两种苯乙醇苷类化合物在制备抗糖尿病药物中的应用
阅读说明：本技术 两种苯乙醇苷类化合物在制备抗糖尿病药物中的应用 (Application of two phenylethanoid glycoside compounds in preparation of antidiabetic drugs ) 是由 李旻辉 张春红 吕丽娟 张明旭 李雪 石如玉 蒋林林 臧二欢 于 2020-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了两种苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在制备抗糖尿病药物中的应用。毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷单体化合物可以从多种植物中提取得到,来源广泛,低毒,稳定性好。发明人经实验验证,1)毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷能够保护、修复由四氧嘧啶引起的NIT-1胰岛β细胞损伤,剂量依赖性地促进受损胰岛β细胞的胰岛素分泌；2)可降低四氧嘧啶导致胰岛β细胞的自由基损伤；3)能够增强胰岛细胞活性,提高细胞存活率,其机制可能为激活凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的转录并抑制凋亡促进基因Bax mRNA的转录,最终抑制Caspase-3基因的转录及Caspase-3、Bax蛋白的表达,从而抑制四氧嘧啶损伤胰岛细胞的凋亡。因此,本发明中的两种苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷具有开发成为抗糖尿病候选药物的潜在价值。(The invention discloses application of verbascoside and isoverbascoside of two phenylethanoid glycosides compounds in preparing antidiabetic drugs. The monomeric compounds of acteoside and isoacteoside can be extracted from various plants, and have wide sources, low toxicity and good stability. The inventor is verified by experiments, 1) verbascoside and isoverbascoside can protect and repair NIT-1 islet beta cell injury caused by alloxan, and can promote insulin secretion of injured islet beta cells in a dose-dependent manner; 2) can reduce the free radical damage of islet beta cells caused by alloxan; 3) can enhance the activity of islet cells and improve the survival rate of the cells, and the mechanism of the method can be activating the transcription of apoptosis inhibiting gene Bcl-2mRNA and inhibiting the transcription of apoptosis promoting gene Bax mRNA, and finally inhibiting the transcription of Caspase-3 gene and the expression of Caspase-3 and Bax proteins, thereby inhibiting the apoptosis of islet cells damaged by alloxan. Therefore, the verbascoside and the isoverbascoside which are two phenylethanoid glycosides compounds in the invention have potential value in developing antidiabetic candidate drugs.)
技术领域
本发明属于医药应用技术领域，涉及两种苯乙醇苷类化合物在制备抗糖尿病药物中的应用，具体为毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在制备抗糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一种临床常见的由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病，严重危害人类的生命健康。其主要症状表现为人体对葡萄糖耐受能力降低以及脂类和蛋白质代谢紊乱。糖尿病会产生诸多并发症如视网膜病变、视神经系统病变，而且会增加患心血管疾病和中风的危险，一旦患病，终身服药，给本人和家庭均带来沉重的负担。近年来，随着城市化的发展，人们生活方式的改变，人口老龄化，人群肥胖患病率的增加，糖尿病发病率不断攀高，但是在目前的医疗水平下糖尿病尚无法根治，因此糖尿病治疗药物的研究发展引起社会的广泛关注。
胰岛β细胞是一类可以分泌胰岛素从而起到降低血糖作用的细胞。研究发现，一般在确诊糖尿病时，患者胰岛细胞功能仅为正常状态的50％。随着疾病进一步发展，在胰岛β细胞功能衰退后随之而来的是血糖控制的难度及成本的逐渐增加，患者更容易出现各种急、慢性并发症。目前的治疗方案多集中在血糖达标、在胰岛功能不断下降的基础上使其速度延缓。因此，保护和修复胰岛β细胞损伤是一种治疗糖尿病的有效手段。
化合物毛蕊花糖苷异毛蕊花糖苷同为苯乙醇苷类化合物，两个化合物的化学结构式分别如式1和式2所示：
目前，前述两个化合物的活性研究主要集中在抗炎、抗癌、抗衰老等其他方面，关于其是否具有保护、修复胰岛β细胞损伤，且其具体的作用的具体机制尚不清晰；也就是说，能否将这两个化合物开发成保护、修复胰岛β细胞损伤药物，促进受损胰岛β细胞的胰岛素分泌，降低四氧嘧啶导致胰岛β细胞的自由基损伤，增强胰岛细胞活性，提高细胞存活率的药物，在本领域中尚属研究空白。
发明内容
本发明旨在提供两种苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在制备保护、修复胰岛β细胞损伤，促进受损胰岛β细胞的胰岛素分泌；降低四氧嘧啶导致胰岛β细胞的自由基损伤；能够增强胰岛细胞活性，提高细胞存活率(其机制可能为激活凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的转录并抑制凋亡促进基因Bax mRNA的转录，最终抑制Caspase-3基因的转录及Caspase-3、Bax蛋白的表达，从而抑制四氧嘧啶损伤胰岛细胞凋亡的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
两种苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在抗糖尿病方面的应用，所述化合物毛蕊花糖苷(英文名称：Verbascoside)，分子式为C29H36O15，分子量为624.59，结构式如式1所示，化合物异毛蕊花糖苷(英文名称：Isoacteoside)，分子式为C29H36O15，分子量为624.59，结构式如式2所示：
优选的，前述的保护、修复胰岛β细胞损伤药物，促进受损胰岛β细胞的胰岛素分泌；可降低四氧嘧啶导致胰岛β细胞的自由基损伤；能够增强胰岛细胞活性，提高细胞存活率(机制可能为激活凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的转录并抑制凋亡促进基因Bax mRNA的转录，最终抑制Caspase-3基因的转录及Caspase-3、Bax蛋白的表达，从而抑制四氧嘧啶损伤胰岛细胞的凋亡)为抗糖尿病药物。
药物组合物在制备保护、修复胰岛β细胞损伤药物促进受损胰岛β细胞的胰岛素分泌；可降低四氧嘧啶导致胰岛β细胞的自由基损伤；能够增强胰岛细胞活性，提高细胞存活率(机制可能为激活凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的转录并抑制凋亡促进基因Bax mRNA的转录，最终抑制Caspase-3基因的转录及Caspase-3、Bax蛋白的表达，从而抑制四氧嘧啶损伤胰岛细胞的凋亡)的药物中的应用，所述药物组合物中含有有效量的如前所述的化合物或其药用盐(即含有式1和/或式2的化合物或其药用盐)。本发明所指的药用盐，是指具有药学上可接受的盐，有一定的药用价值。
优选的，药物组合物的剂型包括片剂、粉剂、混悬剂、胶囊剂、丸剂或糖浆。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷属于苯乙醇苷类化合物，其单体化合物可以从多种植物中提取得到，来源广泛，低毒，稳定性好。本发明通过大量研究和试验，首次公开了毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷能够保护、修复四氧嘧啶引起的NIT-1胰岛β细胞损伤，促进受损胰岛β细胞的胰岛素分泌；可降低四氧嘧啶导致胰岛β细胞的自由基损伤；能够增强胰岛细胞活性，提高细胞存活率(机制可能为激活凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的转录并抑制凋亡促进基因Bax mRNA的转录，最终抑制Caspase-3基因的转录及Caspase-3、Bax蛋白的表达，从而抑制四氧嘧啶损伤胰岛细胞的凋亡)，效果显著。因此，本发明中的两种苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷具有开发成为抗糖尿病候选药物的潜在价值。
附图说明
图1毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对正常NIT-1胰岛β细胞生长情况的影响；其中(A)：毛蕊花糖苷，(B)：异毛蕊花糖苷。
图2毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1胰岛β细胞损伤的保护、修复作用；其中(A)：毛蕊花糖苷，(B)：异毛蕊花糖苷。与空白对照组比较，***表示P＜0.001。与模型组比较，###表示P＜0.001；&表示P＜0.5，&&表示P＜0.01，&&&表示P＜0.001。
图3毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞胰岛素分泌的影响。与正常对照组比较，***表示P＜0.001。与模型组比较，###表示P＜0.001；&表示P＜0.05，&&表示P＜0.01，&&&表示P＜0.001。
图4毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞SOD活性的影响。与正常对照组比较，***表示P＜0.001。与模型组比较，###表示P＜0.001；&表示P＜0.05，&&表示P＜0.01，&&&表示P＜0.001。
图5毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞MDA含量的影响。与正常对照组比较，***表示P＜0.001。与模型组比较，###表示P＜0.001；&表示P＜0.05，&&表示P＜0.01，&&&表示P＜0.001。
图6毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2mRNA表达的影响；其中(A)mRNA Caspase-3/GAPDH；(B)mRNA Bax/GAPDH；(C)mRNA Bcl-2/GAPDH)。***表示P＜0.001。与模型组比较，&&&表示P＜0.001；#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，###表示P＜0.001。
图7(a)毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响；其中(A)Caspase-3/β-Actin；(B)Bax/β-Actin；(C)Bcl-2/β-Actin。
图7(b)Western blot检测各组NIT-1细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1：化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的制备方法
1.1植物来源
本实验毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷均提取自玄参科(Scrophulariaceae)芯芭属(Cymbaria L.)的植物达乌里芯芭(Cymbaria daurica L.)中，达乌里芯芭于2018年6月下旬采自内蒙古自治区锡林郭勒盟东乌珠穆沁旗贺斯格乌拉农牧场马希拉哈达，由包头医学院生药教研室张春红教授鉴定为玄参科植物达乌里芯芭(Cymbaria daurica L.)。
1.2提取分离
1)称取干燥达乌里芯芭全草1450g，将其粉碎成中细粉(过四号筛)。采用加热回流法，用70％乙醇提取1h(物料比1∶10)。静置冷却后过滤提取液。按照上述方法反复提取3次。合并提取液，使用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得到醇提取物粗浸膏362.5g。
2)将醇提取物粗浸膏加水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，各部分萃取液分别用旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏，最终得到石油醚部位浸膏55.91g，乙酸乙酯部位浸膏21.47g，正丁醇部位浸膏110.77g和水部位浸膏174.26g。
3)配备溶剂系统时将乙酸乙酯、正丁醇和超纯水按照体积比4∶1∶5的比例充分混合，并在分液漏斗中静置分层后，取上相作为固定相，下相为流动相。将固定相和流动相分别超声15min备用。称取2)中所得正丁醇浸膏样品101.3mg溶解在10mL下相中，经0.45μm微滤膜过滤后备用。
4)高速离心分配色谱仪设置为降相模式，以10mL/min的流速和转速500r/min将固定相泵如色谱柱中；12min后，调节流速为3mL/min，转速为1500r/min后再注入流动相，18min达到平衡状态。
5)将步骤2)所得样品由进样阀注入。高速离心分配色谱仪器设定运转时间90min，用紫外检测器在320nm波长下检测，自动收集到样品管中(每管10mL)。经高效液相色谱法(HPLC)鉴定后，将组分相同部分进行合并。合并后的组分重复上述操作，最终将合并液进行减压浓缩至干，得到毛蕊花糖苷4.41mg和异毛蕊花糖苷0.89mg，经HPLC检测毛蕊花糖苷纯度为95.49％，异毛蕊花糖苷纯度为94.83％。
实施例2：化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导的NIT-1胰岛β细胞损伤的保护、修复作用
2.1实验细胞
NIT-1细胞：小鼠NIT-1胰岛素瘤β细胞株购自通派(上海)生物科技有限公司。
2.2仪器与试剂
1640培养基、胎牛血清、青-链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25％胰蛋白酶(美国Gibco公司)；DMSO(海克隆生物化学制品(北京)有限公司)；罗格列酮(美国sigma公司)；MTT粉末、四氧嘧啶。Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪(Thermo公司)；HHS21-8电热恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂)；十万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。
2.3实验方法
1)NIT-1胰岛β细胞培养
将NIT-1胰岛β细胞置于含10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的RPMI1640培养基，置于37℃含5％CO2的潮湿空气中常规培养。倒置显微镜下观察细胞生长状况。
2)四氧嘧啶损伤模型的建立
将培养至对数生长期的NIT-1胰岛β细胞用消化液消化制成单细胞悬液，以1×105个/mL的细胞密度接种于96孔培养板，培养24h细胞贴壁后，随机分为空白对照组、四氧嘧啶损伤模型组(ALX组)，每组设5个平行孔，ALX组中四氧嘧啶的终浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM，结合四氧嘧啶的半衰期及实验设计的时间梯度，以24h为其损伤时间。每孔加入新配制的5mg/mL MTT溶液10μL，37℃避光孵育4h，终止培养。弃去上清液，每孔加入DMSO150μL，振荡10min后，用酶标仪检测各孔的吸光度值(OD 570nm)，并计算半数抑制率IC50值为12.057Mm，故选择12mM为最佳损伤模型浓度进行后续实验。
3)毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对正常NIT-1胰岛β细胞生长情况的影响
NIT-1细胞按1×105个/mL接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入系列浓度(6.25、12.5、25、50、100μM)的毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷。同时设空白对照组，每组设置5个平行孔，培养48h后，用MTT法根据公式：细胞存活率＝(药物孔OD值-本底对照孔OD值)/(对照细胞孔OD值-本底对照孔OD值)×100％计算细胞存活率。
根据图1所示，与空白组相比，毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在6.25、12.5、25、50、100μM浓度下对NIT-1胰岛β细胞的增殖无显著性差异(P＞0.05)，说明毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在实验浓度范围内对NIT-1胰岛β细胞的生长均无毒性。
4)毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1胰岛β细胞损伤的保护作用
取对数生长期NIT-1胰岛β细胞，按1×105个/mL接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，实验分组及处理如下：①空白对照组：不做任何处理，正常培养24h；②四氧嘧啶模型组(ALX)：12mM ALX损伤细胞24h；③试验组：分别加入系列浓度(6.25、12.5、25、50、100μM)的毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷预处理4h后加入12mM ALX损伤细胞24h。④阳性药组：加入10μM罗格列酮预处理4h后加入12mM ALX损伤细胞24h。每组设置5个平行孔。培养24h后，用MTT法检测细胞存活率。
根据图2所示，与模型组相比，毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷在实验浓度范围内能显著改善四氧嘧啶诱导的NIT-1胰岛β细胞损伤(P＜0.05)，且毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷在50μM浓度下与阳性对照药罗格列酮相比无显著差异(P＞0.05)。
实施例3：毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷抗糖尿病活性作用机制研究
3.1毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞胰岛素分泌的影响
取对数生长期NIT-1细胞，按1×105个/mL接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，实验分组及处理如下：①正常对照组：不做任何处理，正常培养24h；②四氧嘧啶模型组(ALX)：12mmol/L ALX损伤细胞24h；③阳性对照组：加入10μmol/L的罗格列酮预处理4h后加入12mmol/L ALX损伤细胞24h；④药物处理组：分别加入系列浓度(6.25μmol/L、25μmol/L、100μmol/L)的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷预处理4h后加入12mmol/L ALX损伤细胞24h。培养24h后收集上清液保存于-80℃冰箱，待用。用大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素含量。
与模型组相比，毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷预处理后，NIT-1细胞的胰岛素分泌升高(P＜0.05)，并且表现出一定的浓度依赖性，且毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷在100μmol/L浓度下与阳性对照组罗格列酮相比无显著差异(P＞0.05)。
3.2毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞SOD活性的影响
取对数生长期NIT-1细胞，按1×105个/mL接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，按3.1分组及处理培养24h后，收集细胞，1200r/min，离心5min，弃去上清。细胞沉淀再加1mL PBS轻轻吹打，再次1200r/min，离心5min。弃上清，沉淀加RIPA裂解液30min待测。按照南京建成SOD测试盒说明书检测，同时按照BCA试剂盒说明书测定各组样品蛋白浓度，用于计算SOD活力。
与模型组相比，毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷预处理后，SOD活性显著增强(P＜0.05)，并且表现出一定的浓度依赖性，毛蕊花糖苷在100μmol/L浓度下与阳性对照组罗格列酮相比无显著差异(P＞0.05)。
3.3毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞MDA含量影响
取对数生长期NIT-1细胞，按1×105个/mL接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，按3.1分组及处理培养24h后，收集细胞，1200r/min，离心5min，弃去上清。细胞沉淀再加1mL PBS轻轻吹打，再次1200r/min，离心5min。弃上清。按照南京建成MDA测试盒说明书检测，同时按照BCA试剂盒说明书测定各组样品蛋白浓度，用于计算MDA含量。
与模型组相比，经过不同浓度(6.25μmol/L、25μmol/L、100μmol/L)的毛蕊花糖苷、(25μmol/L、100μmol/L)异毛蕊花糖苷预处理后，MDA含量显著降低(P＜0.05)，并且表现出一定的浓度依赖性，随着毛蕊花糖苷及异毛蕊花糖苷浓度的增大，清除自由基作用增强。毛蕊花糖苷及异毛蕊花糖苷在100μmol/L浓度下与阳性对照组罗格列酮相比无显著差异(P＞0.05)。
3.4毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2mRNA表达的影响
(1)总RNA提取
①NIT-1细胞分组及处理培养24h后，弃去细胞培养瓶中旧的培养基，用PBS缓冲液清洗2次，加入1mL Trizol试剂，反复吹打以裂解细胞。室温放置6min，12000r/min，4℃离心10min。
②将上清液转移到新的EP管中，加入120μL氯仿溶液，剧烈震荡15s。待溶液充分乳化后，室温放置10min，7500r/min，4℃离心15min。离心后，混合物分离为上层无色水相，中间相以及下层红色相。RNA存在于水相(尽量避免吸到中间的蛋白膜影响之后的实验)。
③将水相转移到新的EP管中。加300μL异丙醇从水相中沉淀RNA，室温放置10min，7500r/min，4℃离心10min。离心后，细胞RNA会出现在管的侧壁或管底，由于为白色所以离心之前不可见。
④弃去上清液，沿EP管壁加入1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀1次。轻轻上下颠覆，涡旋混合，12000r/min，4℃离心10min。
⑤洗涤完成后，弃去上清，在室温下干燥3-5min(时间不能太长，以防RNA沉淀彻底干燥，大大降低其溶解度，影响后期实验检测)。加入无酶的水，吹打几次溶解RNA沉淀。置于-80℃冰箱保存备用。
(2)RNA定量
取RNA样品1μL，利用核酸蛋白测定仪检测RNA纯度。RNA纯度(OD260/OD280＝1.8-2)在区间内说明制备的RNA较纯，没有蛋白质污染。
(3)cDNA合成
按照RT-PCR试剂盒的说明进行操作。
①去除基因组DNA
冰上配制反应混合液，室温放置30min。
②反转录体系
冰上配制反应液上一步反应液10mL。反转录反应条件：37℃15min，85℃5s。然后4℃保存。
(4)荧光定量检测扩增条件
反应体系为20μL，扩增条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。引物信息见表12。PCR仪自主收集待测基因Caspase-3、Bax、Bcl-2及内参GAPDH扩增过程中每个循环的荧光信号，Ct值是荧光信号达到设定阈值经历的循环次数，采用比较Ct(ΔΔCt)法进行结果处理，计算的公式为：2-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct管家基因)加药组-(Ct目的基因-Ct管家基因)空白对照组。
表1引物设计表
与四氧嘧啶组相比，经过不同浓度(6.25μmol/L、25μmol/L、100μmol/L)的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷处理后，Caspase-3mRNA的表达量随浓度的增加显著下降(P＜0.05)，说明毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷可以显著降低四氧嘧啶引起的Caspase-3 mRNA表达量升高；与正常对照组相比，四氧嘧啶组的Bax mRNA表达量显著升高(P＜0.05)。与四氧嘧啶组相比，经过不同浓度(6.25μmol/L、25μmol/L、100μmol/L)的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷处理后，Bax mRNA的表达量随浓度的增加显著下降(P＜0.05)，说明毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷可以显著降低四氧嘧啶引起的Bax mRNA表达量升高；与正常对照组相比，四氧嘧啶组的Bcl-2 mRNA表达量显著降低(P＜0.05)。与四氧嘧啶组相比，毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的Bcl-2 mRNA表达随浓度增加呈剂量依赖性升高(P＜0.05)，说明毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷在一定程度上可以逆转四氧嘧啶引起的Bcl-2 mRNA的表达量下降。
3.5毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响
(1)抽提总蛋白及蛋白浓度测定
①NIT-1细胞分组及处理培养24h后，弃去细胞培养瓶中旧的培养基，用PBS缓冲液清洗2次。
②用细胞刮刮取细胞至培养板一侧，加适量RIPA细胞裂解液，根据使用量，取每1mLRIPA加入10μLPMSF，冰上裂解1.5h。
③12000r/min，离心5min，并将上清液转移到干净的EP管中。
④按照BCA试剂盒说明书测定各组样品蛋白浓度。根据所测值数据绘制标准曲线图，并根据标准曲线计算出每组样品蛋白浓度，记录。
⑤计算出各组蛋白的浓度后，用RIPA统一样品浓度，加入4×上样缓冲液，置0于PCR仪中，98℃，3min，使蛋白质完全变性，完毕后离心，置冰上待其降温后，能立刻上样进行实验也可放入-80℃冰箱，备用。
(2)Western blot
①按照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书配制12％分离胶及5％浓缩胶。
②从超低温冰箱中取出配制好的蛋白样品，置于冰上解冻。按照一定的顺序，将蛋白样品加到配制好的胶孔中，并在其中一个孔中加入maker，记录。
③开启电泳仪，浓缩胶80V(30min)，分离胶120V(80min)。
④断开电泳仪电源，将胶取出，将凝胶按照所需切割成合适的大小，将切好的胶放入转膜液中进行转膜，根据配制胶的大小和所需目的条带的宽度裁剪出合适大小的PVDF膜(提前浸泡于甲醇中15min)。先铺一层加厚滤纸，把胶铺在放好的滤纸上，然后在膜上用笔做好标记。倾倒少量转膜液，再铺一张加厚滤纸(赶去胶和膜之间的气泡，避免转膜受影响)。整体转移到半干转印槽中，接通电泳仪电源，调节电泳仪参数电流至320mA，转膜15min。
⑤转膜完成后，断开电源，取出PVDF膜，放入配制好的封闭液中，室温下摇床振荡4h。
⑥封闭完成后，根据需求将孵育好的PVDF膜置于一抗中，并在4℃孵育过夜。
⑦取出PVDF膜用1×TBST洗涤3次，每次10min。
⑧将清洗好的PVDF膜置于二抗中孵育1.5h，1×TBST洗涤3次，每次10min。
⑨清洗好后条带加ECL发光液显影，用Bio-Rad凝胶成像系统分析结果。
与正常对照组相比，四氧嘧啶组的Caspase-3蛋白表达量显著升高(P＜0.05)。与四氧嘧啶组相比，经过不同浓度(6.25μmol/L、25μmol/L、100μmol/L)的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷处理后，Caspase-3的蛋白表达量随浓度的增加显著下降(P＜0.05)；与正常对照组相比，四氧嘧啶组的Bax蛋白表达量显著升高(P＜0.05)。与四氧嘧啶组相比，经过不同浓度(6.25μmol/L、25μmol/L、100μmol/L)的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷处理后，Bax的蛋白表达量随浓度的增加显著下降(P＜0.05)；与正常对照组相比，四氧嘧啶组的Bcl-2蛋白表达量显著降低(P＜0.05)。与四氧嘧啶组相比，经过不同浓度(6.25μmol/L、25μmol/L、100μmol/L)的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷处理后的Bcl-2蛋白表达随浓度增加呈剂量依赖性升高(P＜0.05)。