一种基于mspd提取联合fesi-mcds-mekc在线测定呋喃香豆素含量的方法
阅读说明：本技术 一种基于mspd提取联合fesi-mcds-mekc在线测定呋喃香豆素含量的方法 (Method for on-line determination of furocoumarin content based on MSPD extraction combined with FESI-MCDS-MEKC ) 是由 楚楚 刘彩婧 连琳敏 杨斐 童胜强 颜继忠 于 2020-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于MSPD提取联合FESI-MCDS-MEKC在线测定呋喃香豆素含量的方法,包括如下步骤：将待测样品与吸附剂混合,粉碎后获得混合粉末,将混合粉末用固相萃取柱进行洗脱,收集流出液后挥干溶剂得到提取物；分别对毛细管和提取物进行预处理,再基于FESI-MCDS-MEKC进行电泳分析得到提取物中呋喃香豆素的峰面积,将峰面积代入到相应的标准曲线中得到待测样品中呋喃香豆素含量。该方法操作简便、分析时间短、分离效率高而且准确可靠,重现性好,富集倍数达到302倍,可准确测定待测样品中羌活醇、异欧前胡素和欧前胡素的含量。(The invention discloses a method for on-line determination of furocoumarin content based on MSPD extraction combined with FESI-MCDS-MEKC, which comprises the following steps: mixing a sample to be detected with an adsorbent, crushing to obtain mixed powder, eluting the mixed powder by using a solid phase extraction column, collecting effluent liquid, and volatilizing a solvent to obtain an extract; respectively preprocessing the capillary and the extract, performing electrophoretic analysis based on FESI-MCDS-MEKC to obtain the peak area of furocoumarin in the extract, and substituting the peak area into a corresponding standard curve to obtain the furocoumarin content in the sample to be detected. The method has the advantages of simple operation, short analysis time, high separation efficiency, accuracy, reliability, good reproducibility, and enrichment multiple up to 302 times, and can accurately determine the contents of Notopterygii rhizoma alcohol, isoimperatorin and imperatorin in a sample to be tested.)
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种基于MSPD提取联合FESI-MCDS-MEKC在线测定呋喃香豆素含量的方法。
背景技术
呋喃香豆素是一类存在于植物、动物以及微生物代谢产物中的含苯并α-吡喃酮结构的内酯化合物，具有镇痛消炎、抗微生物，抗惊厥，抗癌等多种生物活性，在医药行业也有广泛的应用，但它们所显示的光毒性也受到学者们的广泛关注。
在紫外光的照射下，微量的呋喃香豆素可能会造成皮肤的灼伤，即使没有紫外光的照射，高剂量的呋喃香豆素对小鼠的不同组织均显示出了毒性。因此，在中国化妆品行业规范中，呋喃香豆素被列为禁用物质。但在许多所谓的天然美白产品中，仍有报道检出其含有呋喃香豆素，这对消费者来说，存在着极大的安全隐患。因此，开发一种快速、低成本、绿色的分析方法，对于监控化妆品中的微量呋喃香豆素尤其重要。
欧前胡素和异欧前胡素，羌活醇等均是典型的呋喃香豆素类成分。尤其欧前胡素和异欧前胡素，作为白芷中的主要成分，时常有可能被添加进入天然美白产品中。现在常用的香豆素类测定方法有薄层色谱(TLC)法、高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法等，但这些方法材料昂贵，而且经常需要大量的有机试剂和繁琐的操作步骤。
毛细管电泳色谱(CE)法具有高分辨率、低溶剂消耗、操作简便等优点，但对中性物质的检测灵敏度低。为了克服这一缺点，一种方法是采取CE的在线富集技术，另一种则是采取有效的样品预处理手段(离线富集)。
中性物质在电解液中不带电，不能在常规的毛细管区带电泳(CZE)模式中被分离，是毛细管电泳分离的难题。胶束电动毛细管色谱技术(MEKC)是CE的另一种模式，它通过在背景缓冲液(BGE)中加入胶束完成了中性分析物的分离测定。但是中药成分复杂，含量低微，香豆素类、皂苷类、萜类等中性物质的CE定量分析仍然受到极大限制。为了提高中性物质的检测灵敏度，基于MEKC的在线富集方法逐渐发展起来，如吹扫技术(Sweeping)、场放大进样-反向胶束迁移技术(FESI-RMM)和胶束环糊精堆积技术(MCDS)等。
FESI是在电动进样的情况下通过其自身的电泳迁移率将低电导率样品溶液注入毛细管中，从而增加进样量实现富集的方法。它被报道和RMM联用，用来富集中性物质。
MCDS-MEKC是由Quirino提出的一种新型在线富集技术，优点是不需要复杂的样品前处理过程。它是先在毛细管中充满含有胶束的背景缓冲液，然后分别进环糊精与含样品的胶束溶液，通过胶束与环糊精的结合作用来逆转待测分析物的有效迁移率，使分析物在样品区带与环糊精区带边界堆积。同样也是一种有效的中性物质在线富集技术。为了进一步提高CE检测中性物质的灵敏度，在反向迁移胶束电动色谱模式下将场放大进样和胶束环糊精堆积联用，并对分离和富集条件进行优化，期望建立一种简便、重现性好、绿色环保的测定中性物质的方法。
然而，这些方法的富集倍数大多只有几倍-几十倍，其灵敏度仍有待提高。
发明内容
本发明提供了一种基于MSPD提取联合FESI-MCDS-MEKC在线测定呋喃香豆素含量的方法，以分子筛为吸附剂，将基质固相分散萃取(MSPD)和场放大样品堆积(FESI)-胶束环糊精堆积反向迁移胶束(MCDS-MEKC)结合用于测定复杂基质中微量呋喃香豆素类化合物，进一步提高了毛细管电泳色谱的检测灵敏度，可分离性质接近的羌活醇、异欧前胡素或欧前胡素。
一种基于MSPD提取联合FESI-MCDS-MEKC在线测定呋喃香豆素含量的方法，包括如下步骤：
将待测样品与吸附剂混合，粉碎后获得混合粉末，将混合粉末用固相萃取柱进行洗脱，收集流出液后挥干溶剂得到提取物；
分别对毛细管和提取物进行预处理，再基于FESI-MCDS-MEKC进行电泳分析得到提取物中呋喃香豆素的峰面积，将峰面积代入到相应的标准曲线中得到待测样品中呋喃香豆素含量。
所述的吸附剂为分子筛；优选为分子筛KIT-6，KIT-6作为吸附剂时，异欧前胡素和欧前胡素的提取效果最好。
本发明所述的在线测定呋喃香豆素含量的方法是一种基质固相分散萃取(MSPD)结合场放大样品堆积(FESI)-胶束环糊精堆积反向迁移胶束(MCDS-MEKC)的联用技术来分析测定化妆品中微量光敏性呋喃香豆素类成分的方法。将基质固相分散萃取技术和场放大样品堆积联合胶束环糊精堆积反向迁移胶束技术结合，分子筛作为MSPD中的吸附剂与待测样品的目标分子吸附结合，使目标分子从复杂基质中分离出来，然后用适当溶剂洗脱得到含有目标分子的洗脱液，洗脱液随后采用FESI-MCDS-MEKC电泳富集模式进行分离检测。
基质固相分散萃取(MSPD)能够在破坏固体或半固体材料结构的同时选择性地提取目标分析物，不仅减少了样品的损失，也避免了液液萃取中使用大量有机溶剂、发生“乳化”现象和提取速度慢的问题。
所述的呋喃香豆素为羌活醇、异欧前胡素或欧前胡素。羌活醇、异欧前胡素或欧前胡素结构接近，物理性质也类似，常规的分离方法分离度低。
所述的待测样品与吸附剂的质量比为1：1.5～2.5。当吸附剂用量太少时，吸附不完全；而当吸附剂用量又太多时，又会导致待测样品难以被洗脱。
所述的粉碎为通过匀速研磨粉碎，所述的匀速研磨粉碎的时间为140～160s，此时样品与吸附剂已达到吸附平衡，再增加研磨时间，反而导致样品与吸附剂作用力过强，提取效率下降。
所述洗脱的洗脱剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或乙酸乙酯；甲醇的提取效率最好，所述洗脱的洗脱剂优选为甲醇。
所述洗脱剂的体积为，每25mg待测样品，所述洗脱剂的体积为400μL～600μL，此时已经足够把分析物洗脱下来，继续增加洗脱体积反而稀释了分析物，降低了提取效率。
对毛细管进行预处理，新毛细管柱在使用之前需在50mbar压力下，依次用NaOH(1mol/L,20min),NaOH(0.1mol/L,10min),纯水(10min)和缓冲液(5min)冲洗活化。
所述的提取物进行预处理为：提取物用20mmol/L十二烷基硫酸钠复溶得到样品基质为十二烷基硫酸钠的提取物溶液。
所述的电泳分析的条件为：
以包含80～120mmol/L十二烷基硫酸钠、5～15mmol/L磷酸二氢钠、40～60mmol/L磷酸和10％～40％甲醇作为缓冲液；先40～60mbar压力进环糊精溶液，再40～60mbar压力进纯水，最后-5～-10kV电压进样品基质为十二烷基硫酸钠的提取物溶液，分离电压为-15～-25kV，温度为20～30℃，检测波长为254nm。
所述的缓冲液中甲醇的含量为28～32％，此时三种分析物的峰才能完全分离，且响应值最高。
所述的环糊精溶液的进样时间为45～225s；所述的样品溶液的进样时间为160～200s。
综合考虑灵敏度和分离度，所述的环糊精溶液的进样时间优选为110～130s；所述的样品溶液的进样时间优选为140～160s。
所述的纯水的进样时间为1～3s。
所述环糊精为异丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、α-环糊精或β-环糊精中的任意一种。
所述标准曲线建立方法包括：将浓度为1.0～12.5μg/mL的羌活醇、异欧前胡素和欧前胡素的标准溶液分别进行所述电泳分析，再以电泳谱图中的峰面积为纵坐标、以浓度为横坐标分别绘制酸羌活醇、异欧前胡素和欧前胡素的标准曲线。
本发明相对现有技术，具有如下的优点：
1、本发明提出了一种将分子筛作为吸附剂结合基质固相分散萃取技术提取香豆素的方法。相对于常规的提取方法，该法不仅简单、省时、成本低，而且有机溶剂用量少，减少了对环境的污染和人体健康的损害。加上分子筛具有比表面积大、有序的孔径分布和良好的水热稳定性等优良性能，也大大提高了提取效率。
2、本发明将毛细管电泳在线富集技术(场放大样品堆积联合胶束环糊精堆积反向迁移胶束技术)用于分析香豆素，该方法操作简便、分析时间短、分离效率高而且准确可靠，重现性好，富集倍数达到302倍，相比高效液相色谱法更适用于复杂基质的中药成分分析也更加符合绿色化学的要求，可准确测定待测样品中羌活醇、异欧前胡素和欧前胡素的含量。
附图说明
图1为羌活醇、异欧前胡素和欧前胡素的结构式。
图2为实际样品电泳图，其中，2代表异欧前胡素，3代表欧前胡素。
图3为吸附剂种类的影响。
图4样品与吸附剂比例的影响。
图5为研磨时间的影响。
图6洗脱剂种类的影响。
图7洗脱剂体积的影响。
图8缓冲液中有机溶剂的影响，1代表羌活醇，2代表异欧前胡素，3代表欧前胡素。
图9环糊精进样时间的影响(标准品浓度为1μg/mL)，1代表羌活醇，2代表异欧前胡素，3代表欧前胡素。
图10样品进样时间的影响(标准品浓度为1μg/mL)，1代表羌活醇，2代表异欧前胡素，3代表欧前胡素；A为不同进样时间下的电泳图，B为不同进样时间下的各分析物的峰面积。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例所用试剂或材料市售可得：
固相萃取柱为1mL柱管，材质为PP，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
小柱筛板规格为1mL，材质为PE，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
分子筛KIT-6，优选购自南京吉仓纳米科技股份有限公司。
分子筛SBA-15，优选购自南京吉仓纳米科技股份有限公司。
氟罗里土，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
Al2O3，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
硅胶mSiO2·nH2O，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
实施例1
将白芷粉末25mg与50mg分子筛KIT-6混合，研磨150s后获得混合粉末，将混合粉末用固相萃取柱进行洗脱，洗脱剂为500μL甲醇，洗脱结束后，将所得洗脱液置于快速溶剂挥发仪中挥干甲醇得到提取物。
对毛细管进行预处理，新毛细管柱在使用之前需在50mbar压力下，依次用NaOH(1mol/L,20min),NaOH(0.1mol/L,10min),纯水(10min)和缓冲液(5min)冲洗活化；
提取物用20mmol/L十二烷基硫酸钠复溶，得样品基质为十二烷基硫酸钠的提取物溶液。
再基于FESI-MCDS-MEKC进行电泳分析得到提取液(提取物)中呋喃香豆素的峰面积，将峰面积代入到相应的标准曲线中得到待测样品中呋喃香豆素含量，标准曲线的建立为实施例4。
电泳条件为：缓冲液：100mmol/L SDS,10mmol/L磷酸二氢钠,50mmol/L磷酸和30％甲醇；环糊精溶液：50mmol/L羟丙基-β-环糊精，溶剂为100mmol/L磷酸；样品基质：20mmol/LSDS；进样程序：50mbar压力下，依次进环糊精溶液120s和纯水2s；-8kv电压下，进样品溶液150s。检测温度：25℃；检测电压：-20kv；检测波长：254nm。
羌活醇、异欧前胡素和欧前胡素的结构式如图1所示。
MSPD-FESI-MCDS-MEKC优选条件下的白芷的电泳谱图如图2所示，结果表明，3种有效成分可以完全分离，确定了该提取方法和检测条件的可实施性。其中，羌活醇未检出，2代表异欧前胡素，3代表欧前胡素。
实施例2、MSPD条件优化
(1)吸附剂种类的影响
参照实施例1的方法，以白芷为实际样品，考察分子筛对MSPD富集效果的影响。
考察了两种分子筛KIT-6和SPA-16与其他传统吸附剂氟罗里硅土、氧化铝和硅胶对MSPD提取效率的影响，结果如图3所示。结果表明，KIT-6作为吸附剂时，两种目标分析物的提取效果最好。这可能由于它的3D立体结构增大了比表面积，样品能与吸附剂更充分地接触。因此，选择KIT-6为吸附剂。
(2)样品与吸附剂比例的影响
参照实施例1的方法，以白芷为实际样品，考察样品与吸附剂比例对MSPD富集效果的因素的影响。
样品与吸附剂比例是影响提取效率的重要因素之一。本文考察了样品用量为25mg时，样品与吸附剂比例分别为1:1、1:2、1:3和2:1时异欧前胡素和欧前胡素的提取效果，结果如图4所示。由图可知，当样品与吸附剂的用量比为1:2时，两种分析物的峰面积最高。这可能是因为当样品与吸附剂比例为1:1和2:1时，吸附剂用量太少，吸附不完全；而当此比例为1:3时，吸附剂用量又太多，导致分析物难以被洗脱。因此，实验选择样品与吸附剂用量比为1:2。
(3)研磨时间的影响
参照实施例1的方法，以白芷为实际样品，考察研磨时间对MSPD富集效果的因素的影响。
MSPD的基本操作之一是将样品与吸附剂混合研磨，破坏样品组织结构，从而使其完全分散于吸附剂表面，增加样品与洗脱剂的接触面，提高提取效率。因此，本研究考察了研磨时间分别为90、120、150和180s对提取效率的影响，结果如图5所示。由图可知，研磨时间从90s增加到180s，两种分析物的峰面积先增加再减小，当研磨时间为150s时，分析物峰面积达到最大。这说明当研磨时间为150s时，样品与吸附剂已达到吸附平衡，再增加研磨时间，反而导致样品与吸附剂作用力过强，提取效率下降。综上，选择150s为最终的研磨时间。
(4)洗脱剂种类的影响
参照实施例1的方法，以白芷为实际样品，考察洗脱剂对MSPD富集效果的因素的影响。
合适的洗脱剂应该满足溶解目标分析物但把基质杂质留在填料中的要求。本实验考察了洗脱剂分别为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯时目标分析物的峰面积，结果如图6所示。由图可知，甲醇作为洗脱剂时，两种分析物的峰面积最大，提取效率最好。这可能是由于异欧前胡素和欧前胡素具有内酯结构，极性偏小，与甲醇极性最为接近。根据相似相溶原理，甲醇的提取效率最好。因此，实验选择甲醇作为洗脱剂，并应用于下一步条件优化中。
(5)洗脱剂体积的影响
参照实施例1的方法，以白芷为实际样品，考察洗脱剂体积对MSPD富集效果的因素的影响。
本实验研究了甲醇体积分别为250、500、750和1000μL时，MSPD对目标分析物的提取效率，结果如图7所示。结果表明，洗脱体积从250μL增加到500μL时，两种分析物的峰面积增加；洗脱体积继续从500μL增加至1000μL时，峰面积减小。这说明500μL的甲醇已经足够把分析物洗脱下来，继续增加洗脱体积反而稀释了分析物，降低了提取效率。因此，实验选择500μL作为最终的洗脱体积。
实施例3、FESI-MCDS-MEKC条件优化
(1)缓冲液中有机溶剂的影响
参照实施例1的方法，标准品浓度为1μg/mL，以白芷为实际样品，考察缓冲液中有机溶剂对MSPD富集效果的因素的影响。
缓冲液(BGE)中的有机溶剂会影响电渗流大小，从而间接影响分离过程。本实验考察了甲醇含量为0％、10％、20％和30％时三种分析物的出峰情况，结果如图8所示。由图可知，当缓冲液中没有添加甲醇时，三种分析物的峰无法分开。当甲醇含量为10％和20％时，羌活醇和异欧前胡素的峰没有完全分开。只有当甲醇含量为30％时，三种分析物的峰才能完全分离，且响应值最高。因此，实验选择30％甲醇作为缓冲液中的有机添加剂。
(2)环糊精注射时间的影响
参照实施例1的方法，标准品浓度为1μg/mL，以白芷为实际样品，考察环糊精注射时间对MSPD富集效果的因素的影响。
本实验考察了样品进样时间固定为150s，环糊精进样时间分别为90、120、150和180s时三种分析物的出峰情况。结果如图9所示，当环糊精进样时间从90s增加到120s时，响应值变高。这可能是由于环糊精量增加使分析物更容易释放出来，富集效果更好。但随着环糊精进样时间的进一步增加，峰高没有明显增加反而导致羌活醇和异欧前胡素峰分离度的降低。考虑到灵敏度和分离度，实验选择了进环糊精溶液120s和样品溶液150s(进样时间比为4:5)的条件。
(3)样品溶液进样时间的影响
参照实施例1的方法，标准品浓度为1μg/mL，以白芷为实际样品，考察样品溶液进样时间对MSPD富集效果的因素的影响。
增加进样时间是提高富集效果的最直接方法，但是进样时间过长会导致峰展宽、分离度变差。因此，本实验在最佳进样比(环糊精：样品＝4:5)条件下，考察了环糊精进样时间为72、96、120和180s，样品进样时间对应为90、120、150和180s时分析物的出峰情况，结果如图10所示，其中图A和图B分别为不同进样时间下的电泳图和各分析物的峰面积。结果表明，当进样时间从90s增加到150s时，三种分析物的峰面积增加。当进样时间为150s时，三种分析物响应值最高，且各峰分离完全。综上，确定150s为最佳样品进样时间。
实施例4、方法学考察
方法的线性、检出限、重现性和富集倍数
取适量1mg/mL的混合对照品溶液，准确配制羌活醇、异欧前胡素和欧前胡素浓度分别为0.1、1.0、3.0、5.0、7.5、10.0μg/mL的混标溶液，在实施例1的条件下平行测定三次。以三种香豆素类化合物的峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标作标准曲线。结果表明，在0.1-10μg/mL之间，三种目标分析物线性关系良好。将1μg/mL的混标溶液分别一天之内连续进样6次和连续3天每天进样3次评价日内精密度和日间精密度，结果得到的峰面积RSD均小于3.31％，说明该方法重现性好。实验结果见表1。
表1
MSPD-FESI-MCDS-MEKC法的富集倍数计算公式为：
常规进样条件：缓冲液为100mmol/L SDS、50mmol/L H3PO4和30％甲醇,50mbar压力下进50μg/mL的异欧前胡素和欧前胡素的混标(溶剂为缓冲液)5s。计算得出此方法对异欧前胡素和欧前胡素的富集倍数分别为302和283倍，有效地提高了CE对这两种香豆素类化合物的检测灵敏度。
实施例5实际样品的测定
采用上述实施例1建立的方法对白芷样品(购于浙江杭州武林大药房)进行含量测定，羌活醇未检出，欧前胡素为1.12mg/g，异欧前胡素为0.47mg/g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。