植物霸王鞭中分离的天然产物在逆转肿瘤多药耐药中的应用
阅读说明：本技术 植物霸王鞭中分离的天然产物在逆转肿瘤多药耐药中的应用 (Application of natural product separated from plant pitaya in reversing tumor multidrug resistance ) 是由 马永钢 杨文根 郭晗 于 2021-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,提供了植物霸王鞭中所含的的天然产物BWB74-5-5的一种新用途,具体为在抗肿瘤多药耐药方面的应用。本发明涉及从火殃勒的肉质茎中提取的萜类天然产物具有逆转肿瘤的多药耐药作用,可以作为一种辅助性药物用于肿瘤药物治疗中。本发明通过多项实验证实BWB74-5-5具有较高的逆转多药耐药的作用。有望开发为新型的特异性针对多药耐药肿瘤的逆转剂药物。(The invention belongs to the technical field of medicines, and provides a new application of a natural product BWB74-5-5 contained in a plant proresults penis et testis reyi, in particular to an application in the aspect of anti-tumor multi-drug resistance. The invention relates to a terpenoid natural product extracted from fleshy stem of euphorbia tirucalli has the effect of reversing multidrug resistance of tumors, and can be used as an auxiliary drug for tumor drug treatment. A plurality of experiments prove that BWB74-5-5 has higher effect of reversing multidrug resistance. Is expected to be developed into a novel reversal agent medicine with specificity aiming at the multidrug resistant tumor.)
技术领域
本发明是从植物霸王鞭中提取的具有逆转肿瘤多药耐药的天然产物BWB74-5-5，能够提高化疗药物在细胞内的浓度，从而增强癌细胞对化疗药物的敏感性，提高肿瘤化疗的药效，因此在抗肿瘤方面有很好的辅助作用。
背景技术
肿瘤的多药耐药是肿患者化疗失败的一个重要原因，肿瘤细胞的耐药性极大地降低了化疗药的效果。多药耐药的发生是肿瘤细胞内部多种因素相互作用的结果，而主要的机制是肿瘤细胞内ABC转运蛋白高表达将药物排出细胞外。因此寻找高效低毒的的多药耐药逆转剂来提高肿瘤治疗的效果是非常有必要的。
ABC转运蛋白家族是一大类跨膜蛋白，通常有两个跨膜结构域和两个ATP结合结构域组成，主要功能是结合底物分子，水解ATP，导致蛋白结构的改变，从而将药物从细胞内运输到细胞外，降低药物在细胞内的有效浓度不能起到治疗的作用。在ABC大家族中，MRPs蛋白、MDR1蛋白、BCRP蛋白在肿瘤细胞的多药耐药性的形成中起到了重要的作用。MDR1蛋白是第一个被发现以及研究最广泛的ABC转运蛋白，当化疗药物与肿瘤细胞接触时，药物进入细胞后与MDR1结合，ATP水解，MDR1的构像发生变化。从而将药物排出细胞外。MRP1是1992年cole等在人小细胞肺癌H69AR耐药细胞系中发现的一种ABC转运蛋白家族成员，也能够将药物排出细胞的功能，与MDR1在分子结构上具有一定的序列同源性。但是MRP1不能够独立的转运没有修饰的化疗药物，却能够转运与谷胱甘肽结合的药物。BCRP是在1998年发现的ABC转运蛋白大家族的一种与肿瘤耐药相关的蛋白。与多数ABC转运蛋白不同，BCRP需形成二聚体发挥作用。在研究中发现，很多肿瘤细胞中都有BCRP的高表达。
面对肿瘤的多药耐药，应用多药耐药逆转剂是解决肿瘤多药耐药的重要手段，目前已经发现大量具有多药耐药逆转活性的化合物。第一代逆转剂主要是通过直接抑制MDR1蛋白外排作用来。主要有维拉帕米、环孢菌素A，它们都是通过与药物的竞争性结合在底物的结合位点，达到逆转转运蛋白的外排，由于它们需要较高剂量才能达到良好的效果，然而高剂量对人体产生较大的毒副作用，因此使他们很难在临床上获得应用。第二代逆转剂有右旋维拉帕米、右旋尼古地平、伐司扑达(PSC833)，其中研究最多的就是PSC833,然而PSC833在临床阶段与抗肿瘤药物共同使用时容易引发多种并发症，产生一些难以预测的不良后果。第三代逆转剂是通过利用构效关系和组合化学的方法克服第二代逆转剂的限制性，从而更有效的抑制MDR1的功能。
很多的天然产物能够表现出具有逆转ABC转运蛋白介导的多药耐药现象如植物多酚、姜黄素等。我们从霸王鞭的茎中提取的霸王鞭BWB74-5-5通过药理学实验和逆转实验外排实验，发现BWB74-5-5能够逆转肿瘤的多药耐药。
发明内容
本发明的第一个目的在于BWB74-5-5能够逆转肿瘤的多药耐药。
本发明进一步公开，BWB74-5-5能够增加化疗药在细胞内的积累。
本发明更进一步公开BWB74-5-5对MDR1蛋白表达的影响。
附图说明
:图1 BWB74-5-5结构式；
图2 为BWB74-5-5和Verapamil联合盐酸阿霉素对hela/ddp的毒性试验图；
图3 为BWB74-5-5和Verapamil联合盐酸米托蒽醌对hela/ddp的毒性试验图；
图4 为BWB74-5-5增加盐酸阿霉素在细胞内积累的试验图；
图5 为BWB74-5-5增加盐米托蒽醌在细胞内积累的试验图；
图6 为BWB74-5-5对MDR1蛋白外排功能的影响试验图；
图7 为BWB74-5-5的浓度对ABCB1转录水平影响的试验图；
图8为BWB74-5-5作用的时间对ABCB1转录水平影响的试验图；
具体实施方式
药理实验一：BWB74-5-5的逆转实验
原理：
BWB74-5-5能够增强盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌在细胞的浓度，从而降低阿霉素和盐酸米托蒽醌对hela/ddp的IC50
方法：如上述细胞毒性的方式对hela/dpp细胞进行铺板，在加入待测药物时分别和 5μM和10μM的BWB74-5-5联用。
实验结果：
如下表，可见，BWB74-5-5可以增加抗癌药盐酸阿霉素对耐药细胞hela/ddp的药物毒性，而且BWB74-5-5的工作浓度与其逆转作用呈正相关。
BWB74-5-5可以增加抗癌药盐酸米托蒽醌对耐药细胞hela/ddp的药物毒性，而且BWB74-5-5的工作浓度与其逆转作用呈正相关。
药理实验二BWB74-5-5对MDR1蛋白外排功能的影响
原理：
BWB74-5-5对MDR1蛋白外排功能的影响可以改变相应的荧光染料在细胞内的荧光强度。
方法：
(1)将hela和hela/dpp细胞以密度以密度为1X104/孔接种到96孔板，每孔体积为200μL，设置96三个复，96孔板的四周一圈加灭菌的蒸馏水。把96孔板放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养96h。
(2)将逆转剂标准品Verapamil配置成2mM,染料Rhodamine123配制成50ug/ml，待测样品BWB74-5-5配制成2.5mM。
(3)标准品和待测样品BWB74-5-5加入后放入37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育15min。
(4)15min后加入荧光染料孵育4h；每个样品设置三个复孔。
(5)将96孔板从培养箱中拿出，每孔用200μL冷的PBS洗两遍，弃去PBS,在全波长多功能酶标仪上检测。
(6)Rho123激发波长为480nm,发射波长为550nm；检测MDR1蛋白的Rh0123荧光染料最终浓度为2ug/ml，标准品Verapamil的最终浓度为10μM,待测样品 BWB74-5-5的浓度分别是5μM和10μM。
实验结果：
BWB74-5-5能够增加染料Rho123在细胞内的积累量，HYL1005-2在10μM的浓度下Rho123在细胞内的荧光强度比在5μM浓度下的荧光强度强。但是在同一浓度10μM下，在细胞内Rho123的荧光强度BWB74-5-5比Verapamil的荧光强度强。说明BWB74-5-5 对荧光染料在细胞内的积累量呈浓度依赖性。
药理实验三：BWB74-5-5对盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌在细胞内的积累量的影响
原理：BWB74-5-5对ABC转运蛋白的作用影响对盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌的外排作用
方法：
(1)将hela和hela/dpp细胞以密度以密度为1X104/孔接种到96孔板，每孔体积为200μL，设置96三个复，96孔板的四周一圈加灭菌的蒸馏水。把96孔板放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养96h。
(2)将逆转剂标准品Verapamil配置成2mM,盐酸阿霉素配制成0.1Mm逆转剂标准品Ko143配制成2Mm，盐酸米托蒽醌配制成100ug/ml。待测样品BWB74-5-5配制成2.5mM。
(3)标准品和待测样品BWB74-5-5加入后放入37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育90min。
(4)90min后加入荧光染料孵育4h；每个样品设置三个复孔。
(5)将96孔板从培养箱中拿出，每孔用200μL冷的PBS洗两遍，弃去PBS,在全波长多功能酶标仪上检测。
(6)盐酸阿霉素激发波长为480nm,发射波长为550nm，最终浓度为1μM，标准品Verapamil的最终浓度为10μM,待测样品BWB74-5-5的浓度分别是5μM和10 μM。
盐酸米托蒽醌激发波长为600nm,发射波长为680nm；最终使用浓度是1ug/ml，标准品Verapamil的最终浓度为10μM,BWB74-5-5的最终浓度分别是5μM和 10μM。
实验结果:BWB74-5-5能够增加盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌在细胞内的积累量，并且高浓度的BWB74-5-5比低浓度BWB74-5-5细胞内的盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌的积累量要高。
药理实验四：BWB74-5-5对ABCB1表达水平的影响
方法：
1细胞总RNA提取
(1)配1‰浓度(V/V)固相RNase清除剂，并用配好的RNase清除剂分别擦拭移液器、超净工作台台面等。用紫外灯照射超净台30min，并预冷高速离心机。
(2)1000rpm 3min离心，弃上清，收集细胞。加入1mL TRIzol试剂，用1mL 移液枪多次吹打，使细胞全部裂解，得到细胞裂解液。
(3)多次吹打后，在超净台上室温放置5min，等待核酸和蛋白充分解离。在按每用1mL Trizol试剂加进去0.2mL三氯甲烷的比例，盖紧管盖，手动剧烈震荡15s 钟左右，在超净台中室温静置3min。
(4)4℃12000rpm 15min，离心后，小心离心管，放在冰上，并转移到超净台中。
(5)用200μL移液枪小心吸取400-500μL上层无色水相(若少可以少吸)转移到新的1.5mL无酶离心管中。吸取时枪头触碰DNA和蛋白杂质中间层(中间层，白色)。
(6)加入所吸取水相一样体积，并提前预冷的异丙醇，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀。冰上静置10min。
(7)4℃12000rpm离心10min，使RNA沉淀到离心管底部。
(8)弃上清，去上清时候注意不要把RNA也倒掉，每管加入1mL提前预冷用无酶水配置的75％乙醇洗涤两次，用移液器轻轻吹打，以去除残留的异丙醇和盐份。4℃， 12000rpm离心5min。
(9)用移液枪可以吸取上清，将RNA沉淀干燥(室温挥发或真空干燥)。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则难以看见，并且难以溶解。
(10)将RNA沉淀溶解于适量(10～40μL)的RNase-free water中。此RNA溶液可用于进一步实验，或者-80℃保存。
2RNA逆转录成cDNA
(1)取2μL RNA溶液用RNase-free water稀释50倍，用eppendorf BioPhotometerplus仪测定RNA样品的浓度及纯度。
(2)计算500ng RNA所需的体积，加2μL的4×Gdna wiper Mix，并用RNase-freewater补足至8mL。用移液器轻轻吹打，42℃温育2min，除去模板RNA中的基因组 DNA。
(3)在上一步的反应管中直接加入2μL 5×HiScript ll qRT SuperMix ll用移液器轻轻吹打混匀。
(4)全部加完后，25℃，10min。
(5)50℃反应30min进行逆转录。
(6)85℃，5min使反转录酶失活。
(7)第一链cDNA储存于-20℃备用。
3Real-Time PCR
下表合成Real-time PCR所需引物。
表Real-Time PCR引物表
(4)建立10μL反应体系
(5)设置Real-Time PCR反应条件
2.2.5.4结果分析
本实验的目的是比较分析Jurkat细胞中某些基因转录水平的相对于对照的变化，所以采用2-△△Ct法。这种分析的方法可以直截了当的计算出对照组和实验组之间同一基因mRNA的表达倍数关系；管家基因GAPDH作为内参，对数值进行校正，减少误差。
倍数关系(实验组/对照组)＝2-[(Ct目的基因-Ct内参)实验组-(Ct目的基因-Ct内参)对照组。
实验结果：
BWB74-5-5在2.5μM和52.5μM浓度下处理hela/ddp对ABCB1的转录没有影响。在10μM浓度下对ABCB1的转录有较弱的下调作用，在10μM浓度下分别处理hela/ddp 24h、48h、72hBWB74-5-5对ABCB1的转录没有影响。
综上所述，通过细胞毒性试验，荧光外排实验证实BWB74-5-5对hela和hela/ddp的毒性很小,并且能够增加盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌在细胞内的积累量，是一个很好的辅助性药物在抗癌的过程中。为了更好地治疗肿瘤患者，努力开拓高效，无毒副作用的多药耐药逆转剂显得尤为重要。药理学和药效学研究结果表明，BWB74-5-5具有较好的逆转作用，与其他化疗药物联合使用能够很好的治疗肿瘤，起效快，维持时间长，能够抑制肿瘤细胞的外排作用，从而提高肿瘤治疗的效果。