作用或治疗成本较高等。
因此，需要一种安全、高效、无副作用的缓解、预防和/或治疗炎性肠病的药物和疗法。
发明内容
如上所述，本领域亟需一种成本低、安全、无副作用的炎性肠病的药物和疗法，其可以有效地预防、缓解和/或治愈炎性肠病，并且易施用、副作用小、治疗成本低。
本申请的发明人通过用柠檬酸杆菌(C.rodentium)灌胃在小鼠中诱导/模拟克罗恩氏病，向该小鼠给药不同剂量的甘氨酸。结果，意外地发现，补充甘氨酸可以缓解柠檬酸杆菌引起的小鼠体重下降、疾病指数、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和结肠炎症反应，从而缓解小鼠结肠炎。基于此发现，本发明人完成了本发明。
因此，在本发明的第一方面，本发明提供了甘氨酸在制备用于预防和/或治疗炎性肠病的药物中的用途。
在第二方面，本发明提供了甘氨酸在制备用于改善由柠檬酸杆菌诱导的体重丢失、疾病指数升高、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和/或结肠炎症反应的药物中的用途。
本发明的有益之处在于：甘氨酸能够显著改善由肠道微生物柠檬酸杆菌引起的炎性肠病相关的症状，如体重降低、疾病指数升高、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和结肠炎症反应，从而预防和/或治疗炎性肠病。本发明提供了一种营养调控缓解肠道疾病的新思路，并且提供了用于制备预防和/或治疗炎性肠病的药物。
附图说明
本发明附图与本发明的实施方案一起提供了对本发明的进一步解释，并且构成说明书的一部分。显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施方案，而并不构成对本发明的限制。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1示出了甘氨酸对柠檬酸杆菌诱导的小鼠体重变化和疾病指数(Diseaseactivity index,DAI)的影响。其中，图1A示出了不同组的小鼠在感染后不同天数下的体重变化的统计结果；图1B示出了不同组的小鼠在感染后不同天数下的疾病指数评分变化的统计结果。数据表示为每组(9只)小鼠的平均值±标准误；*表示与对照组相比的组间差异显著，P<0.05；^表示与治疗相比的组间差异显著，P<0.05；#表示与预防组相比的组间差异显著，P<0.05。疾病指数评分由体重下降、粪便黏稠度和小鼠灌菌后精神状态评分总和得到。
图2示出了甘氨酸对柠檬酸杆菌诱导的小鼠脾脏重量和结肠长度的影响。其中，图2A示出了不同组小鼠在经历14天试验之后的脾脏重量的统计结果；图2B示出了不同组小鼠在经历14天试验之后的结肠示意图；图2C示出了不同组小鼠在经历14天试验之后结肠长度的统计结果。数据表示为每组(9只)小鼠的平均值±标准误；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05。
图3示出了甘氨酸对柠檬酸杆菌诱导的小鼠结肠黏膜增生的影响。其中，图3A示出了不同组小鼠在经历14天试验之后的结肠形态的统计结果；图3B示出了不同组小鼠在经历14天试验之后的结肠黏膜厚度的统计结果。数据表示为每组(6只)小鼠的平均值±标准误；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；白色标尺代表100μm。
图4示出了甘氨酸对柠檬酸杆菌诱导的小鼠结肠细胞增殖的影响。其中，图4A示出了不同组小鼠在经历14天试验之后的结肠Ki67+细胞染色结果(红色)；图4B示出了不同组小鼠在经历14天试验之后的结肠Ki67+细胞数的统计结果；数据表示为每组(6只)小鼠的平均值±标准误；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；白色标尺代表20μm。
图5示出了甘氨酸对柠檬酸杆菌诱导的小鼠结肠炎性细胞浸润的影响。其中，图5A示出了不同组小鼠在经历14天试验之后的结肠炎性细胞染色结果(红色)；图5B示出了不同组小鼠在经历14天试验之后结肠炎性细胞浸润的统计结果；数据表示为每组(6只)小鼠的平均值±标准误；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；白色标尺代表20μm。
具体实施方式
下面将对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
如上所述，本领域亟需一种安全、高效、无副作用的炎性肠病疗法，其可以有效地预防、缓解和/或治愈炎性肠病，并且易实行、副作用小、治疗成本低。
如背景技术部分所述，所谓“炎性肠病”是指一种慢性的、易复发炎症性肠道疾病，其临床病症主要表现为腹痛、腹胀、腹泻以及便血。此外，炎性肠病患者还会出现体重丢失、疾病指数升高、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生、结肠炎性反应等表现。
如上所示，本发明人意外地发现，甘氨酸可以有效缓解柠檬酸杆菌诱导的小鼠结肠炎症反应，从而缓解小鼠结肠炎。基于此发现，本发明人完成了本发明。
因此，第一方面，本发明提供了甘氨酸在制备用于预防和/或治疗炎性肠病的药物中的用途。
在本文中，所谓“预防”是指对正常个体或者说易感个体施行的预防性干预，由此使该个体免于出现某种疾病或者病症。在本发明中，预防的效果表现在以下几个方面：相对于对照组(即，不给药并正常喂食)，体重保持稳定、疾病指数不会升高、脾脏不发生增生、结肠长度不会变短、结肠粘膜不会发生增生，并且不会出现结肠炎症反应。
在本文中，所谓“治疗”是对患病个体施行的治疗性干预，由此使该患病个体的疾病或者病症相对于未施行所述治疗性干预之前不再发展、有所缓解或者得到治愈。在本发明中，治疗的效果表现为以下几个方面：相对于患病组(即柠檬酸杆菌灌胃组)，治疗组(即8至14天灌胃甘氨酸)以及预防组(即1至14天灌胃甘氨酸)小鼠的体重下降得到缓解；疾病指数升高得到改善，降至与对照组相当的水平；脾脏增生得到抑制，恢复到与对照组相当的水平；结肠长度变短被抑制，结肠长度与对照组基本相当；结肠粘膜增生被抑制，恢复到与对照组相当的水平；结肠炎症反应得到显著抑制。
“治疗有效量”是指能够延迟或预防某种疾病或者病症的发作，或者减缓或阻止某种疾病或者病症的进展、加重或恶化，而不引起明显的负面或不利的副作用的水平或量。出于预防作用，可以在某种疾病如炎性肠病发作之前施用治疗有效量。替代地，出于治疗作用或维持治疗作用，可以在某种疾病如炎性肠病的症状开始后施用治疗有效量。
如背景技术部分所述，炎性肠病可以分为溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
溃疡性结肠炎于1875年首先由Willks和Moxon描述，1903年Willks和Boas将其命名为溃疡性结肠炎，1973年世界卫生组织(WHO)医学科学国际组织委员会正式命名为慢性非特异性溃疡性结肠炎。该病是一种主要侵及结肠黏膜的慢性非特异性炎性疾病，常始于左半结肠，可向结肠近端乃至全结肠，以连续方式逐渐进展。临床症状轻重不一，可有缓解与发作相交替，患者可仅有结肠症状，也可伴发全身症状。
克罗恩氏病又称局限性回肠炎、局限性肠炎、节段性肠炎和肉芽肿性肠炎、也译为克隆氏病，是一种原因不明的肠道炎症性疾病。克罗恩氏病在整个胃肠道的任何部位均可发生，但常发于末端回肠和右半结肠，以腹痛、腹泻、肠梗阻为主要症状，且有发热、营养障碍等肠外表现。病程多迁延，常有反复，不易根治。
在一个实施方案中，所述炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
在一个实施方案中，所述炎性肠病为由肠道微生物诱导的炎性肠病。在一个具体实施方案中，所述炎性肠病为由柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病。
在一个实施方案中，所述药物含有预防和/或治疗有治疗有效量的甘氨酸。
在一个实施方案中，如本领域技术人员可以理解的那样，甘氨酸还可以与预防和/或治疗炎性肠病的其他药物联合使用。所述其他药物可以为5-氨基水杨酸。
在第二方面，本发明提供了甘氨酸在制备用于改善由柠檬酸杆菌诱导的体重丢失、疾病指数升高、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和/或结肠炎症反应的药物中的用途。
本发明的有益之处在于：甘氨酸能够显著改善由柠檬酸杆菌引起的炎性肠病相关的症状，如体重降低、疾病指数升高、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和结肠炎症反应，从而预防和/或治疗炎性肠病。因此，本发明提供了一种营养干预缓解肠道疾病的新思路，并且提供了用于制备预防和/或治疗炎性肠病的药物。
实施例
下述实施例将以小鼠为给药对象，验证甘氨酸在缓解小鼠由柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病病状如体重降低、疾病指数、脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和结肠炎症反应中的疗效。
如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
1.试验动物
试验选用48只SPF级4周龄雌性C57BL/6小鼠(购自北京华阜康实验动物技术有限公司)，在23±1℃鼠房内进行饲养，每天光照时间为12小时(8点至20点)，自由采食和饮水，适应一周后开始正式试验。
2.试剂和材料
甘氨酸：购自美国Sigma公司；
柠檬酸杆菌(DBS100)：购自美国ATCC生物资源中心，编号51459；
小鼠维持日粮：购自北京华阜康生物实验动物技术有限公司，货号1022；
多聚甲醛、苏木精和伊红染料：均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
Ki67+抗体：购自美国BD公司；
CD4+、CD8+、CD11b+、F4/80+抗体和Alexa Fluor 594二抗：购自美国Biolegend公司。
3.主要仪器设备
超低温冰箱，MLT：购自美国Thermo公司；
石蜡切片机：RM2233，购自德国Leica公司；
冰冻切片机：CM3050 S，购自德国Leica公司；
数码成像系统：DP72，购自日本OLYMPUS公司；
超纯水系统：Arium Pro VF，购自德国Sartoris公司；
冷冻离心机：Legend micro 21R，购自美国Thermo公司。
4.试验方法
1)炎性肠病小鼠模型的建立、分组及给药
一周适应期后，小鼠根据体重随机分为4组，每组12只，包括：
对照组：日常喂食，不给药柠檬酸杆菌，也不给药甘氨酸；
患病组：日常喂食，在第8天时经灌胃给药2×109CFU的柠檬酸杆菌；
治疗组：在实验1至7天日常喂食，在实验第8天经灌胃给药2×109CFU的柠檬酸杆菌，同日开始每日经灌胃给药5.2mg/g体重的甘氨酸，持续7天；
预防组：连续14天每日经灌胃给药5.2mg/g体重的甘氨酸，在第8天时，小鼠经灌胃给药2×109CFU的柠檬酸杆菌；
试验周期为14天。
2)样品采集
在试验第15天时，将小鼠禁食6小时，用眼球法采取小鼠血液后，将其断颈处死。取小鼠脾脏并测量脾脏重量；取小鼠结肠组织，测量长度并拍取代表性图片，随后将其固定于4％多聚甲醛或包埋于冰冻切片包埋剂中。
3)结肠石蜡切片及染色
结肠组织石蜡切片的制备：
A.组织脱水、透明和浸蜡：将固定于4％多聚甲醛中的结肠组织取出，用PBS洗涤3次，保存于70％乙醇中；随后将所述组织从70％乙醇中取出，依次浸入80％乙醇40分钟，95％乙醇1小时，无水乙醇I 30分钟，无水乙醇II 30分钟，二甲苯I 5分钟，二甲苯II 5分钟，蜡溶液I1小时，蜡溶液II 1小时。
B.包埋：将蜡溶液倒入包埋盒中，置入组织块后，安装持蜡器。
C.切片：用手动切片机将蜡块切成5μm厚的蜡带，随后将蜡条浸入43℃水浴中并使其粘附于载玻片表面。
D.烤片：在37℃保温过夜，用62℃烤片1小时。
苏木精-伊红染色：
A.脱蜡：将切片依次浸入二甲苯I10分钟，二甲苯II 10分钟，无水乙醇8分钟，95％乙醇5分钟，70％乙醇5分钟，50％乙醇5分钟，蒸馏水5分钟。
B.染色：滴加苏木精染液染色1分钟，蒸馏水洗涤3次(每次2分钟)，1％盐酸酒精溶液分化5秒，蒸馏水洗涤3次(每次5分钟)，滴加伊红染液染色1分钟，蒸馏水洗涤3次(每次2分钟)。
C.脱水、透明、封片：将切片依次浸入70％乙醇2秒，95％乙醇5秒，无水乙醇5分钟，二甲苯I 5分钟，二甲苯II 5分钟，载玻片上滴加1滴中性树胶，盖玻片封片，干燥过夜。显微镜下观察拍照。ImageJ软件测量黏膜厚度。
4)结肠冰冻切片及免疫荧光染色
结肠组织石蜡切片的制备：包埋于冰冻切片包埋剂中结肠组织用冰冻切片机切成6μm厚的条带，粘附与载玻片表面，丙酮固定10分钟后保存于-80℃。
免疫荧光染色：
A.冰冻切片取出恢复至室温，用PBS洗涤1次。
B.用3％BSA室温封闭30min，用PBS洗涤3次。
C.将Ki67+、CD4+、CD8+、CD11b+和F4/80+用PBS按1:200的比例稀释成抗体稀释液，滴于载玻片上，4℃孵育过夜。
D.用PBS洗涤3次；将Alexa Fluor 594以1:200的比例稀释成抗体稀释液，滴于载玻片上，37℃孵育1小时。
E.用PBS洗涤3次；将Hoechst 33258以1:1000的比例稀释，滴于载玻片上，室温孵育5分钟。
F.在载玻片上滴加1滴封片剂，盖玻片封片，荧光显微镜下避光观察拍照。
5.统计分析
数据以每个给药组的全部12只小鼠或其中数只小鼠的平均值±SEM表示，并通过单因素方差分析进行分析。采用GraphPad Prism 7.0版(美国加利福尼亚州圣地亚哥市GraphPad软件公司)进行邓肯式多重比较以确定差异，P<0.05被认为差异显著。
6.试验结果
发明人以上述4个不同给药组的共48只小鼠为实验对象，其中，对照组小鼠为健康小鼠，其他3个组的小鼠在第8天经灌胃给药了柠檬酸杆菌，这些小鼠根据给药情况或轻或重地出现了由柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病的病症，由此。本发明人检测了甘氨酸对柠檬酸杆菌诱导的小鼠炎性肠病的病症的预防、缓解和/或治愈等疗效。
体重下降：4个不同给药组的小鼠给药后的体重统计结果示于图1A。与对照组相比，患病组的小鼠体重在给药柠檬酸杆菌之后的前3天体重下降显著，而补充甘氨酸则可以显著缓解柠檬酸杆菌引起的小鼠体重下降。并且，比较治疗组和预防组结果可知，预防组对体重下降的缓解效果略微优于治疗组。具体地，当在试验的14天中每天给药甘氨酸剂量5.2mg/g体重时，小鼠体重在给药柠檬酸杆菌后的前3天能够基本保持不变。结果表明，甘氨酸可以预防柠檬酸杆菌诱导的小鼠体重下降。
此外，除对照组的健康小鼠外，其他三组的小鼠体重在感染7天后体重趋于一致，这是因为柠檬酸杆菌为非致死性肠道致病菌，而小鼠在感染柠檬酸杆菌之后体重会降低，但是随着时间增加，柠檬酸杆菌会排出体外，小鼠体重则会自然恢复。
疾病指数：4个不同给药组的小鼠给药后的疾病指数的统计结果示于图1B。疾病指数由体重丢失、粪便黏稠度和小鼠灌菌后精神状态评分总和。该指数越低，则表明小鼠结肠炎症状越轻。与对照组相比，患病组的小鼠在给药柠檬酸杆菌之后的疾病指数显著升高，这表明柠檬酸杆菌对小鼠结肠组织的破坏作用。补充甘氨酸则可以显著降低小鼠的疾病指数。比较治疗组和预防组结果可知，预防组对体重下降的缓解效果略微优于治疗组。具体地，在给药柠檬酸杆菌后第三天，治疗组和预防组小鼠的疾病指数降至与对照组相当。结果表明，甘氨酸可以缓解柠檬酸杆菌诱导的疾病指数。
脾脏增生：4个不同给药组的小鼠在14天试验之后的脾脏重量统计结果示于图2A。与对照组相比，患病组小鼠在给药柠檬酸杆菌之后的脾脏重量显著增加，这表明由柠檬酸杆菌诱导的结肠炎引起了小鼠的脾脏增生。而由治疗组和预防组的小鼠数据可知，补充甘氨酸则可以显著抑制由柠檬酸杆菌引起的小鼠脾脏增生，得到的脾脏重量与对照组相当。结果表明，甘氨酸可以显著抑制柠檬酸杆菌诱导的脾脏增生。
结肠变短：4个不同给药组的小鼠在14天试验之后的结肠长度代表性图片和统计结果分别示于图2B和2C。由图2B的结肠长度结果可知，患病组小鼠在给药柠檬酸杆菌之后出现结肠变短。而由治疗组和预防组的小鼠数据可知，补充甘氨酸则可以显著抑制小鼠的结肠变短。并且，比较治疗组和预防组结果可知，预防组对体重下降的缓解效果略微优于治疗组，得到的小鼠的结肠长度与对照组相当。这一结果表明，甘氨酸可以预防柠檬酸杆菌诱导的小鼠结肠变短。
结肠形态学：图3A示出了4个不同给药组的小鼠在14天试验之后的结肠形态学结果。结果表明，与对照组相比，给药甘氨酸和柠檬酸杆菌对结肠形态均无显著性影响。
结肠的黏膜增厚：图3B示出了4个不同给药组的小鼠在14天试验之后的结肠的黏膜厚度统计。由图3B可知，患病组的小鼠的结肠黏膜厚度显著增加，而补充甘氨酸则会显著抑制由柠檬酸杆菌诱导的结肠黏膜增厚。
结肠Ki67+细胞的染色：Ki67+是一种增殖细胞的相关抗原，Ki67+阳性细胞数越多，表明处于增殖周期的细胞越多。图4A和4B分别示出了4个不同给药组的小鼠给药后的结肠Ki67+细胞染色结果和统计结果。结果表明：相比对照组，给药柠檬酸杆菌的小鼠的结肠上皮Ki67+细胞(红色)显著增加，其中上皮Ki67+细胞数是对照组的约7倍。而补充甘氨酸则可以显著抑制结肠中上皮Ki67+细胞的增加。比较治疗组和预防组的结果可知，预防组对体重下降的缓解效果略微优于治疗组，而治疗组和预防组的小鼠则能够得到与对照组更为接近的上皮Ki67+细胞数目。结果表明，甘氨酸可以显著抑制和预防结肠中上皮Ki67+细胞的增加。
图3与图4示出了4个不同给药组小鼠在经历14天试验之后的结肠形态学、黏膜厚度和结肠上皮Ki67+细胞数的结果，表明甘氨酸可以显著抑制和预防柠檬酸杆菌诱导的结肠黏膜增生。
炎性细胞染色：4个不同给药组的小鼠在经历14天试验之后的结肠炎性细胞染色结果和统计结果分别示于图5A和图5B。结果表明：与对照组相比，给药柠檬酸杆菌的患病组小鼠的结肠上皮炎性细胞浸润(红色)显著增多，如CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD11b+，F4/80+巨噬细胞；而补充甘氨酸的治疗组和预防组的小鼠则没有观察到炎性细胞的浸润增多，并且，治疗组和预防组的结肠炎性细胞的数目与对照组相当。这一结果表明：甘氨酸可以显著缓解由柠檬酸杆菌诱导的小鼠结肠的炎性反应。