阅读说明：本技术 盐酸苄达明在制备抗肿瘤药物中的应用 (Application of benzydamine hydrochloride in preparation of antitumor drugs ) 是由 刘康栋 董子钢 周玉冰 赵继敏 赵四敏 江亚南 董子明 于 2020-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开盐酸苄达明在制备抗肿瘤药物中的应用。尤其涉及盐酸苄达明在制备治疗食管癌药物中的应用,盐酸苄达明,中文名称为：1-苄基-3-[3-(二甲基氨基)丙氧基]-1H-吲唑,英文名：Benzindamine Hydrochloride分子式：C<Sub>19</Sub>H<Sub>24</Sub>ClN<Sub>3</Sub>O分子量:345.866 CAS号：132-69-4,本申请通过实验证实盐酸苄达明用于食管鳞状细胞癌细胞(KYSE150细胞、KYSE450细胞)时,能够起到抑制食管鳞状细胞癌细胞生长和转化的作用,且盐酸苄达明能够抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖和转化的适宜浓度为2.5μM-20μM。(The invention discloses application of benzydamine hydrochloride in preparation of antitumor drugs. In particular to an application of benzydamine hydrochloride in preparing a medicament for treating esophageal cancer, wherein the benzydamine hydrochloride has the Chinese name: 1-benzyl-3- [3- (dimethylamino) propoxy group]-1H-indazole, english name: benzindamine Hydrochorride molecular formula: c 19 H 24 ClN 3 Molecular weight of O345.866 CAS number: 132-69-4, the application proves through experiments that when the benzydamine hydrochloride is used for esophageal squamous cell carcinoma cells (KYSE150 cells and KYSE450 cells), the benzydamine hydrochloride can play a role in inhibiting growth and transformation of the esophageal squamous cell carcinoma cells, and the suitable concentration of the benzydamine hydrochloride for inhibiting proliferation and transformation of the esophageal squamous cell carcinoma cells is 2.5-20 mu M.)

盐酸苄达明在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及盐酸苄达明在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

全球范围内，每年约有140万上消化道恶性肿瘤（食管癌）新发病例，死亡约112万人，仅次于肺癌。在上消化道恶性肿瘤新发病例中，74.36%发生在欠发达地区，44.60%发生在中国。食管癌是全球八大常见恶性肿瘤之一。世界卫生组织、国际癌症研究机构调查的数据显示，2012年全球约有 45.6万食管癌新发病例，占全部癌症发病的3.2%；死亡病例约40万，占全部癌症死亡人数的4.9%。我国是食管癌的高发国家，又是食管癌病死率最高的国家，其发病率在我国大陆地区居各类肿瘤第5位，病死率居第4位。食管癌的发病率在我国呈现明显的地区差异，某些地区的绝对高发与周边地区的相对低发形成鲜明的对比，构成我国食管癌最典型的流行病学特征。食管癌的组织学类型分为食管鳞癌和食管腺癌。不同的组织学类型食管癌的发病水平、地理分布、时间变化趋势及发病危险因素存在较大差别。在我国，食管鳞状细胞癌占食管癌的90%以上，而在欧美等低发地区，食管癌的组织病理学类型以腺癌为主。两种组织学类型食管癌发病率的时间变化趋势也存在较大差异，全球食管鳞癌呈下降趋势，而食管腺癌则呈上升趋势，但是相同组织学类型的癌症发生率趋势在不同地区也不尽相同。

食管癌是一种起源于食管上皮组织的恶性肿瘤，其发生发展是多因素、多基因、多阶段共同作用的结果，与年龄、性别、吸烟、生活饮食习惯、生活环境以及遗传因素都密切相关。尽管手术、化疗和放疗等治疗手段在食管癌的治疗中已得到了较为广泛的应用，但食管癌的发生率和死亡率并没有明显改善。这就提示我们进一步研究食管癌发生发展机制并对该过程进行干预是降低食管上皮癌发生率的重要策略之一。

人食管鳞状上皮细胞癌变过程是由正常、轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、原位癌最后到***的动态病理变化过程。在原位癌之前的病变统称为癌前病变，从正常细胞转化为癌细胞的过程大约需要5-10年，这期间上皮细胞可以继续发展为癌细胞，也可以停止分化处于稳定状态，甚至可以逆转变为正常细胞，其具有不稳定和双向转化的特性，这就为我们干预食管癌发生发展的过程提供了理论基础。

化学药物治疗是肿瘤治疗的传统方法之一，在肿瘤治疗中占有重要的地位。目前，临床常用的抗肿瘤药物存在疗效欠佳,毒副作用大等缺点，而研发新的抗肿瘤药物具有耗时长、投入大等问题。近年来有研究发现，大量临床安全性明确且已被广泛应用于临床的非抗肿瘤药物也可能具有抗肿瘤作用，如黄芪、雷公藤、二甲双胍、阿司匹林等。

“治疗”是指疾病或病况已经开始发展滞后减轻其病征或症状的治疗性干预。如本

文使用的，关于疾病或病况的术语“减轻”是指治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果

可以例如通过易感受试者中疾病的临床症状的延迟发作、疾病的部分或全部临床症状的严

重度降低、疾病的较慢进展、受试者总体健康或幸福的改善或者通过对于特定疾病特异的

本领域熟知的其他参数所证实。如本文使用的，关于疾病或病况的术语“预防”是指在处于发展疾病的风险。癌症的化学预防是指利用天然或合成的化学物质来阻止、减缓或者逆转癌症发生发展过程，从而降低癌症发生率和死亡率。

近年研究发现，阿司匹林不仅可以预防多种癌症，降低癌症的发生率，还对多种癌细胞的生长具有显著地抑制作用，并促进癌细胞发生凋亡。虽然吲唑类似物盐酸苄达明是一种非甾体类抗炎药，但它具有不同于传统阿司匹林样NSAIDs的各种物理化学性质和药理活性，但作为有效的局部作用NSAID促进了盐酸苄达明的作用机制。该药在抑制食管癌和胃癌等消化道肿瘤增殖生长的作用方面目前无报道，也无相关的专利申请。

发明内容

本发明目的在于提供一种盐酸苄达明在制备抗肿瘤药物中的应用。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

盐酸苄达明在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌的药物。盐酸苄达明，中文名称为：1-苄基-3-[3-(二甲基氨基)丙氧基]-1H-吲唑，英文名：BenzindamineHydrochloride 分子式：C₁₉H₂₄ClN₃O分子量:345.866 CAS号：132-69-4。

进一步的，盐酸苄达明在浓度为2.5-20 μM时能够抑制食管鳞癌细胞（KYSE150，KYSE450细胞）的增殖、克隆形成的数量及大小。

本发明发现盐酸苄达明在利用新鲜肿瘤组织接种于免疫缺陷SCID小鼠皮下建立的食管癌PDX模型上有显著的抗肿瘤生长效果，能够起到食管癌复发预防的效果，本发明中，小鼠体内肿瘤治疗浓度为5mg/kg/天—50mg/kg/天。

本发明中利用非甾体抗炎药盐酸苄达明在食管癌的预防及治疗中的作用，显著提高了食管癌的预防及治疗效果。实验发现：盐酸苄达明在治疗食管癌上能有显著效果。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的化合物和药用载体。本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和有效量，例如，治疗有效量(包括预防有效量)的本发明的前述化合物或其盐中的一种或多种。

药用载体可以常规使用的且仅受化学-物理考虑如溶解度和缺乏与所述化合物的反应性以及受施用途径限制的那些中的任何载体。

本文所述的药用载体，例如，媒介物、辅剂、赋形剂或稀释剂，对本领域技术人员是熟知的并且对公众易于获得。优选的是，药用载体是对于活性化合物为惰性的载体以及在

使用的条件下不具有有害副作用或毒性的载体。

载体的选择将部分地由具体活性剂以及由用来施用组合物的具体方法决定。因此，存在广泛各种各样的本发明的药物组合物的合适制剂。如用于经口、气溶胶、胃肠外、皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内、直肠和***施用的制剂。

本发明通过细胞增殖实验，首次验证了 1-苄基-3-[3-(二甲基氨基)丙氧基]-1H-吲唑在食管癌细胞系(KYSE150,KYSE450)生长中的抑制效果，可为临床研究预防和***的药物提供新的思路和依据。

附图说明

图1为盐酸苄达明结构式。

图2为盐酸苄达明在食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450中的毒性作用；

图3为盐酸苄达明不同浓度在不同时间点的食管鳞癌细胞增殖曲线；

图4为盐酸苄达明抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成显微照片、加药以及对照组克隆数量的统计结果；

图5 为食管鳞癌患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠经盐酸苄达明处理40天后，小鼠处死后肿瘤块拍照对比结果；

图6 为食管鳞癌患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠经盐酸苄达明处理40天后，小鼠处死后肿瘤块称量统计结果；

图7为食管鳞癌患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠经盐酸苄达明处理40天后，小鼠体内肿瘤体积统计结果；

图8为食管鳞癌患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠经盐酸苄达明处理40天后，小鼠体重统计结果；

图3、图4、图7中*p <0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用试验

材料与方法

1.材料

1.1食管癌细胞系

本发明中使用的食管癌细胞系，来自郑州大学基础医学院病理生理学教研室。

1.2 试剂

青霉素 华北制药股份有限公司

链霉素 山东鲁抗医药股份有限公司

RPMI-1640 培养基 以色列 Biological Industries 公司

DMEM 培养基 以色列 Biological Industries 公司

0.25%胰酶 上海碧云天生物科技有限公司

无血清细胞冻存液 苏州新赛美生物科技有限公司

DAPI 北京索莱宝科技有限公司

琼脂粉 美国 B&D 公司

PBS 粉末 北京索莱宝科技有限公司

BME 粉末 美国 SIGMA-ALDRICH

L-谷氨酰胺 北京索莱宝科技有限公司

NaHCO₃ 天津市凯通化学试剂有限公司

多聚甲醛粉 天津市光复精细化工研究所

胎牛血清 美国 BI 公司

盐酸苄达明粉末 百灵威

0.4％戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）；

生理盐水500ml 瓶（辰欣药业股份有限公司）;

1.3仪器与器材：

1.5ml 离心管 美国 Axygen 公司

15ml 离心管 美国 Corning 公司

96 孔细胞培养板 无锡耐思生物科技有限公司

10 cm 细胞培养皿 无锡耐思生物科技有限公司

15 cm 细胞培养皿 美国 Thermo Fisher Scientific 公司

一次性移液管 广州洁特生物过滤股份有限公司

In Cell Analyzer 6000 美国 GE 公司

移液器 美国 Gilson 公司

干燥 CO₂ 培养箱 上海一恒科学仪器有限公司

高速低温离心机 德国 Eppendorf 公司

真空抽吸泵 海门市其林贝尔仪器制造有限公司

倒置显微镜 德国 Carl Zeiss Jena 公司

雪花制冰机 日本 SANYO 公司

Mili-Q 纯水仪 美国 Millipore 公司

Thermo超净工作台；

眼科剪，手术镊，手术刀，溶药针，注射器；

1.4实验动物

4-5周龄的SCID小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，并饲养于昼夜12 h交替的恒温恒压环境中。小鼠体重约为18-20 g时，方可进行实验。实验动物饲养于郑州大学癌症化学预防河南省协同创新中心的动物设施内，在恒温(25—27)、恒湿(45%—50%)、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌(SPF级）饲养室条件下饲养，经无菌处理的饲料供动物自由摄入，高温消毒的垫料每三天更换一次，笼具及饮水每三天紫外线消毒一次，饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。

1.5实验方法

1.5.1细胞毒性实验：将食管鳞癌细胞种于96孔板KYSE150每孔约8000个细胞，KYSE450每孔约12000个细胞（KYSE150细胞：10%FBS/ RPMI-1640；KYSE450细胞：10%FBS/DMEM），放入37℃，5% CO₂的培养箱进行培养12-16 h。之后分别加入不同量盐酸苄达明，使药物在培养基中的终浓度分别为0、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、75μM、100μM，处理24 h和48h。取出后加入100μl/孔4%多聚甲醛的溶液对细胞在室温下固定30 min，再加入100μl/孔DAPI染液（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）在37℃，5% CO₂的培养箱培养30 min。用高内涵细胞成像分析系统统计细胞的数量，并分析其统计结果，结果如图2所示。

1.5.2细胞增殖实验研宄

将食管鳞癌细胞种于96孔板，KYSE150每孔约3000个细胞，KYSE450每孔约5000个细胞（KYSE150细胞：10%FBS/ RPMI-1640；KYSE450细胞：10%FBS/DMEM），放入37℃，5% CO₂的培养箱进行培养12-16 h。之后分别加入不同量盐酸苄达明，使药物在培养基中的终浓度分别为0、2.5、5、10、20μM，分别在0、24、48、72、96 h加入100μl/孔4%多聚甲醛的溶液对细胞在室温下固定30 min，再加入100μl/孔DAPI染液（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）在37℃，5% CO₂的培养箱培养30 min。用高内涵细胞成像分析系统统计细胞的数量，并分析其统计结果，结果详见图3。

1.5.3软琼脂克隆形成实验

将细胞（每孔8000个细胞）接种在6孔平板上，下层胶为琼脂胶加入相应浓度的盐酸苄达明，上层胶为琼脂胶加入相应浓度的盐酸苄达明以及食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450。然后将固化的琼脂置于37℃，5% CO₂的培养箱中培养7-14天。用高内涵细胞成像分析系统统计细胞克隆的数量，并分析其统计结果，结果详见图4。

1.5.4人食管癌免疫缺陷鼠种植瘤模型的建立

食管鳞癌组织选取标准为：手术前未接受过任何放疗或者化疗治疗的病人的新鲜肿瘤组织（患者，男，46岁，2042083，T2NOMOII，中分化鳞癌，取自河南省肿瘤医院)，在肿瘤组织离体后的90 min内，置于无血清的1640培养基中冷藏运送至实验室。在进行组织接种前，肿瘤组织需要用含有青霉素链霉素的PBS（PBS:双抗 50:1）冲洗后置于冰上，等待接种。先给小鼠注射0.4%的戊巴比妥钠使小鼠进入麻醉状态后，将组织切成10-15 mm3的小块，用镊子种植于小鼠颈背部皮下，等待小鼠麻醉苏醒后送回无菌饲养室。约3-5天后小鼠颈背部伤口愈合后，每隔固定时间测量一次小鼠肿瘤体积，待肿瘤体积达到1000 mm³时，处死小鼠并取出肿瘤组织。以同样的方式传代至新的SCID小鼠皮下（第2代）。当移植瘤被稳定传至3代后，则证明食管癌移植瘤模型成功建立。

1.5.5盐酸苄达明抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤生长

接种一周或者两周后，小鼠背部肿瘤结节长到200立方毫米左右时开始分组，即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，每组组分10只以上。3组小鼠分别灌胃生理盐水，5 mg/kg盐酸苄达明，50 mg/kg盐酸苄达明（盐酸苄达明溶于生理盐水形成所需浓度）。每4天记录小鼠肿瘤体积。当对照组小鼠肿瘤体积长到1000立方毫米左右，终止实验，取出肿瘤组织，称量肿瘤重量以及拍照，结果如图5至8所示。

1.6实验结果

本发明选取了食管癌细胞系，因此首先对食管癌细胞系进行细胞毒性实验，结果见图2。由图2可知，可以发现0-20 μM的盐酸苄达明对食管癌细胞系KYSE 150和KYSE 450的影响非常小，因而选择细胞20μM作为食管癌细胞系后续实验中的最高剂量，且在0-25μM时，盐酸苄达明对KYSE 150、KYSE 450细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性。

盐酸苄达明对食管鳞癌细胞具有抑制作用（见图3)。其中，图3的结果表明：盐酸苄达明在浓度范围为：2.5 μM-20 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖，且在浓度为20 μM时，在培养96h后对KYSE 150细胞的增殖抑制作用显著，在培养72h后对对KYSE450细胞的增殖抑制作用显著。

图4为盐酸苄达明抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成。其中，随着加药浓度增加克隆数显著降低，克隆明显变小，在浓度为10μM、20μM时，对KYSE150克隆形成抑制作用显著，在浓度为2.5μM、5μM、10μM、20μM时，对KYSE450克隆形成抑制作用显著。图4为相应组的克隆显微照片、对加药以及对照*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5至图8为盐酸苄达明在人食管癌PDX模型上对肿瘤的治疗效果。如图5所示，小鼠肿瘤图片可观察到高剂量盐酸苄达明 (50mg/kg)时组的肿瘤生长与对照组相比得到明显抑制。如图6所示，盐酸苄达明高剂量 (50mg/kg)组小鼠肿瘤重量下降。图7可观察到低剂量组(5mg/kg)、高剂量 (50mg/kg)盐酸苄达明组的肿瘤体积和对照组相比得到更明显的抑制p<0.05。图8小鼠体重在各给药组无明显差异。由此得出，高剂量盐酸苄达明在食管癌PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果显著。

综上，通过细胞增殖实验，验证了盐酸苄达明在食管癌细胞系中的抑制效果。本发明首先通过细胞毒性实验，确定给药的安全浓度；再在食管癌细胞系中给予化合物盐酸苄达明处理，并在处理后的0h、 24h、48h、72h、96h检测细胞的增殖情况，确定该化合物盐酸苄达明对食管癌细胞系有抑制作用。通过软琼脂克隆形成实验，表明盐酸苄达明能够抑制食管鳞癌KYSE150，KYSE450细胞的克隆的形成。在食管癌PDX模型中，盐酸苄达明对食管癌移植瘤小鼠有显著肿瘤治疗效果，为临床研究预防和治疗，预防复发，食管癌等肿瘤及其他肿瘤药物提供帮助。

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。