异鼠李素作为抗肾脏纤维化药物的应用
阅读说明：本技术 异鼠李素作为抗肾脏纤维化药物的应用 (Application of isorhamnetin as kidney fibrosis resisting medicine ) 是由 张珍 唐志书 宋忠兴 李艺文 于 2020-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,涉及一种异鼠李素作为抗肾脏纤维化药物的应用,尤其是异鼠李素在抑制上皮细胞-间充质转化EMT形成时作为抗肾脏纤维化药物的应用,本发明提供一种以细胞间隙连接蛋白Cx43为治疗肾脏纤维化新靶点以及效果显著的异鼠李素作为抗肾脏纤维化药物的应用。(The invention belongs to the field of medicines, relates to application of isorhamnetin as an anti-kidney fibrosis medicine, and particularly provides application of isorhamnetin as an anti-kidney fibrosis medicine when inhibiting formation of epithelial cell-mesenchymal transition EMT (endothelial cell-mesenchymal transition T).)
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种异鼠李素作为抗肾脏纤维化药物的应用。
背景技术
慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease，CKD)已经成为世界性的公共健康问题。据王海燕等人发表在柳叶刀上的调查数据显示，截止2012年我国成年人CKD患病率高达10.8％，CKD病患人数高达1.2亿。肾脏纤维化是CKD的主要病理特征，目前用于临床治疗肾脏纤维化只有血管紧张素酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂等，治疗药物非常有限，且不能有效阻止肾纤维化发生发展，还会出现一系列的不良反应，如ACEI所致咳嗽和严重的高血钾症等，已成为CKD临床治疗的瓶颈。寻找有效阻止肾脏纤维化的药物是攻克这一难题的关键。中药具有高效低毒的特点，从传统中药中寻找有效减缓肾脏纤维化进程的活性成分已成为抗肾脏纤维化药物研发的热点方向之一。
肾脏纤维化是所有CKD病变发展至终末期肾脏疾病(End Stage Renal Disease，ESRD)的最后共同通路，是CKD的主要病理基础。目前，肾脏纤维化的形成主要通过TGF-β1/Smads信号通路。通常情况下，肾脏在各种诱因(感染、损伤、化学物质和辐射等)下引起ROS(Reactive Oxygen Species)的过度生成，过多的ROS诱导各种细胞因子的分泌和释放，其中主要包括促纤维化因子转化生长因子TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)，TGF-β1进一步激活TGF-β1/Smads信号通路。当TGF-β1/Smads信号通路激活后，Smad2/3与Smad4形成三聚体进入细胞核，结合相应的转录因子，介导上皮细胞-间充质转化(Epithelial–Mesenchymal Transition，EMT)的形成，EMT是肾脏纤维化发生和发展中的重要过程，它的形成表现为上皮标志物E-钙粘着蛋白(E-cadherin)表达下降，上皮细胞向肌成纤维细胞转化的中间产物波形纤维蛋白(Vimentin)表达增加，肌成纤维细胞标志α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin，α-SMA)表达增加，使系膜细胞、肾小管上皮细胞和肾小球上皮细胞等转化成肌成纤维细胞，肌成纤维细胞呈现持续活化增殖状态，由此纤维粘连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)和III型胶原蛋白(Collagen III)等纤维蛋白表达增加并进入肾间质，导致细胞外基质(Extra Cellular Matrix，ECM)进行性积聚，而ECM的降解减少，从而导致的肾小球硬化、肾小管间质纤维化，最终肾功能丧失。
如图1所示，细胞间隙连接(Gap junction，GJ)或称缝隙连接，是细胞连接的一种，广泛地存在于各种动物组织中。在间隙连接之间的“交谈”也称为间隙连接的细胞间通讯(GJIC)，这种通讯允许细胞间小分子、离子和电信号的交流，从而影响细胞的代谢、繁殖、迁移和生存，在维持组织完整性中起重要的作用。细胞间隙连接是由细胞间隙连接蛋白(Connexin，Cx)六聚体形成的跨膜通道结构，6个相同或相似的跨膜Cx蛋白环绕形成筒状结构，称连接子(Connexon)，2个连接子在相邻细胞的细胞膜上分别从膜中伸出并对接，组装成亲水性细胞间隙连接通道(Hemichannel)。Cx43蛋白是主要的Cx组成蛋白，分布于多种细胞中。
1989年Beyer等学者首次在大鼠肾脏中发现Cx43的存在。随后Barajas等提供了一个更为完整的研究，并得出结论：Cx43定位于肾血管、系膜细胞和集合管。而Hillis等通过探究Cx43在不同炎症性肾小球疾病患者活检组织中的表达，发现Cx43在浸润细胞和肾小管上皮细胞中均有强表达，在损伤的***位也有较高的表达。近年来有研究证实Cx43在高血压性肾病和梗阻性肾病的早期表达增加，抑制Cx43表达降低了炎症细胞浸润和肾纤维化，并明显改善了肾脏的结构和功能，提示Cx43可能是治疗CKD进展的新靶点。肾脏病学领域的专家在探索新型且更有效的CKD治疗靶点的道路上付出了巨大的努力，Cx43新靶点的出现给患者及专家带来了希望。阻止Cx43信号传导的靶向治疗方法具有潜在的临床应用价值，但是寻找合适的Cx43抑制剂治疗肾脏纤维化仍是亟待解决的问题。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种以细胞间隙连接蛋白Cx43为治疗肾脏纤维化新靶点以及效果显著的异鼠李素作为抗肾脏纤维化药物的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
异鼠李素作为抗肾脏纤维化药物的应用。
异鼠李素在抑制上皮细胞-间充质转化EMT形成时作为抗肾脏纤维化药物的应用。
上述异鼠李素的浓度不低于25μM。
异鼠李素在抑制大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E增殖时作为抗肾脏纤维化药物的应用。
上述大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E是经过10％FBS诱导的。
上述异鼠李素的浓度不低于15μM。
异鼠李素在抑制细胞间隙连接蛋白Cx43表达时的应用。
异鼠李素在抑制细胞间隙连接蛋白Cx43表达时作为抗肾脏纤维化药物的应用。
本发明的优点是：
本发明提供了一种异鼠李素作为抗肾脏纤维化药物的应用，通过建立TGF-β1诱导的NRK-52E细胞纤维化模型和大鼠UUO肾脏纤维化模型，发现ISO具有抑制细胞间隙连接的作用；通过建立10％FBS诱导的NRK-52E细胞增殖模型和TGF-β1诱导的NRK-52E细胞纤维化模型，发现ISO抑制NRK-52E细胞的增殖、EMT的形成和ECM的沉积；建立大鼠UUO肾脏纤维化模型，ISO显著改善UUO模型中的肾脏皮质厚度、长度和肾脏重量；Masson三色染色结果表明ISO抑制肾脏纤维化蛋白的沉积，发现ISO具有抗肾脏纤维化的作用，且效果优于阳性药依那普利。Western blot体内证明ISO抑制EMT的形成和ECM的沉积。本发明首次发现ISO抑制EMT的形成和ECM的沉积，具有抗肾脏纤维化的作用，并且ISO的抗肾脏纤维化作用与其调节细胞间隙连接蛋白Cx43有关，而Cx43是近年来治疗肾脏纤维化的新靶点，因此，ISO有可能成为潜在的抗肾脏纤维化治疗药物。
附图说明
图1是细胞间隙连接示意图；
图2是异鼠李素的分子结构式；
图3是ISO对细胞间隙连接的影响；
图4是ISO对NRK-52E细胞纤维化的影响；
图5是ISO对UUO大鼠肾脏纤维化的影响。
具体实施方式
通常用于疾病治疗的沙棘部位主要有沙棘油、沙棘果泥和沙棘黄酮等。对于沙棘黄酮中的主要成分异鼠李素(ISO)(异鼠李素的分子结构式详见图2)的应用还未见报道，研究表明沙棘黄酮中槲皮素可上调因H2O2引起的Cx43的表达降低，荧光黄扩散实验表明，槲皮素可恢复细胞间隙连接的开放功能，使细胞间隙连接的旁观者效应增强，且Cx43蛋白的表达上调，而ISO与槲皮素具有极为相似的结构，推测ISO可能存在对细胞间隙连接Cx43的调节作用。
大鼠单侧输尿管结扎(Unilateral Ureteric Obstruction，UUO)模型是目前应用最为广泛的研究肾间质纤维化的实验动物模型。自1950年以来，应用UUO模型的相关文章发表超过10000篇。UUO模型成功率高，对动物损伤小、死亡率低。方法简便，有较好的重复性。在UUO模型中，通过结扎单侧输尿管引起肾脏引流系统的阻塞，持续尿路压力升高，肾血流降低，静脉引流阻塞，单核巨噬细胞被激活并产生Ang II，从而触发TGF-β1/Smads信号通路等一连串的信号通路的激活，导致进展性肾间质纤维化。在UUO模型中病变均一，不存在内毒素、***环境。对侧肾脏可用于对照，并且无需考虑其细胞、代谢、代偿性功能变化。多项证据表明，UUO模型的一些研究结果与梗阻性肾病患者的观察结果相似，故而啮齿类动物的模型可以反映人类梗阻性肾病和纤维化肾脏疾病过程。UUO模型术后3天就已出现早期肾纤维化改变，许多可定量的病理改变约在UUO术后一周发生，主要的包括肾小管上皮细胞EMT形成，产生ECM等。因此，大鼠UUO模型就研究肾间质纤维化相关研究而言，是一种较为快速、可靠的动物模型。
大量文献证实，TGF-β1是最重要的促肾纤维化细胞因子，它在多种慢性肾病中大量表达和分泌。研究表明，TGF-β1在2～10ng/mL浓度时能诱导体外培养的肾小管上皮细胞增殖，引起EMT的形成，并通过受体信号转导合成Fibronectin、Collagen和Collagen III胶原蛋白等，引起ECM过度沉积，同时抑制ECM降解酶的表达，进而抑制ECM降解，从而导致纤维化的发生发展。目前，许多研究已TGF-β1作为研究肾小管上皮细胞向成纤维细胞转分化的经典诱导因子。本模型采用TGF-β1 2ng/mL浓度诱导体外培养的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化来构建肾间质纤维化细胞模型。
血清中的含有多种促进细胞增殖的细胞因子及营养物质，通常采用高浓度血清促进细胞增殖，再给予药物进行干预，来检测药物对细胞增殖的影响。本发明中采用10％FBS(胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS))建立细胞增殖模型。
为研究异鼠李素(Isorhamnetin，ISO)是否存在对细胞间隙连接(Gap Junction，GJ)的调节作用，本发明建立TGF-β1诱导的NRK-52E细胞纤维化模型，研究首次发现ISO具有抑制细胞间隙连接的作用。荧光黄扩散实验表明，ISO抑制细胞间隙连接通道开放功能，使其旁观者效应减弱(图3中的A和B)；Western blot结果表明ISO下调GJ蛋白Cx43的表达(n＝4)，并且具有显著性差异(图3中的C和D)，本发明建立大鼠UUO肾脏纤维化模型，研究ISO是否影响Cx43的表达，免疫组化结果表明，ISO抑制Cx43的表达(n＝4)，具有显著性差异。
鉴于ISO具有抑制细胞间隙连接通道的开放功能，而Cx43是细胞间隙连接的主要蛋白，是抗肾脏纤维化治疗的新靶点，本发明建立10％FBS诱导的NRK-52E细胞增殖模型，研究ISO对NRK-52E细胞增殖的影响；建立TGF-β1诱导的NRK-52E细胞纤维化模型研究ISO是否具有抗肾脏纤维化的作用。研究结果首次发现：ISO从15μM到50μM浓度范围抑制10％FBS诱导的NRK-52E细胞增殖(图4的A)；Western blot结果表明ISO抑制α-SMA的表达，而上调E-cadherin的表达，表明ISO 25μM浓度抑制EMT的形成(图4中的B-E)。Western blot结果表明ISO抑制Fibronectin的表达，表明ISO25μM浓度抑制ECM的沉积(图4中的F和G)；均具有显著性差异(n＝4)。
为明确ISO是否体内同样具有抗肾脏纤维化的作用，本发明建立大鼠UUO肾脏纤维化模型，研究ISO是否具有抗肾脏纤维化的作用，结果表明：ISO显著改善UUO模型中的肾脏皮质厚度、长度和肾脏重量(图5中的A-D)；Masson三色染色结果表明ISO抑制肾脏纤维化蛋白的沉积；研究首次发现ISO具有抗肾脏纤维化的作用，且效果优于阳性药依那普利(图5中的E和F)；均具有显著性差异(n＝7-11)。
综上所述，本发明首次发现ISO抑制EMT的形成和ECM的沉积，具有抗肾脏纤维化的作用，并且ISO的抗肾脏纤维化作用与其调节细胞间隙连接蛋白Cx43有关，而Cx43是近年来治疗肾脏纤维化的新靶点，因此，ISO有可能成为潜在的抗肾脏纤维化治疗药物。