一种二氧化碳酶法测定试剂盒
阅读说明：本技术 一种二氧化碳酶法测定试剂盒 (Carbon dioxide enzyme method determination kit ) 是由 吴年芬 赵畅 梁艳 龚婷 凡速朋 舒芹 张雪娇 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种二氧化碳酶法检测试剂盒,它含有磷酸烯醇丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、缓冲液、反应加速剂、防腐剂、表面活性剂、保护剂以及由葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸组成的循环再生系统,所述循环再生系统中各成分在试剂盒中的含量分别为：葡萄糖：1-10g/L；葡萄糖脱氢酶：50-1000U/L；氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸：0.3-0.6g/L。本发明通过对循环再生系统中各成分的比例和用量进行优化,进一步选择合适的表面活性剂、保护剂以及检测体系的pH条件,从而更好地控制了循环系统的反应速率,使其在提高试剂盒稳定性的基础上,同时提高了低浓度二氧化碳检测结果的准确性。(The invention discloses a carbon dioxide enzyme method detection kit, which contains phosphoenolpyruvate, phosphoenolpyruvate carboxylase, malate dehydrogenase, buffer solution, a reaction accelerator, a preservative, a surfactant, a protective agent and a circulating regeneration system consisting of glucose, glucose dehydrogenase and oxidized 3-acetylpyridine adenine dinucleotide, wherein the contents of all components in the circulating regeneration system in the kit are respectively as follows: glucose: 1-10 g/L; glucose dehydrogenase: 50-1000U/L; oxidized 3-acetylpyridine adenine dinucleotide: 0.3-0.6 g/L. According to the invention, the proportion and the dosage of each component in the circulating regeneration system are optimized, and the proper surfactant, protective agent and pH condition of the detection system are further selected, so that the reaction rate of the circulating system is better controlled, and the accuracy of the detection result of the low-concentration carbon dioxide is improved on the basis of improving the stability of the kit.)
技术领域
本发明属于生化检测领域，涉及一种二氧化碳测定试剂盒。
背景技术
血液中的CO2主要以HCO3 -形式存在，大约占95％，是机体维持酸碱平衡的主要缓冲碱，也是判断酸碱代谢情况的常用指标之一，对酸碱平衡紊乱性疾病的进程和疗效判断提供了重要的依据，在临床上应用十分普遍，是不可缺少的急诊项目之一。
测定CO2的方法主要用酶法和电极法。电极法一般与电解质分析仪组合在一起，CO2电极膜需要定期更换，使用起来不是很方便。酶法测定适合自动生化分析仪，用起来更加方便快捷。酶法检测二氧化碳的基本原理是：磷酸烯醇丙酮酸在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶作用下与HCO3 -反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与还原型辅酶在苹果酸脱氢酶作用下生成苹果酸，同时还原型辅酶被氧化成氧化型辅酶，引起吸光度下降，在一定波长下检测吸光度下降程度从而计算血液中二氧化碳浓度。例如CN1763536A即公开了一种根据以上原理检测二氧化碳含量的方法及诊断试剂盒。
但是试剂盒在开口存放时容易与空气中的CO2发生反应，造成底物浓度下降，试剂开瓶稳定性差，为此，CN103558370A和CN107966556A均报道了使用循环再生系统的二氧化碳酶法测定试剂盒，它的原理是：将氧化型辅酶和葡萄糖在葡萄糖脱氢酶的酶促作用下反应，氧化型辅酶被还原，使还原型辅酶得以循环再生，从而使试剂盒不会因为吸收外界二氧化碳而导致稳定性下降。目前该方法已经在试剂盒中得到广泛应用，但是它也存在很大缺点，由于循环再生的反应速率不容易控制，会干扰二氧化碳检测的主反应，从而导致针对低浓度二氧化碳检测时的准确性下降。
发明内容
本发明的目的是针对现有循环再生二氧化碳酶法测定试剂盒存在的缺陷，提供一种针对低浓度二氧化碳检测的试剂盒，并通过对试剂盒成分种类和比例进行优化从而大幅提高检测结果的准确性。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种二氧化碳酶法检测试剂盒，它含有磷酸烯醇丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、缓冲液、反应加速剂、防腐剂、表面活性剂、保护剂以及由葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸组成的循环再生系统，所述循环再生系统中各成分在试剂盒中的含量分别为：
葡萄糖：1-10g/L
葡萄糖脱氢酶：50-1000U/L
氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸：0.3-0.6g/L。
优选地，所述循环再生系统中各成分在试剂盒中的含量分别为：
葡萄糖：5g/L
葡萄糖脱氢酶：100U/L
氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸：0.4g/L。
优选地，所述表面活性剂选为蓖麻油、花王709、花王A90、花王430中的一种或几种。
进一步优选地，所述表面活性剂为蓖麻油和花王A90，二者的重量比为1：1。
优选地，所述表面活性剂在试剂盒中的含量为0.5-5g/L。
优选地，所述试剂盒的pH为7.2-7.6。
优选地，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
优选地，所述反应加速剂为硫酸镁。
优选地，所述防腐剂为叠氮钠。
优选地，所述保护剂为丝氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、EDTA·2Na、牛血清白蛋白、甘露醇、葡聚糖、海藻糖中的一种或多种。
根据本发明的具体实施例，所述二氧化碳酶法检测试剂盒更具体的组分为：
本发明的检测原理如下：
1)葡萄糖和氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)在葡萄糖脱氢酶作用下生成葡萄糖醛和还原型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APADH)；
2)磷酸烯醇丙酮酸和HCO3 -在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶作用下生成草酰乙酸和磷酸；
3)草酰乙酸和还原型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APADH)在苹果酸脱氢酶作用下生成苹果酸和氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)；
4)在405nm波长下检测吸光度下降程度从而计算血液中二氧化碳浓度。
本发明的有益效果是：
本发明通过对循环再生系统中各成分的比例和用量进行优化，进一步选择合适的表面活性剂、保护剂以及检测体系的pH条件，从而更好地控制了循环系统的反应速率，使其在提高试剂盒稳定性的基础上，同时提高了低浓度二氧化碳检测结果的准确性。
本发明还具有热稳定性好、检测灵敏度和精密度高等优点。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例中所用到的花王系列表面活性剂均购自花王公司，EMULGEN 709主要成分是聚氧乙烯烷基醚，EMULGEN A-90主要成分是聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚，EMULGEN 430主要成分是聚氧乙烯油基醚。
实施例1循环再生系统不同比例对检测准确性的影响
按照下表设置不同的循环再生系统比例，
试剂盒其它成分如下：
试剂盒配置方法：按照上述配方的量，将HEPES加入纯化水中，并调pH值为7.4，再依次加入磷酸烯醇丙酮酸、MgSO4·7H2O、NaN3、表面活性剂、保护剂、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、APAD+，定容后混匀即得到所需的二氧化碳试剂。置于2-8℃静置1天平衡，再取出用于试剂使用。
试剂测试及评价方法：
(1)实验仪器：HITACHI 7180
(2)实验参数：两点速率法；温度：37℃；主波长：405nm；样本量：3μL；试剂：300μL；反应方向：负向；反应时间：10min；定标方式：两点定标。
空白(B)
测定(U)
校准(Ci)
空白样本(μL)
3
－
－
样本(μL)
－
3
－
校准品(μL)
－
－
3
试剂R(μL)
300
300
300
(3)试验方法：将已知浓度的HCO3 -溶液与检测试剂混匀，37℃恒温2分钟后405nm波长处测定吸光度A1，2分钟后测定吸光度A2，计算含量和与靶值的偏差，结果见下表：
从试验结果可以得出，当葡萄糖浓度为1-10g/L、葡萄糖脱氢酶浓度为50-1000U/L、APAD+浓度为0.3-0.6g/L，检测结果与靶值的偏差小于10％，能够满足检测需要。
实施例2表面活性剂种类对检测准确性的影响
表面活性剂种类
含量
1
蓖麻油
1g/L
2
花王709
1g/L
3
花王A90
1g/L
4
花王430
1g/L
5
TX-100
1g/L
6
十六烷基三甲基溴化铵
1g/L
7
十二烷基磺酸钠
1g/L
8
蓖麻油：花王A90＝1：1
1g/L
试剂盒其它成分与实施例1相同，其中葡萄糖浓度为5g/L、葡萄糖脱氢酶浓度为500U/L、APAD+浓度为0.6g/L。
按照实施例1的方法进行试验，结果见下表：
靶值
检测值
偏差(％)
1
4.6
4.66
1.3％
2
4.6
4.65
1.1％
3
4.6
4.65
1.1％
4
4.6
4.67
1.5％
5
4.6
4.34
-5.6％
6
4.6
4.27
-7.2％
7
4.6
4.38
-4.8％
8
4.6
4.62
0.4％
从试验结果可以得出，以蓖麻油、花王系列为表面活性剂，检测结果的准确性明显优于TX-100、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基磺酸钠等其它表面活性剂，当使用蓖麻油和花王A90组合活性剂时，检测结果的准确性更高。
实施例3pH对检测准确性的影响
试剂pH值
1
7.0
2
7.2
3
7.4
4
7.6
5
7.8
6
8.0
7
8.2
8
8.4
试剂盒其它成分与实施例1相同，其中葡萄糖浓度为5g/L、葡萄糖脱氢酶浓度为500U/L、APAD+浓度为0.6g/L。
按照实施例1的方法进行试验，结果见下表：
靶值
检测值
偏差(％)
1
4.6
4.45
-3.2％
2
4.6
4.66
1.3％
3
4.6
4.65
1.1％
4
4.6
4.52
-1.7％
5
4.6
4.47
-2.8％
6
4.6
4.39
-4.6％
7
4.6
4.31
-6.3％
8
4.6
4.22
-8.3％
从以上结果可以看出，当pH在7.2-7.6范围内，检测结果的准确性较好。
实施例4检测试剂的配制及应用
1号检测试剂的配制：
2号检测试剂的配制：
3号检测试剂的配制：
检测效果评价：
①准确度：测第三方质控品，计算测定平均值与靶值的偏差，≤10％算满足要求；
②重复性：使用同一血清样本或控制物质重复测定20次，其测定值的变异系数(CV)应≤5％；
③试剂空白吸光度：本试剂在405nm波长处，10mm光径下，试剂空白吸光度应≤0.9000。
④灵敏度：测定5.0mmol/L的样品时，吸光度变化值(反应速率)，应在0.0200～0.0800；
⑤稳定性：
a.热稳定性：将试剂分别置于37℃和45℃摇床上震荡3天后评价：空白吸光度、灵敏度、准确度；
b.开瓶稳定性：将试剂置于2-8℃开瓶放置31天后评价：空白吸光度、灵敏度、准确度；
