阅读说明：本技术 一种抑制肝癌干细胞迁移和侵袭的药物 (Medicine for inhibiting migration and invasion of liver cancer stem cells ) 是由 梁树卷 于 2020-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抑制肝癌干细胞迁移和侵袭的药物。所述药物为小分子抑制剂YYA-021,本发明证明了小分子抑制剂YYA-021在降低肝癌细胞HepG2存活和肝癌干细胞转移中的新用途,因此可将其用于制备治疗肝癌的药物。(The invention provides a medicine for inhibiting migration and invasion of liver cancer stem cells. The invention proves the new application of the small molecular inhibitor YYA-021 in reducing the survival of liver cancer cells HepG2 and liver cancer stem cell transfer, so that the small molecular inhibitor YYA-021 can be used for preparing the medicine for treating liver cancer.)

一种抑制肝癌干细胞迁移和侵袭的药物

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种抑制肝癌干细胞迁移和侵袭的药物。

背景技术

肝细胞癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，肝细胞癌患者的死亡率长期位居全球肿瘤死亡患者的前列。肝细胞癌是一种病理机制十分复杂的恶性肿瘤，其发生和发展是一个多基因、多阶段的过程，与多种因素相关。目前，干细胞癌的最常见治疗方式主要是手术切除，并采取化疗或放疗等辅助手段。但是，现有的治疗方式很难彻底根除肝细胞癌，患者术后5年的复发率高达70%。

肝癌转移是导致肝癌患者死亡的主要原因，而导致肿瘤转移的主要原因是患者存在肝癌干细胞。肝癌干细胞是肿瘤组织中的一小群干细胞样细胞，肝癌干细胞具有自我更新和多向分化潜能。大量的研究已经证实肝癌干细胞与肝细胞癌化疗和放疗的耐药，复发和转移密切相关。因此，选择有效的抑制肝癌干细胞转移的药物可以为治疗肝癌提供新的可能。

YYA-021是一种小分子CD4模拟物，具有高效抗HIV和低细胞毒性的特点，目前尚无关于YYA-021在肝癌干细胞中的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供YYA-021在抑制肝癌干细胞转移中的新用途。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了小分子抑制剂YYA-021在制备治疗肝癌药物中的应用。

优选地，所述小分子抑制剂YYA-021的分子式为C₁₈H₂₇N₃O₂。

优选地，所述应用包括小分子抑制剂YYA-021在促进肝癌细胞死亡中的应用。

优选地，所述应用包括小分子抑制剂YYA-021在抑制肝癌干细胞迁移中的应用。

此外，本发明提供了一种肝癌药物，所述药物中包括有效剂量的YYA-021。

优选地，YYA-021为所述肝癌药物的唯一有效成分或有效成分之一。

优选地，所述肝癌药物促进肝癌细胞死亡，所述肝癌药物抑制肝癌干细胞转移。

此外，本发明提供了小分子抑制剂YYA-021在制备抑制肝癌干细胞转移药物中的应用。

优选地，所述小分子抑制剂YYA-021的分子式为C₁₈H₂₇N₃O₂。

除此之外，本发明提供了一种抑制肝癌干细胞转移的药物，所述药物中包括有效剂量的YYA-021。

本发明的有益效果是：

本发明证明了小分子抑制剂YYA-021在抑制肝癌细胞存活和肝癌干细胞迁移和侵袭中的新用途。

附图说明

图1 小分子抑制剂YYA-021对于肝癌细胞HepG2的抑制作用。

图2 HepG2细胞和肝癌干细胞中的干细胞相关蛋白的表达差异。

图3 YYA-021对于肝癌干细胞中的EMT相关蛋白的调控。

图4 YYA-021对于肝癌干细胞迁移和侵袭的调控。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1

YYA-021对于肝癌细胞HepG2的调控

（1）将肝癌细胞接种于细胞培养板中，过夜培养后，进行实验处理；

（2）对照组添加DMSO，实验组使用10μM YYA-021和20μM YYA-021进行处理，处理24h后，进行拍照记录。

实施例1的实验结果如图1所示，可以看出，添加20μM YYA-021显著导致肝癌HepG2细胞的死亡，说明YYA-021能够通过促进肝癌细胞死亡来抑制肝癌。

实施例2

筛选和检测肝癌干细胞

1.肝癌干细胞筛选

（1）将生长状态较好的HepG2细胞使用PBS缓冲液进行清洗，加入0.25%胰蛋白酶将细胞消化成均匀的单细胞悬液，300g离心10min；

（2）去除上清，使用PBS再次将细胞分散成单细胞悬液，进行细胞计数；

（3）取10⁷/100μl数份于无菌流式管中，设置一个阴性对照管和数组的实验分选管，每管中加入20μ1FcR阻断剂阻断非特异性结合，5min；

（4）阴性对照管加入Mouse IgG1-PE抗体10μ1，实验分选管加入CD133/1-PE抗体20μ1,4℃避光孵育20min；

（5）孵育结束完添加4mlPBS缓冲液进行洗涤，300g离心10min；

（6）弃去上清，过400目细胞筛，1ml分选液重悬成单细胞悬液上机流式细胞仪进行分选，含干细胞培养液的15ml离心管接受HepG2 CD133 ⁺和CD133^-细胞。

2.肝癌干细胞检测

使用Western Blot检测CD133⁺和肿瘤干细胞相关蛋白C-MYC和OCT4的表达

（1）取生长状态良好的HepG2细胞和分选出的CD133⁺细胞加入RIPA蛋白裂解液，将细胞碎片转移至1.5ml EP管中；

（2）冰上放置30min，使用超声破碎仪破碎细胞；

（3）充分裂解后，4℃，12000rpm离心10min，将上清液吸入新的预冷的EP管中；

（4）根据BCA法定量样品蛋白浓度，由5×上样缓冲液调整各组待测蛋白，使得各组最终为25μg/μl；

（5）配置10%分离胶和5%浓缩胶，迅速插入梳子，凝固10min；

（6）将新鲜配置的电泳液倒入至电泳槽中，放置好上样板，依次加入Mark蛋白，HepG2细胞蛋白和CD133⁺细胞蛋白，接通电源，使用90V恒压跑浓缩胶，待溴酚蓝进入分离胶时调整为120V恒压，直至溴酚蓝跑至底部；

（7）裁剪PVDF膜放入甲醇中浸泡后置于电转液中，按照黑色夹-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白色夹的顺序安装电转夹，恒流250mA冰浴湿转90min；

（8）电转结束后，将PVDF膜置于5%的脱脂奶粉中，室温封闭1h；

（9）孵育CD133、OCT、C-MYC和GAPDH一抗，4℃摇床孵育过夜；

（10）一抗孵育完毕后，使用TBST洗膜3遍，每遍10min；

（11）室温孵育二抗90min，结束后使用TBST洗膜3遍，每遍10min；

（12）加入发光液，进行显影曝光。

实施例2的实验结果如图2所示，从图中可以看出CD133⁺的HepG2细胞中CD133、OCT、C-MYC的表达量均显著高于普通HepG2细胞，说明成功得到CD133+的HepG2细胞。

实施例3

检测YYA-021对于肝癌干细胞的抑制作用

（1）将CD133+的HepG2细胞接种于细胞培养板中，对照组添加DMSO，实验组使用5μMYYA-021和10μM YYA-021进行处理；

（2）处理48h后，加入RIPA蛋白裂解液，将细胞碎片转移至1.5ml EP管中；

（3）冰上放置30min，使用超声破碎仪破碎细胞；

（4）充分裂解后，4℃，12000rpm离心10min，将上清液吸入新的预冷的EP管中；

（5）根据BCA法定量样品蛋白浓度，由5×上样缓冲液调整各组待测蛋白，使得各组最终为25μg/μl；

（6）配置10%分离胶和5%浓缩胶，迅速插入梳子，凝固10min；

（7）将新鲜配置的电泳液倒入至电泳槽中，放置好上样板，依次加入Mark蛋白，HepG2细胞蛋白和CD133+细胞蛋白，接通电源，使用90V恒压跑浓缩胶，待溴酚蓝进入分离胶时调整为120V恒压，直至溴酚蓝跑至底部；

（8）裁剪PVDF膜放入甲醇中浸泡后置于电转液中，按照黑色夹-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白色夹的顺序安装电转夹，恒流250mA冰浴湿转90min；

（9）电转结束后，将PVDF膜置于5%的脱脂奶粉中，室温封闭1h；

（10）孵育N-cadherin、E-cadherin、Vimentin和GAPDH一抗，4℃摇床孵育过夜；

（11）一抗孵育完毕后，使用TBST洗膜3遍，每遍10min；

（12）室温孵育二抗90min，结束后使用TBST洗膜3遍，每遍10min；

（13）加入发光液，进行显影曝光。

实施例3得到的实验结果如图3所示，从图中可以看出，添加YYA-021能够抑制促迁移蛋白N-cadherin和Vimentin的表达，并且能够促进抑迁移蛋白E-cadherin的表达。

实施例4

1.细胞迁移

（1）将培养好的CD133⁺的HepG2细胞消化制备成单细胞悬液，使用PBS洗涤1次；

（2）对照组使用加有DMSO的DMEM培养基重悬至1×10⁶，实验组使用10μM YYA-02的DMEM培养基将细胞重悬至1×10⁶；

（3）在Transwell小室的下室中加入600μl含10% FBS的DMEM培养基，上室分别加入100ul对照组和实验组细胞重悬液；

（4）将Transwell小室置于恒温细胞培养箱中培养24h；

（5）培养结束后，取出Transwell小室，使用蘸有PBS的棉签擦洗上室；

（6）将小室放入到甲醇中，固定20min；

（7）使用5%的结晶紫染色20min，使用PBS进行清洗；

（8）使用倒置显微镜进行观察和拍照

2.细胞侵袭

（1）将冻存于-80℃冰箱中的BD Matrigel胶置于4℃过夜，解冻为液态；

（2）使用无血清培养基按照1：8稀释浓度稀释为50μg/ml Matrigel，充分混匀后，将60μl Matrigel胶加入到Transwell小室的上室；

（3）将培养好的CD133+的HepG2细胞消化制备成单细胞悬液，使用PBS洗涤1次；

（4）对照组使用加有DMSO的DMEM培养基重悬至1×10⁶，实验组使用10μM YYA-02的DMEM培养基将细胞重悬至1×10⁶；

（5）在Transwell小室的下室中加入600μl含10% FBS的DMEM培养基，上室分别加入100ul对照组和实验组细胞重悬液；

（6）将Transwell小室置于恒温细胞培养箱中培养24h；

（7）培养结束后，取出Transwell小室，使用蘸有PBS的棉签擦洗上室，去除Matrigel胶；

（8）将小室放入到甲醇中，固定20min；

（9）使用5%的结晶紫染色20min，使用PBS进行清洗；

（10）使用倒置显微镜进行观察和拍照。

实施例4得到的结果如图4所示，从图中可以看出，YYA-02的添加能够显著的抑制CD133+的肝癌干细胞的迁移和侵袭。

综合实施例1-实施例4可以得出，小分子抑制剂YYA-02能够有效的杀死肝癌细胞，并且能够有效的抑制肝癌干细胞的迁移和侵袭。

本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。