一种非抗生素类抗菌组合物及其应用
阅读说明：本技术 一种非抗生素类抗菌组合物及其应用 (Non-antibiotic antibacterial composition and application thereof ) 是由 丁鑫 余迎宵 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种非抗生素类抗菌组合物及其应用。本发明将金诺芬与喷他脒这两种非抗生素类药物联用作为抗菌药物,为抗菌药物的研发提供一个全新的思路。本发明公开了金诺芬与喷他脒联合使用能够使药物的抗菌性能起到协同增效的效果,其不仅降低了金诺芬与喷他脒对细菌和真菌的最低抑菌浓度,而且对革兰氏阴性菌、真菌的抑制增殖和消杀效果十分显著。另外,该非抗生素类抗菌组合物对多种临床常见的细菌和真菌都具有抑制效果,相比于金诺芬和喷他脒单独用药,其广谱抗菌活性得到了提高。(The invention discloses a non-antibiotic antibacterial composition and application thereof. The invention combines two non-antibiotic medicines of auranofin and pentamidine as antibacterial medicines, and provides a brand new thought for the research and development of the antibacterial medicines. The invention discloses that the combination of auranofin and pentamidine can make the antibacterial performance of the medicine play a synergistic effect, which not only reduces the minimum inhibitory concentration of auranofin and pentamidine to bacteria and fungi, but also has very obvious inhibition, proliferation and killing effects to gram-negative bacteria and fungi. In addition, the non-antibiotic antibacterial composition has an inhibiting effect on various clinically common bacteria and fungi, and compared with single application of auranofin and pentamidine, the broad-spectrum antibacterial activity of the composition is improved.)
技术领域
本发明涉及抗菌医药技术领域，具体地，涉及一种非抗生素类抗菌组合物的应用。
背景技术
近年来，临床发现的多重耐药菌日益增多，而且细菌对各种抗生素的耐药能力也不断增强。如今，细菌的抗生素耐药性已经成为了一个十分严重的全球性问题，即使是作为多重耐药革兰氏阴性菌的最后防线的抗生素多粘菌素，其耐药菌株也已被发现，而且质粒传播机制导致耐药性传播迅速，这意味着最后一道防线即将被突破，也预示着真正的泛耐药感染的出现。因此，我们急需开发有效的新型抗菌药物，特别是针对革兰氏阴性菌的抗菌药物。然而，研发新型抗生素不仅花费巨大而且耗时漫长，难以应对快速扩散和传播的细菌耐药性。“老药新用”是一种具有巨大潜力的解决细菌耐药性的方案，但是已发展的“老药新用”抗菌药物通常是将已上市的非抗菌药物进行简单的“再利用”，其抗菌性能通常不够理想或者抗菌谱较窄。
金诺芬(CAS登记号：34031-32-8)是一种已上市的含金口服药，主要用于类风湿性关节炎的治疗。它可以改善关节炎的症状，包括关节疼痛、疼痛、肿胀等。近年来的研究表明，金诺芬在临床可用浓度下具有一定的抑制细胞壁、DNA和细菌蛋白的合成作用。Thangamani等人通过研究发现，金诺芬能够抑制细菌蛋白质合成的能力导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)产生的毒素显着减少。(Thangamani S.et al.Antibacterialactivity and mechanism of action of auranofin against multi-drug resistantbacterial pathogens[J].Scientific Reports,2016,6:22571.)。但目前几乎没有关于金诺芬对革兰氏阴性菌或真菌的抗菌活性研究。
喷他脒(CAS登记号：140-64-7)是一种已上市的抗寄生虫药物，主要用于治疗非洲锥虫病、利什曼病、巴贝斯病，以及预防和治疗免疫功能低下者的肺囊虫肺炎等。
“老药新用”是对药物新的治疗应用的认可，可以减少药物成本，有效缩短药物研发和审批时间，比新药研发更容易实现。金诺芬和喷他脒都是已经上市的药物，在研发其新应用时可以更快地进入临床试验阶段，对“老药新用”的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种非抗生素类抗菌组合物。
本发明的第二个目的在于提供一种非抗生素类抗菌组合物在制备抗菌药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种非抗生素类抗菌组合物，由金诺芬与喷他脒组成。
本发明创造性地将非抗生素类抗寄生虫药物喷他脒和具有一定抗菌能力的非抗生素类抗风湿药物金诺芬联合使用。本发明公开的金诺芬与喷他脒联合使用对抗菌作用起到协同增效的效果，且其组合物具有良好的广谱抗菌活性，也为抗菌药物的研发提供一个全新的思路。
优选地，所述金诺芬的浓度为0.03～62.5μg/mL；所述喷他脒的浓度为0.25～62.5μg/mL。
本发明还提供了上述非抗生素类抗菌组合物在制备抗菌药物中的应用。
优选地，所述菌为细菌和/或真菌。
进一优选地，所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌；
更优选地，所述革兰氏阴性菌为敏感型革兰氏阴性菌和/或耐药型革兰氏阴性菌。
更优选地，所述敏感型革兰氏阴性菌为敏感型大肠杆菌、敏感型鲍曼不动杆菌以及产气肠杆菌中的任意一种或多种。
更优选地，所述耐药型革兰氏阴性菌为耐药型大肠杆菌、耐药型鲍曼不动杆菌以及肺炎杆菌中的任意一种或多种。
更优选地，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。
更优选地，所述真菌为白色念球菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地将喷他脒和具有一定抗菌能力的非抗生素类抗风湿药物金诺芬联合使用，发现金诺芬与喷他脒联合使用对抗菌作用起到协同增效的效果，不仅降低了金诺芬和喷他脒的最低抑菌浓度(MIC)，提高了金药物对革兰氏阴性菌、真菌的抑制增殖作用，还提高了对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌的消杀作用。同时，该药物组合物对多种临床常见的细菌和真菌都具有抑制效果，相比于金诺芬，药物组合物的广谱抗菌性得到了提高。同时本发明提出将金诺芬与喷他脒这两种非抗生素类药物联用作为抗菌药物，也为抗菌药物的研发提供一个全新的思路。
附图说明
图1为96孔板加药示意图。
图2为棋盘法测试金诺芬与喷他脒联合用药对(a)敏感型革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.Coli)、鲍曼不动杆菌19606(A.baumannii 19606)、产气肠杆菌(E.Aerogenes)；(b)耐药型革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli-1)、鲍曼不动杆菌1789(A.baumannii-1789)、肺炎杆菌(K.pneumoniae-1)；(c)革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)；(d)临床分离的真菌白色念球菌(Candida albicans-1、Candida albicans-2)的协同抗菌作用。MIC：minimuminhibitory concentration，最低抑菌浓度；FICI：fractional inhibitoryconcentration index，部分抑菌浓度指数。色块颜色越深，表示细菌浓度越高，抗菌效果越差。
图3为不同浓度的喷他脒、金诺芬及组合给药对多重耐药鲍曼不动杆菌A.baumannii-1789的抑菌曲线。
图4为不同浓度的喷他脒、金诺芬及组合给药对多重耐药鲍曼不动杆菌A.baumannii-1789的杀菌动力学曲线。
图5为药物联用时，(a)喷他脒的浓度变化时的溶血性百分比(含250μg/mL金诺芬)；(b)金诺芬的浓度变化时的溶血性百分比(含250μg/mL喷他脒)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1棋盘法测定金诺芬与喷他脒联合用药对细菌的抑制作用
1.1药物与菌株
药物：金诺芬购自艾博抗上海贸易有限公司，羟乙磺酸喷他脒购自大连美仑生物技术有限公司。
菌株：敏感型大肠杆菌(E.Coli)、鲍曼不动杆菌(A.Baumannii 19606、A.baumannii 1789)、产气肠杆菌(E.Aerogenes)、金黄色葡萄球菌(S.Aureus)，以上细菌均从ATCC购买获；耐药型大肠杆菌(E.coli-1)、耐药型肺炎杆菌(K.pneumoniae-1)由中山大学医学院田国宝教授惠赠，白念球菌(Candida albicans-1、Candida albicans-2)由孙逸仙医院鲁莎教授惠赠。
本发明采用的药物与菌株的获得途径如上所述。
1.2实验方法
将1.1所述细菌接种至MHB培养基中，置于恒温摇床在37℃、150rpm条件下培养过夜。根据两种药物对各菌种MIC的不同，取单独用药MIC值为最高浓度，并依次用含10％DI的MHB培养液不断进行二倍稀释直至获得所需的一系列梯度浓度。每个菌株各取3个空白96孔板(见图1)，每个板H行与1列的孔加入含10％DI的MHB培养液50μL作为空白对照，其余孔从A行到G行按浓度梯度加入喷他脒药液50μL，从12列到2列按浓度梯度加入金诺芬药液50μL，最后每孔均加入100μL浓度为105CFU/mL的各菌液，37℃、150rpm过夜培养，在OD值为600nm下检测细菌生长情况。
将上述MHB培养基替换为YMB培养基用于真菌接种。
通过棋盘法测试了金诺芬(auranofin)与喷他脒(pentamidine)联用对临床常见细菌及真菌的体外抗菌效果(见图2)，测得两个药物单独使用时的最低抑菌浓度(minimuminhibitory concentration,MIC)与联合使用时的最低抑菌浓度，结果如表1所示。结果表明两个药物单独使用时对细菌及真菌的活性不高，但联合使用却可以大大地降低它们的最低抑菌浓度。
同时，我们根据式(1)计算出两个药物联合使用时的部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)。当FICI≤0.5时，这个药物组合被认为具有协同作用(synergy)；当0.5<FICI≤1.0时，药物组合被认为具有添加作用(additive)；当FICI≥4时，药物组合被认为彼此拮抗。通过图2与表1我们可以看出，金诺芬与喷他脒联合用药对抗多种菌，几乎对所有受测细菌及真菌都具有协同抗菌作用，喷他脒使得金诺芬对细菌或真菌的MIC降低2～32倍，抗菌活性显著增强。这一药物在处理多重耐药鲍曼不动杆菌A.baumannii-1789时，其抗菌活性尤为显著，FICI远低于0.5(FICI＝0.094)。
综上所述，体外抗菌实验结果表明喷他脒或金诺芬单独给药时对临床常见细菌及真菌的疗效不佳，而联合使用都表现出卓越的抗菌效果，具有显著的协同增效作用。
表1 金诺芬与喷他脒联合用药对不同细菌的协同抗菌评价
实施例2金诺芬与喷他脒联合用药对多重耐药鲍曼不动杆菌A.baumannii 1789的抑菌曲线测定
用MHB稀释金诺芬(2.0,3.9,7.8,15.6μg/mL)与喷他脒(125μg/mL)及它们的药物组合(喷他脒125μg/mL+金诺芬2.0,3.9,7.8,15.6μg/mL)，空白对照组为不含药物的MHB培养液，加入105CFU/mL的菌液后在37℃、150rpm下培养，在0～8h与24h于吸光度值为600nm时检测不同浓度下多重耐药鲍曼不动杆菌A.baumannii 1789的生长情况。
从图3可看出，喷他脒与金诺芬单独给药与空白对照组相比，减缓了细菌生长的速度，但细菌生长没有被完全抑制，当在金诺芬达到较高浓度15.6μg/mL时才能基本抑制细菌的生长，这表明在分别单独使用两种的药物的时候其抗菌性能均不足以完全杀死细菌。与之相反的是，金诺芬与喷他脒联合给药时，金诺芬即使在2μg/mL也能够完全阻止细菌生长，显示出完全的抑菌效果(喷他脒与金诺芬组合给药组的曲线均重叠)。因此，与单独给药相比，金诺芬与喷他脒联合给药能够完全抑制细菌生长繁殖。
实施例3金诺芬与喷他脒联合用药对多重耐药鲍曼不动杆菌A.baumannii 1789的杀菌动力学检测
多重耐药鲍曼不动杆菌A.baumannii-1789的杀菌动力学检测：用MHB稀释金诺芬(2.0,15.6μg/mL)与喷他脒(125μg/mL)及它们的药物组合(喷他脒125μg/mL+金诺芬2.0μg/mL)，空白对照组为不含药物的MHB培养液，加入与药物同体积的浓度为105CFU/mL的菌液，置于恒温摇床中，在37℃、150rpm下培养，在0,0.5,1,2,4,8,24h取10μL菌液稀释至适宜倍数涂抹于琼脂板上，在37℃培养24小时后计数。
从图4中看到，喷他脒(125μg/mL)和金诺芬(2.0μg/mL)单独给药并不能够抑制细菌生长，其生长趋势与未经处理的空白对照组相似。金诺芬(15.6μg/mL)单独给药在24h后对细菌杀灭效果显著，杀菌率约为97％。但金诺芬与喷他脒(125μg/mL)联用时，当药物组合物中的金诺芬浓度为2.0μg/mL，该组合物在4h内能够完全杀灭细菌，杀菌率>99％，显示出良好的协同杀菌作用。因此，实验结果表明，金诺芬与喷他脒的药物组合能够完全杀灭细菌。
实施例4金诺芬与喷他脒的溶血性实验
固定金诺芬或喷他脒的浓度250μg/mL，以250μg/mL为药物最大浓度用PBS连续二倍稀释另一个药物浓度，各取250μL混匀，加入采集的小鼠血红细胞溶液500μL，用PBS作为阴性对照，Triton X-100作为阳性对照，在37℃下培养2小时。在2200rpm，常温下离心5min，取上清液100μL至96孔板，在吸光度值为570nm下检测。
结果显示，浓度为250μg/mL的喷他脒与浓度为0～250μg/mL的金诺芬联用时无明显溶血反应；浓度为250μg/mL金诺芬与浓度为0～250μg/mL的喷他脒联用时同样无明显溶血反应。因此说明金诺芬与喷他脒的组合物均不产生溶血作用，对小鼠血红细胞溶液出几乎无毒性，展示出良好的血液相容性(见图5)。
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