一种bcr-abl1激酶结构域突变筛查方法
阅读说明：本技术 一种bcr-abl1激酶结构域突变筛查方法 (BCR-ABL1 kinase domain mutation screening method ) 是由 刘红星 滕文 谭印成 陈佳琦 于 2020-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法,包括如下步骤：从样本中分离单个核细胞并提取RNA；将提取的RNA进行逆转录为cDNA,并进行PCR反应、纯化,获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物；对扩增产物进行测序文库构建；将测序文库在PGM测序平台上进行测序,根据测序结果确定突变位点及其变异等位基因频率,再根据突变位点的变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式；本发明筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其变异等位基因频率,确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变；此外,该筛查方法结合巢式PCR的特点,采用特异性引物搭配使用,使得本发明筛查方法具有较高灵敏度和特异性具有较高的筛查灵敏度。(The invention discloses a BCR-ABL1 kinase domain mutation screening method, which comprises the following steps: isolating mononuclear cells from the sample and extracting RNA; carrying out reverse transcription on the extracted RNA to obtain cDNA, carrying out PCR reaction and purification to obtain an amplification product comprising a BCR-ABL1 kinase structure domain; constructing a sequencing library for the amplification product; sequencing the sequencing library on a PGM sequencing platform, determining mutation sites and mutation allele frequencies of the mutation sites according to a sequencing result, and judging whether mutation sites resistant to TKI and a mutation mode occur according to the mutation allele frequencies of the mutation sites; the screening method can accurately obtain mutation sites and the frequency of the variant alleles thereof in the sample sequence, and determine low-level mutation (less than 20 percent), compound mutation and polyclonal mutation; in addition, the screening method combines the characteristics of nested PCR and adopts specific primers to match, so that the screening method has higher sensitivity and specificity and higher screening sensitivity.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法。
背景技术
在BCR-ABL1融合基因阳性的白血病患者中出现BCR-ABL1激酶结构域(kinasedomain,KD)突变是对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)治疗耐药的常见机制。在几乎所有研究中，当疾病复发时，在50％-80％的患者可检测到BCR-ABL1 KD的突变。这些突变在生化和细胞分析中提示具有较高的IC50值。BCR-ABL1阳性白血病患者中最常见的imatinib耐药突变位点是T315I，除了ponatinib或单克隆抗体，其余第二代TKI(2G-TKIs)对T315I均无效。突变阳性的患者表现出极高的遗传不稳定性，这可能促进在相同(“复合”突变,compound mutations)或不同(“多克隆”突变,polyclonal mutations)的BCR-ABL1融合基因阳性的细胞亚群中获得更多的突变，从而产生复杂的突变模式。
越来越多的证据表明，合理使用微小残留病变(minimal residual disease,MRD)监测和BCR-ABL1 KD突变筛查在BCR-ABL1阳性白血病治疗优化中起重要作用。然而，Sanger测序(SS)检测虽然是BCR-ABL1 KD突变筛查的金标准，但这种方法的性质使它不适用于识别低水平变异(<20％VAF)，通常也不能够明确地区分发生在同一克隆中的多个突变(复合突变)或发生在单独克隆中的多个突变(多克隆突变)。这是因为SS产生的序列是混合的，不可能分析潜在亚克隆的基础结构和关系。
复合或多克隆分析对于接受了多次连续TKIs治疗的重度患者以及可能具有复杂的潜在克隆结构的患者尤为重要，这些患者的亚克隆通常表现出多种突变模式。BCR-ABL1复合突变能够导致高度耐药性，即使是在新一代、高度活跃的TKIs环境中也如此，如ponatinib。体外研究表明，作为复合突变发生的E255V/T315I比单独发生的任一突变都具有更高的ponatinib IC50值。已有临床研究支持了在ponatinib治疗中E255V/T315I复合突变出现的不良影响。随着患者相继暴露于越来越多的TKIs，并发展出可能更为难以治疗的复杂突变模式，因此，确定复合突变与多克隆突变状态的重要性日益严峻。
发明内容
本发明的目的在于提供一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，该筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其变异等位基因频率，确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变，筛查的灵敏度较高。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，所述筛查方法包括如下步骤：
(a)从样本中分离单个核细胞并提取RNA；
(b)将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应、纯化，获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物；
(c)对扩增产物进行测序文库构建；
(d)将测序文库在PGM测序平台上进行测序，根据测序结果确定突变位点的变异等位基因频率，再根据突变位点及其变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式。
本发明上述筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其变异等位基因频率，确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变，具有较高的筛查灵敏度。
优选地，所述根据测序结果确定是否发生突变包括:
将测序结果与hg19基因组数据进行对比分析，确定突变位点及其变异等位基因频率。
优选地，所述单个核细胞的数量为(5～8)×106个。通过对单个核细胞数量的限定，能够提取到足够用于实验的RNA，为后续成功扩增、建库提供有力的前提条件。
优选地，所述PCR反应包括巢式第一轮PCR反应和巢式第二轮PCR反应，巢式第二轮PCR反应以巢式第一轮PCR反应产物作为反应原料。
优选地，所述巢式第一轮PCR反应采用的引物序列为：
BCR190F：5’-TCCTTCGACAGCAGCAGTCC-3’(SEQ ID NO:1)；
BCR210F：5’-GAGCAGCAGAAGAAGTGTTTCAGA-3’(SEQ ID NO:2)；
ABL1R：5’-CAGGCACGTCAGTGGTGTCTC-3’(SEQ ID NO:3)。
优选地，所述第一轮PCR反应控制条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行15个PCR循环。
优选地，所述巢式第一轮PCR反应的扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
一轮引物
2μl
水
4μl
cDNA
4μl
Total
20μl
。
优选地，所述巢式第二轮PCR反应包括：
采用两个引物池分别进行扩增，再将两个引物池扩增后产物混合，得到扩增产物，其中：
一个引物池中引物序列为：
ABL1-1F：5’-ACAAGTGGGAGATGGAACGCA-3’(SEQ ID NO:4)；
ABL1-1R：5’-AGGTAGTCCAGGAGGTTCCC-3’(SEQ ID NO:5)；
ABL1-3F：5’-GGAGAACCACTTGGTGAAGGT-3’(SEQ ID NO:6)；
ABL1-3R：5’-CTTCTCTGGGCAGCCTTCTG-3’(SEQ ID NO:7)；
另外一个引物池中引物序列为：
ABL1-2F：5’-AGCTCCTTGGGGTCTGCAC-3’(SEQ ID NO:8)；
ABL1-2R：5’-CCCTGTCATCAACCTGCTCAG-3’(SEQ ID NO:9)；
ABL1-4F：5’-CCCTTACCCGGGAATTGACC-3’(SEQ ID NO:10)；
ABL1-4R：5’-TTCCCCAGCTCCTTTTCCAC-3’(SEQ ID NO:11)；
优选地，每个引物池的反应条件均为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行23个PCR循环，之后在72℃下2min，再降温至10℃。
优选地，所述巢式第二轮PCR反应中每个引物池的扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
二轮引物(1+3)/(2+4)
2μl
水
6μl
一轮扩增产物
2μl
Total
20μl
。本发明通过对上述特定引物的选择以及反应条件的限定，使得PCR扩增具有较高的灵敏度和特异性。
优选地，所述测序文库的构建方法如下：
选取扩增产物依次进行adaptor连接扩增反应、纯化和定量；
所述连接扩增反应采用的引物包括Ion Torrent PGM系统测序所需的X端和P1端，其中，
优选地，所述连接扩增反应条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行5个PCR循环，之后在72℃下2min，再降温至10℃。
优选地，所述连接扩增反应的扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
引物(X+P1)
2μl
水
0μl
二轮纯化产物
8μl
Total
20μl
。
本发明中的Q5 Mix为Q5 High-Fidelity 2X Master Mix(New England BioLabs,USA)。
优选地，所述纯化为在扩增后的产物中加入AMPure XP Beads进行纯化，再采用Low TE进行洗脱，得到纯化的扩增产物。
优选地，所述定量为将纯化后的连接扩增产物进行稀释，再采用Ion LibraryTaqMan Quantitation Kit在ABI-7500上进行定量。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其VAFs，并能够准确确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变；此外，本发明筛查方法结合巢式PCR的特点，采用特异性引物搭配使用，使得本发明筛查方法具有较高灵敏度和特异性具有较高的筛查灵敏度。
本发明筛查方法根据标本数量，可选择不同通量的芯片，一次检测可获得更高通量的数据，成本低廉。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例提供的BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法示意图；
图2为本发明实施例1中同一患者两个样本的测序结果图；
图3为本发明实施例2中某一患者两个样本的测序结果图；
图4为本发明实施例2中另一患者两个样本的测序结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
在用酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗的慢性粒细胞白血病(CML)和Ph+ALL患者中，BCR-ABL1激酶区突变是最常见的TKIs耐药机制；经典的Sanger基因测序是当前筛查BCR-ABL1激酶结构域(kinase domain,KD)突变最常用的方法，但其检测灵敏度低，无法揭示低于20％的变异等位基因频率(variant allele frequency,VAF)的突变；且难以区分复合突变或多克隆突变。
因此，本发明实施例提供一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，如图1所示，该筛查方法包括如下步骤：
(a)从样本中分离(5～8)×106个单个核细胞并提取RNA；
(b)将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应，在扩增产物中加入AMPureXP Beads进行纯化，再采用Low TE进行洗脱，获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物；
PCR反应包括巢式第一轮PCR反应和巢式第二轮PCR反应，巢式第二轮PCR反应以巢式第一轮PCR反应产物作为反应原料；
巢式第一轮PCR反应采用的引物序列为：
BCR190F：5’-TCCTTCGACAGCAGCAGTCC-3’(SEQ ID NO:1)；
BCR210F：5’-GAGCAGCAGAAGAAGTGTTTCAGA-3’(SEQ ID NO:2)；
ABL1R：5’-CAGGCACGTCAGTGGTGTCTC-3’(SEQ ID NO:3)；
控制条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行15个PCR循环；
扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
一轮引物
2μl
水
4μl
cDNA
4μl
Total
20μl
巢式第二轮PCR反应包括：
采用两个引物池分别进行扩增，再将两个引物池扩增后产物混合，得到扩增产物，其中：
一个引物池中引物序列为：
ABL1-1F：5’-ACAAGTGGGAGATGGAACGCA-3’(SEQ ID NO:4)；
ABL1-1R：5’-AGGTAGTCCAGGAGGTTCCC-3’(SEQ ID NO:5)；
ABL1-3F：5’-GGAGAACCACTTGGTGAAGGT-3’(SEQ ID NO:6)；
ABL1-3R：5’-CTTCTCTGGGCAGCCTTCTG-3’(SEQ ID NO:7)；
另外一个引物池中引物序列为：
ABL1-2F：5’-AGCTCCTTGGGGTCTGCAC-3’(SEQ ID NO:8)；
ABL1-2R：5’-CCCTGTCATCAACCTGCTCAG-3’(SEQ ID NO:9)；
ABL1-4F：5’-CCCTTACCCGGGAATTGACC-3’(SEQ ID NO:10)；
ABL1-4R：5’-TTCCCCAGCTCCTTTTCCAC-3’(SEQ ID NO:11)；
每个引物池的反应条件均为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行23个PCR循环，之后在72℃下2min，再降温至10℃；
每个引物池的扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
二轮引物(1+3)/(2+4)
2μl
水
6μl
一轮扩增产物
2μl
Total
20μl
(c)对扩增产物进行测序文库构建：
选取扩增产物依次进行adaptor连接扩增反应，随后在连接扩增后的产物中加入AMPure XP Beads进行纯化，再采用Low TE进行洗脱，得到纯化的连接扩增产物；然后，将纯化后的连接扩增产物进行稀释，再采用Ion Library TaqMan Quantitation Kit在ABI-7500上进行定量，得到测序文库；
所述连接扩增反应采用的引物包括Ion Torrent PGM系统测序所需的X端和P1端，其中，
本发明X端序列中的N代表A、T、C、G中的任意一种。
连接扩增反应条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行5个PCR循环，之后在72℃下2min，再降温至10℃；
连接扩增反应的扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
引物(X+P1)
2μl
水
0μl
二轮纯化产物
8μl
Total
20μl
(d)将测序文库在PGM测序平台上进行测序，将测序结果与hg19基因组数据进行对比分析确定突变位点的变异等位基因频率，再根据突变位点及其变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式。
本发明上述筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其变异等位基因频率，确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变，具有较高的筛查灵敏度。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
本实施例提供一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，该筛查方法包括如下步骤：
(a)从患者骨髓样本中分离6×106个单个核细胞并提取RNA；
(b)采用Maxima First Strand cDNA合成试剂盒和随机引物对14μl浓度为50～200ng/μl的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应，然后向扩增产物中加入30μl AMPureXP Beads(Beckman Coulter,Brea,USA)进行纯化，再用13μl Low TE(Life TechnologiesCorp，USA)进行洗脱，获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物，其中：
PCR反应包括巢式第一轮PCR反应和巢式第二轮PCR反应，巢式第二轮PCR反应以巢式第一轮PCR反应产物作为反应原料；
巢式第一轮PCR反应采用的引物序列为：
BCR190F：5’-TCCTTCGACAGCAGCAGTCC-3’；
BCR210F：5’-GAGCAGCAGAAGAAGTGTTTCAGA-3’；
ABL1R：5’-CAGGCACGTCAGTGGTGTCTC-3’；
反应控制条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行15个PCR循环；
扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
一轮引物
2μl
水
4μl
cDNA
4μl
Total
20μl
巢式第二轮PCR反应包括：
采用两个引物池分别进行扩增，扩增结束后，从两个引物池中选取10μl进行混合，得到扩增产物，其中：
一个引物池中引物序列为：
ABL1-1F：5’-ACAAGTGGGAGATGGAACGCA-3’；
ABL1-1R：5’-AGGTAGTCCAGGAGGTTCCC-3’；
ABL1-3F：5’-GGAGAACCACTTGGTGAAGGT-3’；
ABL1-3R：5’-CTTCTCTGGGCAGCCTTCTG-3’；
另外一个引物池中引物序列为：
ABL1-2F：5’-AGCTCCTTGGGGTCTGCAC-3’；
ABL1-2R：5’-CCCTGTCATCAACCTGCTCAG-3’；
ABL1-4F：5’-CCCTTACCCGGGAATTGACC-3’；
ABL1-4R：5’-TTCCCCAGCTCCTTTTCCAC-3’；
每个引物池的反应条件均为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行23个PCR循环，之后在72℃下2min，再降温至10℃；
每个引物池的扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
二轮引物(1+3)/(2+4)
2μl
水
6μl
一轮扩增产物
2μl
Total
20μl
(c)对扩增产物进行测序文库构建：
选取包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物依次进行adaptor连接扩增反应，在连接扩增后的产物中加入30μl AMPure XP Beads(Beckman Coulter,Brea,USA)进行纯化，再采用30μl Low TE(Life Technologies Corp，USA)进行洗脱，得到纯化的连接扩增产物，然后稀释1500倍，再采用Ion Library TaqMan Quantitation Kit(Thermo FisherScientific,Vilnius，Lithuania)在ABI-7500(Life Technologies)上进行定量，其中：
所述连接扩增反应采用的引物包括Ion Torrent PGM系统测序所需的X端和P1端，其中，
连接扩增反应条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行5个PCR循环，之后在72℃下2min，再降温至10℃。
连接扩增反应的扩增体系为20μl，具体包括：
试剂
体积
Q5 Mix
10μl
引物(X+P1)
2μl
水
0μl
二轮纯化产物
8μl
Total
20μl
(d)将测序文库在PGM测序平台上进行测序，参比hg19基因组数据，使用Torrent服务器软件v5.0.5进行数据分析，并使用Integrated Genomics Viewer(IGV)软件进行测序结果覆盖度和突变分析确定突变位点及其变异等位基因频率，再根据突变位点的变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式。
对同一患者另一时间选取骨髓样本按照上述方法进行BCR-ABL1激酶结构域突变筛查。
上述同一患者两个样本的测序结果如图2所示。
实施例2
对两名患者分别选取2个时间点的骨髓样本，并分别按照实施例1中的BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法进行筛查，其中1人不同时间点样本的筛查结果如图3所示，另外一人不同时间点样本的筛查结果如图4所示。
综上，由图2～图4可知，本发明BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法能够筛查出变异等位基因频率最低为4.7％，因此，本发明筛查方法具有较高的灵敏度；此外，本发明筛查方法还可确定患者是否携带复合或多克隆突变及其变异等位基因频率，达到动态监测患者耐药突变状态的目的。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京陆道培生物技术有限公司
<120> 一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法
<130> 202008
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
tccttcgaca gcagcagtcc 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
gagcagcaga agaagtgttt caga 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
caggcacgtc agtggtgtct c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
acaagtggga gatggaacgc a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
aggtagtcca ggaggttccc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
ggagaaccac ttggtgaagg t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
cttctctggg cagccttctg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
agctccttgg ggtctgcac 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
ccctgtcatc aacctgctca g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
cccttacccg ggaattgacc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
ttccccagct ccttttccac 20
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnng actaagcgtg 50
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 13
ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagtcggtnn nnnnnnngac taagcgtg 58