阅读说明：本技术 一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的hplc检测方法 (HPLC (high performance liquid chromatography) detection method for simultaneously determining different characteristic components in acne-removing composition ) 是由 刘林峰 吴知情 于 2020-11-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法,所述HPLC检测方法包括以下步骤：将祛痘组合物配制成样品,之后经HPLC检测梯度洗脱,得到检测结果,之后利用标准曲线计算特征组分含量；所述特征成分包括绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷或大黄素中任意一种或至少两种的组合。本发明提供的检测方法快速、灵敏、准确、成本低,解决了现有的仪器检测过程中无法同时检测分析祛痘组合物中单味药材和复配组合物中多种特征成分的分析方法的问题。(The invention provides an HPLC detection method for simultaneously determining different characteristic components in an acne-removing composition, which comprises the following steps: preparing the acne-removing composition into a sample, detecting by HPLC (high performance liquid chromatography) for gradient elution to obtain a detection result, and calculating the content of the characteristic component by using a standard curve; the characteristic component comprises one or the combination of at least two of chlorogenic acid, caffeic acid, gentiopicroside, berberine, baicalin or emodin. The detection method provided by the invention is rapid, sensitive and accurate, has low cost, and solves the problem that the existing instrument cannot simultaneously detect and analyze the analysis method of single medicinal material in the acne-removing composition and various characteristic components in the compound composition.)

一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法

技术领域

本发明属于化妆品原料检测领域，具体涉及一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法，尤其涉及一种快速灵敏的同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法。

背景技术

痤疮是青春期的多发症，也是皮肤科临床常见病、多发病之一。本病发病原因复杂，西医尚无特效疗法。金银花、蒲公英、大黄、黄柏等具有清热解毒燥湿之功，这与现代医学对痤疮丙酸杆菌抑菌作用的研究中大黄、黄柏等痤疮丙酸杆菌高度敏感的结果相吻合。

金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩、大黄等是常见的具有抗菌作用的提取物，由这些提取物按一定比例复配的祛痘组合物，作为核心功效成分应用于化妆品中为市场喜爱。但祛痘组合物药味多，成分复杂，在品控时单一的化学成分测定很难反映整个复方的质量优劣和控制监测中药复方品质。目前，对祛痘组合物质量控制的研究仍处于相对匮乏的状态。HPLC-DAD法的发展，为同时测定复杂中药复方中的多种成分提供了技术基础，中药质量标志物(quality marker)的提出，为中药的有效和质量控制提供了理论基础。

分析方法的建立有助于加快祛痘组合物有效成分的进一步研究，也为今后祛痘组合物相关产品的质量控制提供了技术支持。但是由于祛痘组合物中的成分复杂，分离难度较大，现有的检测方法不能很好的分离大多数功效特征成分以及其他杂质。因此精度不高，实际操作过程中容易出现差错。

CN110646537A公开了一种基于HPLC波长切换技术同时测定三黄片中多种成分含量的方法，涉及药品的检测方法技术领域，按照如下步骤同时对黄芩苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚7种成分进行定性和定量分析：混合对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；高效液相色谱分离检测；供试品定性和定量分析。利用HPLC波长切换技术，黄芩苷波长切换在280nm处检测，盐酸小檗碱长切换在264nm处检测，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚波长切换在254nm处检测；洗脱条件：流动相A乙腈，流动相B磷酸水溶液，0-10min：15％A，85％B；20min：25％A，75％B；30min：40％A，60％B；42min：55％A，45％B；50-60min：80％A，20％B。操作简便，检测灵敏度高，测定结果更加准确。但其对于其他祛痘组合物成分无法检测。

CN101324546公开了一种HPLC法同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法，可有效解决以绿原酸和咖啡酸作为指标性成分，同时进行含量测定，对蒲公英制剂的质量标准奠定基础解决的问题，实现本发明的具体技术方案是：分别制备供试品溶液和对照品溶液，用RP-HPLC法，梯度洗脱，流动相采用甲醇-磷酸水，测定绿原酸、咖啡酸含量，该发明方法简便、可靠、迅速，灵敏度高，重现性好，回收率高，以绿原酸和咖啡酸作为指标性成分，为蒲公英及其制剂质量标准的制定奠定了基础，提供了更科学的依据。但同样对于龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷、大黄素等成分并无检测效果。

CN104897787B公开了一种HPLC法同时测定牛黄宁宫片中大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱六种活性成分含量的方法，该方法采用的色谱条件如下：色谱柱：TC-C18(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长：280nm；流动相：甲醇、0.05％磷酸；梯度洗脱：0-35min：10％-80％甲醇；35-50min：80％甲醇；50-60min：80％-10％甲醇；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。在此色谱条件下，色谱峰分离良好，大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系。该方法简单、快速、准确、重现性好，可为全面评价和控制牛黄宁宫片提供质量依据。

目前尚无一种能够有效分离、检测祛痘组合物中的成分的HPLC检测方法，因此，如何提供一种快速、灵敏的祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法，成为了亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的高效液相色谱(HPLC)检测方法，尤其提供一种快速灵敏的同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法。本发明提供的检测方法快速、灵敏、准确、成本低，解决了现有的仪器检测过程中无法同时检测分析祛痘组合物中单味药材和复配组合物中多种特征成分的分析方法的问题。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法，所述HPLC检测方法包括以下步骤：将祛痘组合物配制成样品，之后经HPLC检测梯度洗脱，得到检测结果，之后利用标准曲线计算特征组分含量。

所述特征成分包括绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷或大黄素中任意一种或至少两种的组合，例如绿原酸和咖啡酸的组合、龙胆苦苷和黄芩苷的组合或大黄素和绿原酸的组合等，但并不仅限于所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用。

上述检测方法能一次同时检测样品中绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素的含量，检测方法快速、灵敏、准确、成本低。

优选地，所述祛痘组合物可以从市场上购买，也可通过将金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩和大黄复配得到。

优选地，所述梯度洗脱的溶剂为甲醇和磷酸超纯水溶液。

优选地，所述磷酸超纯水溶液的质量分数为0.03-0.08％，例如0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％或0.08％等，但并不仅限于所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

优选地，所述梯度洗脱按以下程序进行：第0min时洗脱液中甲醇的体积占比为10％，磷酸超纯水溶液的体积占比为90％，之后匀速变化至第6min时甲醇的体积占比为25％，磷酸超纯水溶液的体积占比为75％，之后匀速变化至第15min时甲醇的体积占比为30％，磷酸超纯水溶液的体积占比为70％，之后匀速变化至第21min时甲醇的体积占比为40％，磷酸超纯水溶液的体积占比为60％，之后匀速变化至第27min时甲醇的体积占比为55％，磷酸超纯水溶液的体积占比为45％，最后匀速变化至第40min时甲醇的体积占比为90％，磷酸超纯水溶液的体积占比为10％。

上述特定梯度洗脱程序能将祛痘组合物中的绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素完全分离，便于检测。

优选地，所述将祛痘组合物配制成样品包括以下步骤：将祛痘组合物用纯化水回流提取，之后过滤，取滤液经大孔吸附树脂吸附洗脱，之后蒸发洗脱液、浓缩，用甲醇定容，过膜，得到所述样品。

优选地，所述回流的温度为75-85℃。

优选地，所述回流的时间为50-70min。

其中，温度可以是75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃等，时间可以是50min、52min、54min、56min、58min、60min、62min、64min、66min、68min或70min等，但并不仅限于所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

上述特定条件的组合可使祛痘组合物中的绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素被完全提取，提高检测的准确度。

优选地，所述HPLC采用Agilent InfintyLab Poroshell 120SB-C₁₈色谱柱，所述色谱柱的规格为150mm×4.60mm，填料粒径为2.8μm。

优选地，所述HPLC检测的柱温为35-45℃。

优选地，所述梯度洗脱的流速为0.8-1.2mL/min。

优选地，所述HPLC检测的进样体积为8-12μL。

优选地，所述HPLC检测的波长为260-300nm。

其中，柱温可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃等，流速可以是0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min或1.2mL/min等、进样体积可以是8μL、9μL、10μL、11μL或12μL等，波长可以是260nm、270nm、280nm、290nm或300nm等，但并不仅限于所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

上述特定条件的组合可使祛痘组合物中的绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素被完全分离和检测。

优选地，所述标准曲线由以下步骤得到：取特征成分的标准样品用甲醇溶解稀释，之后按照所述梯度洗脱程序进行HPLC检测，根据检测结果计算标准曲线。

利用上述标准曲线可对检测结果进行定量分析，为进一步研究和开发金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩和大黄等药材原料的天然的成分药理活性和谱效关系提供有力的实验数据。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法快速、灵敏、准确、成本低，精密度RSD达到3％以内，显示了良好的精密度；通过特定洗脱程序，能将痘组合物中的绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素完全分离，便于检测；通过优化检测条件，可使祛痘组合物中的绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素被完全分离和检测；利用标准曲线可对检测结果进行定量分析，为进一步研究和开发金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩和大黄等药材原料的天然的成分药理活性和谱效关系提供有力的实验数据。

附图说明

图1是金银花提取物、绿原酸标准品溶液和混合标准溶液的HPLC检测结果，其中1-绿原酸，2-咖啡酸，3-龙胆苦苷，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-大黄素；

图2是蒲公英提取物、咖啡酸标准品溶液和混合标准溶液的HPLC检测结果，其中1-绿原酸，2-咖啡酸，3-龙胆苦苷，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-大黄素；

图3是龙胆草提取物、龙胆苦苷标准品溶液和混合标准溶液的HPLC检测结果，其中1-绿原酸，2-咖啡酸，3-龙胆苦苷，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-大黄素；

图4是黄柏提取物、小檗碱标准品溶液和混合标准溶液的HPLC检测结果，其中1-绿原酸，2-咖啡酸，3-龙胆苦苷，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-大黄素；

图5是黄芩提取物、黄芩苷标准品溶液和混合标准溶液的HPLC检测结果，其中1-绿原酸，2-咖啡酸，3-龙胆苦苷，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-大黄素；

图6是大黄花提取物、大黄素标准品溶液和混合标准溶液的HPLC检测结果，其中1-绿原酸，2-咖啡酸，3-龙胆苦苷，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-大黄素；

图7是实施例1提供的祛痘组合物和混合标准溶液的HPLC检测结果，其中1-绿原酸，2-咖啡酸，3-龙胆苦苷，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-大黄素。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下制备例与实施例中，HPLC购自于美国安捷伦公司，型号为1260型(检测器为DAD检测器)；

色谱柱为Agilent InfintyLab Poroshell 120SB-C₁₈色谱柱，所述色谱柱的规格为150mm×4.60mm，填料粒径为2.8μm。

制备例1

分别取10.0mg 6种特征组分标准品(绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素)分别用甲醇溶解，并用甲醇定容至100mL得到各特征组分标准品溶液；每种标准品溶液各吸取1mL混合，并用甲醇定容至10mL，混合均匀，得到混合标准溶液。

制备例2

分别取金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩和大黄与纯化水以料液比为1g:10mL的比例下在80℃下回流60min，之后过滤，滤液用70％乙醇洗脱2BV，流速4BV/h，收集洗脱液，低温旋转蒸发浓缩，用甲醇定容至2mL，用0.45μL有机滤膜过膜，得到金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩和大黄提取物。

实施例1

本实施例提供了一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法，其中祛痘组合物以重量份数为金银花30份、蒲公英30份、龙胆草10份、黄柏10份、黄芩10份和大黄20份复配而成。

将上述祛痘组合物和纯化水以1g:10mL的料液比在85℃下回流50min，之后过滤，滤液用70％乙醇洗脱2BV，流速4BV/h，收集洗脱液，低温旋转蒸发浓缩，用甲醇定容至2mL，用0.45μL有机滤膜过膜，之后在柱温40℃、洗脱流速1.0mL/min、检测波长280nm、进样体积10μL的条件下进行HPLC检测，梯度洗脱程序如下：第0min时洗脱液中甲醇的体积占比为10％，磷酸超纯水溶液的体积占比为90％，之后匀速变化至第6min时甲醇的体积占比为25％，磷酸超纯水溶液的体积占比为75％，之后匀速变化至第15min时甲醇的体积占比为30％，磷酸超纯水溶液的体积占比为70％，之后匀速变化至第21min时甲醇的体积占比为40％，磷酸超纯水溶液的体积占比为60％，之后匀速变化至第27min时甲醇的体积占比为55％，磷酸超纯水溶液的体积占比为45％，最后匀速变化至第40min时甲醇的体积占比为90％，磷酸超纯水溶液的体积占比为10％。

标准曲线的制作：

分别取绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素的标准样品10mg用甲醇溶解定容至100mL，按实施例1中的检测条件分别进样5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，根据检测结果计算标准曲线，以浓度为横坐标x轴，峰面积为y轴，结果如表1：

表1标准曲线结果

从表1数据可以看出本发明提供的检测方法对于绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素的检测在浓度范围内呈现良好的线性关系。

标准品检测：

将制备例1中的各特征组分标准品溶液、混合标准溶液和制备例2中的金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩和大黄提取物根据实施例1中的HPLC检测条件进行HPLC检测，检测结果见图1-图6，其中1-绿原酸，2-咖啡酸，3-龙胆苦苷，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-大黄素，从图中可以看出本发明提供的检测方法对于同时检测绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素具有较好的分离效果。

精密度分析：

分别配制6种特征成分标准品，分别在上述色谱条件下同日内5个不同时间点以实施例1提供的分析方法进行进样分析，由测得面积计算标准偏差和相对标准偏差(RSD)，获得日内精密度值，结果如表2：

表2精密度分析结果

从表中可得，6种特征成分标准品的精密度RSD都在3％内，表明本发明提供的检测方法精密度良好。

重复性分析：

根据实施例1提供的检测方法，用同一批中药材复配的祛痘组合物制备6份祛痘组合物提取液在上述色谱条件下进样，由测得6种特征成分面积计算相对标准偏差(RSD)，分析重复性，结果如表3：

表3重复性分析结果

从表中得知6种特征成分标准品的重复性RSD均在2.76％之内，表明本发明提供的检测方法重复性良好。

稳定性分析：

取制备例1提供的的混合标准溶液，25℃静置，分别于第0，2，4，6，8，12，24h进样，由测得各特征成分面积分析溶液稳定性，结果如表4：

表4稳定性分析结果

由表4可知，25℃静置下，6种特征成分标准品的稳定性RSD均≤2.07％，表明本发明提供的检测方法稳定性良好。

回收率分析：

称取祛痘组合物，配方同实施例1，按实施例1方法制备供试溶液，加入1μL制备例1提供的混合标准溶液，在实施例1提供的检测条件下进样，重复6次，分析样品回收率，结果如表5：

表5回收率分析结果

由表5可知，6种特征成分标准品在本发明提供的检测方法下加标回收率为95％～105％，到达色谱分析要求，说明本发明提供的检测方法结果可靠。

实施例检测：

将制备例1中的混合标准溶液、制备例2中的金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩、大黄提取物以实施例1中的检测方法进行检测，并收集实施例1的检测结果，结果如图7和表6：

表6特征成分含量表

上述结果显示了本发明提供的检测方法能够对祛痘组合物中的绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素充分分离并定量检测。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的同时测定祛痘组合物中不同特征成分的HPLC检测方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。