芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂及制备方法与应用
阅读说明：本技术 芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂及制备方法与应用 (Fenton metal ion doped metal-organic framework material solidified oxidative metabolism enzyme nano diagnosis and treatment agent, preparation method and application ) 是由 黄鹏 付连花 漆超 何津 林静 于 2021-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂及制备方法与应用。所述纳米诊疗剂包括：芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架、固化在所述芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架上的氧化代谢酶。本发明纳米诊疗剂易降解,具有pH及谷胱甘肽响应的特点,能够在肿瘤部位释放氧化代谢酶,干扰肿瘤能量代谢；而释放出的芬顿金属离子在肿瘤微环境下具有芬顿反应的特点,能够分解肿瘤部位的H-(2)O-(2)产生强氧化性的羟基自由基,增强肿瘤代谢治疗效果。本发明的纳米诊疗剂具有良好的分散性和均匀的尺寸,将氧化代谢酶固化在芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架载体中,可以有效避免直接暴露导致的体内不稳定及血液毒性等问题。(The invention discloses a Fenton metal ion doped metal-organic framework material immobilized oxidative metabolism enzyme nano diagnosis and treatment agent, a preparation method and application. The nano diagnosis and treatment agent comprises: a Fenton metal ion doped metal-organic framework, an oxidative metabolizing enzyme immobilized on said Fenton metal ion doped metal-organic framework. The nano diagnosis and treatment agent is easy to degrade, has the characteristics of pH and glutathione response, and can release oxidative metabolism enzyme at a tumor part to interfere the energy metabolism of the tumor; the released Fenton metal ions have the characteristic of Fenton reaction in a tumor microenvironment and can decompose H at a tumor part 2 O 2 Generate hydroxyl free radical with strong oxidizing property, and enhance the treatment effect of tumor metabolism. The nano diagnosis and treatment agent has good dispersibility and uniform size, and the oxidative metabolism enzyme is solidified in the Fenton metal ion-doped metal-organic framework carrier, so that the problems of instability in vivo, blood toxicity and the like caused by direct exposure can be effectively avoided.)
技术领域
本发明涉及生物医学材料
技术领域
，尤其涉及芬顿金属离子掺杂的金属 -有机框架材料固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂及制备方法与应用。背景技术
生物体内参与氧化代谢的酶包括葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、凝血酶、 过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等，具有高的催化活性和良好的生物相容性， 已被开发用于多种疾病的治疗，尤其是通过干扰肿瘤代谢实现肿瘤治疗方 面。然而游离的酶类治疗剂在体内应用存在诸多问题，其血液循环半衰期 短、容易失活。部分酶类治疗剂还会造成全身毒性，例如葡萄糖氧化酶可 以催化血液中的葡萄糖降解产生H2O2，并降低血糖浓度；凝血酶会引发血管 内血栓形成并堵塞血管。因此不能直接将氧化代谢酶注入体内。
金属-有机框架(MOF)材料是以金属离子为连接点、有机配体支撑构 成空间三维延伸的配位聚合物。MOF材料具有独特的三维孔结构，是系沸石 和碳纳米管之外的又一类重要的新型多孔材料。近年来，生物相容且可降 解的MOF材料在生物医学领域受到了广泛的关注，多种生物医用MOF材料 被开发应用于药物输运、蛋白/酶的固定。通过MOF材料固定和输运酶类治 疗剂，可以有效避免其血液循环半衰期短、容易失活和体内毒性的缺陷。 目前，常用的生物医用MOF材料主要是锌基MOF材料如ZIF-8、ZIF-90等， 然而锌基MOF材料的功能较少，一般仅作为载体材料用于药物、蛋白/酶和 基因的输运。
因此，现有技术仍有待于改进和发展。
发明内容
发明人发现，与锌元素类似，锰、铜、铁、钴、铬、钨、铝、锶等元 素也是人体的微量元素，具有重要的生理作用并能参与人体的正常代谢； 同时锰离子、铜离子、铁离子、钴离子、铬离子、钨离子、铝离子和锶离 子还可以作为芬顿试剂，可以与肿瘤或炎症部位高浓度的H2O2反应生成活性 氧物质，从而提高治疗效果。因此，在肿瘤及相关疾病治疗方面，通过掺 杂上述金属离子(芬顿试剂)制备的MOF材料相比于常用的锌基MOF材料 具有更大的优势。并且，目前文献中未见有关尺寸均匀的芬顿试剂掺杂MOF 材料用于递送酶类治疗剂在生物医用领域应用的报道。
基于此，本发明的目的在于提供芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材 料固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂及制备方法与应用，旨在解决现有装载酶 类纳米诊疗剂存在血液毒性大、合成工艺复杂的问题。
本发明的技术方案如下：
一种芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化代谢酶的纳米 诊疗剂，其中，所述纳米诊疗剂包括：芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架、 固化在所述芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架上的氧化代谢酶。
可选地，所述芬顿金属离子选自锰离子、铜离子、铁离子、钴离子、 铬离子、钨离子、铝离子和锶离子中的一种或多种。
可选地，所述氧化代谢酶包括葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、凝血酶、 过氧化氢酶、超氧化物歧化酶中的一种或多种。
可选地，所述纳米诊疗剂具有六边形结构，所述纳米诊疗剂的尺寸均 匀，所述纳米诊疗剂的尺寸为10～500nm。
可选地，所述金属-有机框架为锌基MOF材料。
一种本发明所述的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化 代谢酶的纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
将氧化代谢酶与2-甲基咪唑溶于水中配成溶液A；
将锌盐和芬顿金属盐溶于水中配成溶液B；
在搅拌下将溶液B加入溶液A中，进行反应，得到所述纳米诊疗剂。
可选地，所述芬顿金属盐的摩尔浓度与锌盐的摩尔浓度比例为0.01～1： 1。
可选地，所述溶液A中，所述氧化代谢酶的浓度为0.01～5mg/mL。
可选地，所述在搅拌下将溶液B加入溶液A中，进行反应，得到所述 纳米诊疗剂的步骤，具体包括：在搅拌下将溶液B加入溶液A中，在室温 搅拌1min～2h，进行离心分离，得到所述纳米诊疗剂。
一种本发明所述的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化 代谢酶的纳米诊疗剂在制备肿瘤制剂中的应用。
一种本发明所述的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化 代谢酶的纳米诊疗剂用作药物或基因的输运载体。
有益效果：本发明提供一种芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固 化氧化代谢酶的纳米诊疗剂用于肿瘤代谢治疗，其中所述纳米诊疗剂包括 芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料以及固化在多孔的芬顿金属离子 掺杂的金属-有机框架上的氧化代谢酶。本发明提供的纳米诊疗剂易降解， 具有pH及谷胱甘肽响应的特点，能够在肿瘤部位释放氧化代谢酶，干扰肿 瘤能量代谢；而释放出的芬顿金属离子在肿瘤微环境下具有芬顿反应的特 点，能够分解肿瘤部位的H2O2产生强氧化性的羟基自由基，增强肿瘤代谢治 疗效果。本发明的纳米诊疗剂具有良好的分散性和均匀的尺寸，将氧化代 谢酶固化在芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架载体中，可以有效避免直接 暴露导致的体内不稳定及血液毒性等问题。本发明的纳米诊疗剂制备工艺 简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。本发明 纳米诊疗剂可作为药物、基因的输运载体，同时也可直接用作肿瘤代谢治 疗药物，在药物递送、基因转染、组织修复、肿瘤诊疗等领域将具有良好 的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的纳米诊疗剂的制备方法流程图；
图2为实施例1中样品的X射线(XRD)衍射图；
图3为实施例1中样品的透射电镜(TEM)照片(a)及扫描透射电子 显微镜(STEM)图片(b)；
图4为实施例1样品的pH及谷胱甘肽(GSH)响应Cu2+释放曲线；
图5为实施例1中样品的催化活性检测结果：采用(a)[email protected]+葡 萄糖(Glu)+谷胱甘肽(GSH)或(b)GOx-MnCaP+Glu与MB溶液反应不同 时间，MB溶液的紫外/可见吸收变化情况；(c)将0.5毫摩尔每升的TPA溶 液分别采用不同处理8小时之后溶液的荧光光谱图；(d)不同溶液中O2浓 度变化情况。[[email protected]]＝200μg/mL，[MB]＝5μg/mL，[GSH]＝10mM，[Glu]＝10mM；(e)采用JPBJ-608型便携式溶解氧测定仪(雷磁)检测溶 液中O2浓度变化图；
图6是实施例2中样品的TEM图片；
图7是实施例3中样品的TEM图片。
具体实施方式
本发明提供芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化代谢酶 的纳米诊疗剂及制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更 加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的 具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化 氧化代谢酶的纳米诊疗剂，其中，所述纳米诊疗剂包括：芬顿金属离子掺 杂的金属-有机框架、固化在所述芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架上的 氧化代谢酶。
本实施例提供一种芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化 代谢酶的纳米诊疗剂用于肿瘤代谢治疗，其中所述纳米诊疗剂包括芬顿金 属离子掺杂的金属-有机框架材料以及固化(结合)在多孔的芬顿金属离子 掺杂的金属-有机框架的孔内或表面的氧化代谢酶。本实施例提供的纳米诊 疗剂易降解，具有pH及谷胱甘肽响应的特点，能够在肿瘤部位释放氧化代 谢酶，干扰肿瘤能量代谢；而释放出的芬顿金属离子在肿瘤微环境下具有 芬顿反应的特点，能够分解肿瘤部位的H2O2产生强氧化性的羟基自由基，增 强肿瘤代谢治疗效果。本实施例的纳米诊疗剂具有良好的分散性和均匀的 尺寸，将氧化代谢酶固化在芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架载体中，可 以有效避免直接暴露导致的体内不稳定及血液毒性等问题。本实施例的纳 米诊疗剂制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工 业化生产。本实施例纳米诊疗剂可作为药物、基因的输运载体，同时也可直接用作肿瘤代谢治疗药物，在药物递送、基因转染、组织修复、肿瘤诊 疗等领域将具有良好的应用前景。
本实施例中，所述纳米诊疗剂具有六边形结构，所述纳米诊疗剂的尺 寸均匀，所述纳米诊疗剂的尺寸为10～500nm。
在一种实施方式中，所述芬顿金属离子选自锰离子、铜离子、铁离子、 钴离子、铬离子、钨离子、铝离子和锶离子等中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述氧化代谢酶包括葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、 凝血酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述金属-有机框架为锌基MOF材料，如ZIF-8、 ZIF-90等。
本发明实施例提供一种如上所述的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框 架材料固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
S1、将氧化代谢酶与2-甲基咪唑溶于水中配成溶液A；
S2、将锌盐和芬顿金属盐溶于水中配成溶液B；
S3、然后在搅拌下将溶液B加入溶液A中，进行反应，得到所述纳米 诊疗剂。
本实施例采用氧化代谢酶、水溶性芬顿金属盐、水溶性锌盐及2-甲基 咪唑为原料，以水为溶剂，将氧化代谢酶与2-甲基咪唑溶于水中配成溶液 A，将水溶性锌盐和水溶性芬顿金属盐溶于水中配成溶液B，然后在搅拌下 将溶液B加入溶液A中，通过室温搅拌使芬顿金属离子、锌离子与2-甲基 咪唑进行配位生成杂化的金属-有机框架材料，同时将氧化代谢酶固化在多 孔杂化的金属-有机框架中，得到芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料 固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂。
本实施例所制得的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化 代谢酶的纳米诊疗剂具有均匀的尺寸和六边形结构，其直径为10～500nm。
本实施例具有如下优点：
(1)所得纳米诊疗剂的尺寸均匀，形貌规则，尺寸为10～500nm；
(2)所得纳米诊疗剂具有良好的生物相容性，可作为药物、基因的输 运载体，同时也可直接用作肿瘤代谢治疗剂。
本实施例的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于 实现工业化生产。通过本实施例制备方法制备的芬顿金属离子掺杂的金属- 有机框架材料固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂可作为药物、基因的输运载体， 同时也可直接用作肿瘤代谢治疗药物，在药物递送、基因转染、组织修复、 肿瘤诊疗等领域将具有良好的应用前景。
步骤S1中，在一种实施方式中，所述氧化代谢酶选自葡萄糖氧化酶、 乳酸氧化酶、凝血酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等中的一种或多种。 上述酶类治疗剂具有良好的生物相容性和可降解性，不会对制备的纳米诊 疗剂带来毒副作用。
在一种实施方式中，所述溶液A中，所述氧化代谢酶的浓度为0.01～5 mg/mL。进一步地，所述溶液A中，所述氧化代谢酶的浓度为0.1～1mg/mL。
在一种实施方式中，所述溶液A中，所述2-甲基咪唑的浓度0.1～1000 mg/mL。步骤S2中，本实施例中的锌盐为水溶性锌盐。作为水溶性锌盐可 采用常用的氯化锌和/或其水合物、硝酸锌和/或其水合物、硫酸锌和/或其 水合物、乙酸锌和/或其水合物。上述锌盐均为可溶性锌盐，能够直接溶于 水，使得反应可以选择来源广、对环境友好的水作为溶剂。
本实施例中，所述芬顿金属盐为水溶性芬顿金属盐。作为水溶性芬顿 金属盐，可以选自水溶性锰盐、水溶性铜盐、水溶性铁盐、水溶性钴盐、 水溶性铬盐、水溶性钨盐、水溶性铝盐、水溶性锶盐等中的一种或多种。 上述金属盐均为可溶性金属盐，能够直接溶于水，使得反应可以选择来源 广、对环境友好的水作为溶剂。
在一种实施方式中，所述溶液B中，水溶性锌盐的浓度为1～50mM。
在一种实施方式中，所述芬顿金属盐的摩尔浓度与锌盐的摩尔浓度比 例为0.01～1：1。进一步地，所述芬顿金属盐的摩尔浓度与锌盐的摩尔浓度 比例为0.05～0.5：1。
在一种实施方式中，步骤S3具体包括：在搅拌下将1.5mL的溶液B加 入3.5mL的溶液A中，在室温搅拌1min～2h，通过室温搅拌使芬顿金属离 子、锌离子与2-甲基咪唑进行配位生成芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架 材料，同时将氧化代谢酶固化在多孔的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架 中。对产物进行离心分离，分离的方法可包括离心分离、过滤或静置沉淀 分离等。对分离出的产物进行洗涤、冷冻干燥或真空干燥处理，得到所述 的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧化代谢酶的纳米诊疗剂。
一种本发明实施例所述的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固 化氧化代谢酶的纳米诊疗剂在制备肿瘤制剂中的应用。
一种本发明实施例所述的芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固 化氧化代谢酶的纳米诊疗剂用作药物或基因的输运载体。
下面进一步举例实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例 只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制， 本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整 均属于本发明的保护范围。例如，下述实施例以葡萄糖糖氧化酶(GOx)或 乳酸氧化酶(LOx)作为氧化代谢酶、Cu(NO3)2或MnCl2·4H2O作为水溶性芬 顿金属盐、Zn(NO3)·6H2O和2-甲基咪唑作为起始原料，但如上述，也可采 用其他合适的水溶性氧化代谢酶、水溶性芬顿金属盐及水溶性锌盐替代。 下述示例具体的反应温度、时间、投料量等也仅是合适范围中的一个示例， 而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
按照附图1的步骤制备芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧 化代谢酶的纳米诊疗剂，具体步骤如下：
在室温下，将2mg GOx和770mg 2-甲基咪唑溶于3.5mL去离子水中 形成A液，将30mg Zn(NO3)·6H2O和6.3mg Cu(NO3)2溶于1.5mL去离子 水中形成B液，其中铜盐和锌盐的摩尔比为1：3。然后在搅拌下将B液加 入A液中，室温搅拌5min后进行离心分离，并用去离子水洗涤3次，冷 冻干燥12h得到粉体样品GOx@CuMOF。另外，按照表1制备对照样品ZIF-8 和CuMOF。
表1
附图2的X射线衍射图(XRD)表明所获得的样品为结晶相，并且铜离 子的掺杂和GOx的包载对MOF材料的物相没有明显影响。
附图3中(a)所示的透射电镜(TEM)照片显示所获得的样品具有六 边形结构和均匀的尺寸，其尺寸为50～200nm；附图3中(b)所示的扫描 透射电子显微镜(STEM)照片显示所获得的样品的主要元素为C、N、O、S、 Zn、Cu。
附图4为本实施例制备的GOx@CuMOF在pH为7.4、6.5的PBS及pH为 7.4、6.5的PBS+10mM GSH溶液中的降解情况。通过电感耦合等离子体发 射光谱法检测不同时间时溶液中的Cu2+离子浓度，结果显示pH为6.5的溶 液中Cu2+浓度明显高于pH为7.4的溶液；而含有GSH的溶液中Cu2+浓度明 显高于不含GSH的溶液。结果说明本实施例制备的[email protected]具有pH及GSH 响应的降解释放特性。
本实施例所制备的GOx@CuMOF在肿瘤内可介导如附图5中(a)所示级 联催化反应，GOx催化肿瘤内葡萄糖(Glucose，简写为Glu)氧化产生葡萄 糖酸、H2O2，并消耗O2；释放出来的Cu2+可以清除肿瘤内过表达的谷胱甘肽 (GSH)同时被还原成Cu+；Cu+与H2O2发生类芬顿反应，产生·OH杀死肿瘤 细胞。附图5中(b)，(c)为所获得样品对亚甲基蓝(MB)的降解情况，结果表明在GSH和Glu同时存在情况下，[email protected]可以有效降解MB。
附图5中(d)为采用对苯二甲酸(TPA)氧化法检测·OH，结果表明 在GSH和Glu同时存在条件下，溶液中可以检测到强的荧光，表明有大量·OH 产生。
附图5中(e)为采用JPBJ-608型便携式溶解氧测定仪(雷磁)检测 溶液中O2浓度变化，结果发现只有Glu和GSH同时存在时，才会导致溶液 中O2浓度下降。
以上结果说明，CuMOF的封装可以很好的保护GOx，而加入GSH之后， 由于GSH与Cu2+之间发生附图5中(a)所示方程(2)的氧化还原反应，导 致CuMOF结构破坏从而释放出GOx，继而发生附图5中(a)所示方程(1) 和(3)的反应，导致MB降解和TPA氧化。
实施例2
在室温下，将2mg GOx和770mg 2-甲基咪唑溶于3.5mL去离子水中 形成A液，将30mg Zn(NO3)·6H2O和7.2mg MnCl2·4H2O溶于1.5mL去 离子水中形成B液，其中锰盐和锌盐的摩尔比为1：3。然后在搅拌下将B 液加入A液中，室温搅拌5min后进行离心分离，并用去离子水洗涤3次， 冷冻干燥12h得到粉体样品GOx@MnMOF。
附图6的TEM照片显示所获得的样品主要为六边形结构，有少量呈圆 形结构，其尺寸为50～300nm。
实施例3
在室温下，将0.5mg LOx和770mg 2-甲基咪唑溶于3.5mL去离子水 中形成A液，将30mg Zn(NO3)·6H2O和6.3mg Cu(NO3)2溶于1.5mL去离 子水中形成B液，其中铜盐和锌盐的摩尔比为1：3。然后在搅拌下将B液 加入A液中，室温搅拌5min后进行离心分离，并用去离子水洗涤3次， 冷冻干燥12h得到粉体样品LOx@CuMOF。
附图7的TEM照片显示所获得的样品具有六边形结构，其尺寸为50～300 nm。
综述所述，本发明提供芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架材料固化氧 化代谢酶的纳米诊疗剂及制备方法与应用，其中所述纳米诊疗剂包括芬顿 金属离子掺杂的金属-有机框架材料以及固化在多孔的芬顿金属离子掺杂 的金属-有机框架中的氧化代谢酶。本发明提供的纳米诊疗剂易降解，具有 pH及谷胱甘肽响应的特点，能够在肿瘤部位释放氧化代谢酶，干扰肿瘤能 量代谢；而释放出的芬顿金属离子在肿瘤微环境下具有芬顿反应的特点， 能够分解肿瘤部位的H2O2产生强氧化性的羟基自由基，增强肿瘤代谢治疗效 果。本发明制备的纳米诊疗剂具有良好的分散性和均匀的尺寸，将氧化代 谢酶固化在芬顿金属离子掺杂的金属-有机框架载体中，可以有效避免直接 暴露导致的体内不稳定及血液毒性等问题。本发明的纳米诊疗剂制备工艺 简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。通过本 发明制备的纳米诊疗剂可作为药物、基因的输运载体，同时也可直接用作 肿瘤代谢治疗药物，在药物递送、基因转染、组织修复、肿瘤诊疗等领域 将具有良好的应用前景。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术 人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应 属于本发明所附权利要求的保护范围。