异柠檬酸脱氢酶在提高植物甲醛吸收代谢能力中的应用
阅读说明：本技术 异柠檬酸脱氢酶在提高植物甲醛吸收代谢能力中的应用 (Application of isocitrate dehydrogenase in improving formaldehyde absorption and metabolism capacity of plants ) 是由 李昆志 李方慧 赵星 年洪娟 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因AtIDH3在提高植物甲醛吸收代谢能力中的应用,所述拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因AtIDH3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；将AtIDH3基因重组到植物表达载体中,并转化野生型烟草,通过筛选获得转AtIDH3基因烟草；实验结果显示在相同浓度胁迫相同时间下,过表达烟草吸收甲醛的效果比野生型烟草的好；液体甲醛胁迫下野生型烟草和14-3-3c过表达烟草的AtIDH3转录水平的表达量显著增加；我们通过酵母双杂、Pull-down及Co-IP实验证明了14-3-3c蛋白与AtIDH3发生了相互作用,结果表明过表达的转基因烟草比野生型烟草甲醛吸收能力强。(The invention discloses an application of an arabidopsis isocitrate dehydrogenase gene AtIDH3 in improving the absorption and metabolism capability of plant formaldehyde, wherein the nucleotide sequence of the arabidopsis isocitrate dehydrogenase gene AtIDH3 is shown as SEQ ID NO 1; recombining AtIDH3 gene into plant expression vector, converting wild tobacco, and screening to obtain AtIDH3 gene-converted tobacco; the experimental result shows that under the same concentration and stress for the same time, the effect of over-expressing tobacco for absorbing formaldehyde is better than that of wild tobacco; the expression level of AtIDH3 transcription levels of wild tobacco and 14-3-3c over-expression tobacco is obviously increased under the stress of liquid formaldehyde; the interaction between the 14-3-3c protein and AtIDH3 is proved by yeast double-impurity, Pull-down and Co-IP experiments, and the result shows that the over-expressed transgenic tobacco has stronger formaldehyde absorption capacity than wild tobacco.)
技术领域
本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因AtIDH3在提高植物甲醛吸收代谢能力中的用途。
背景技术
甲醛是人们在日常生活中最常接触到的污染物之一，所以对甲醛污染的治理也一直受到广泛的关注。甲醛能与生物体内的各种大分子发生非特异性反应，导致大分子物质失活，因此甲醛对生物体有多方面的毒害作用并且与人类的多种疾病相关联。甲醛通过呼吸系统进入人体通过血液循环到达全身，导致身体各种机能异常。任何动物长期饮用被甲醛污染的水也会对身体造成不同程度的危害，因此解决甲醛污染问题刻不容缓。利用植物来解决甲醛污染问题是一种很经济环保的方法，现有的观点认为植物甲醛的吸收能力和其代谢甲醛能力有关联，因此，利用现代基因工程技术提高植物甲醛代谢水平，促进植物持续高水平代谢甲醛能力，是提高植物对甲醛吸收能力的重要途径。
异柠檬酸脱氢酶在TCA循环中催化异柠檬酸氧化脱羧为α-酮戊二酸的过程。既可为植物的氨同化提供碳骨架，产生的NADPH又可以维持细胞中的氧化还原平衡，帮助植物抵抗各种生物和非生物胁迫。IDH催化产生的ɑ-酮戊二酸是生物体糖类、脂质、蛋白质和核酸等生物大分子代谢产生二氧化碳和水的重要产物，因此异柠檬酸脱氢酶对生物体的代谢具有十分重要意义。研究表明IDH是产生NADPH的主要来源，IDH和生物的ROS产生密切相关。它在植物抗氧化胁迫中起重要的作用，细胞质的IDH参与到植物产生谷胱甘肽所需要的NADPH来抵抗极端条件的胁迫。植物在遭受一些离子毒害等非生物胁迫时IDH活性会增加。
14-3-3c蛋白是植物细胞中蛋白质发生相互作用的核心蛋白，参与植物的多种生长代谢反应，包括物质运输、生长发育、营养代谢、细胞周期、应激反应和光信号传递途径的调节等。在植物中，14-3-3c蛋白对代谢具有广泛的调节作用，14-3-3c蛋白通过与代谢途径关键酶如谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸合酶、6-磷酸果糖激酶/果糖二磷酸激酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、淀粉合成酶、脂肪氧化酶互作影响这些酶的活性，从而实现对代谢的调控，影响淀粉的积累及脂肪的氧化等过程。
目前还未见拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因AtIDH3在提高植物吸收代谢甲醛过程中的作用以及14-3-3c蛋白通过调控拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因的相关报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明一种拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因AtIDH3的新用途，即将拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因AtIDH3应用在提高植物吸收利用甲醛中，拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因AtIDH3的GenBank登录号为：At4G35650；利用AtIDH3基因构建甲醛吸收能力增强的转基因植物，可以用于对该基因的进一步研究，也可以种植于甲醛污染严重的土壤中。
为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：
1、选择模式植物烟草、拟南芥异柠檬酸脱氢酶基因AtIDH3作为实验材料，进行了以下实验：
采用Gateway技术构建AtIDH3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-AtIDH3，从拟南芥叶中克隆出AtIDH3基因全长，成功构建了AtIDH3原核表达载体，并在BL21中诱导表达蛋白，纯化得到AtIDH3蛋白；酶学特性分析表明AtIDH3的最适温度为45℃，25-35℃时热稳定性较好；最适pH为8.2；Mn2+和Mg2+对AtIDH3蛋白酶活都有促进作用，且激活作用Mn2+>Mg2+，其余的6种金属离子都在一定程度上抑制了AtIDH3蛋白的活性，抑制作用顺序为Ca2+>Co2+>Zn2+>K+>Na+>Cu2+；并且用纯化的蛋白制备了多克隆兔抗，经检测可作为一抗进行后续分析；
2、采用Gateway技术构建AtIDH3基因的植物表达载体pMK-35S-AtIDH3
用TRIzol Reagent试剂按照说明书提取拟南芥总RNA；并反转录获得AtIDH3的cDNA；在NCBI查找Arabidopsis thaliana IDH3的CDS序列(At4G35650)，通过DNAman软件设计其双酶切位点(BamH I和Sal I)和基因特异性引物；
上游引物5′-ATGGCGAGAAGATCCGTTTC(含BamH I酶切位点)
下游引物3′-CTCAAGAGCTGCTATGACAGCA(含Sal I酶切位点)；
使用上述引物进行PCR扩增，获得AtIDH3编码区全长DNA片段；通过酶切连接到pMD18-T载体上，热激转化大肠杆菌DH5α，通过抗性筛选及测序获得含正确序列的TA克隆；再进行酶切连接将片段连接到pENTR-2B载体上，通过抗性筛选及测序获得入门载体pENTR-AtIDH3；根据LR反应试剂盒LR ClonaseTM plus Enzyme Mix(购于美国Invitrogen公司)说明书，通过LR反应将AtIDH3重组到目的载体pMK7WG-cL-2上，获得植物表达载体pMK-35S-AtIDH3；用电转化法将pMK-35S-AtIDH3转入农杆菌，用筛选检测正确的农杆菌通过叶盘转化法转化野生型烟草，获得再生植株并进行以下筛选及检测；
3、通过抗性筛选获得的转基因植株，再进行基因组、mRNA水平、蛋白表达水平及AtIDH3活性的检测，获得多株转AtIDH3基因烟草，并扩繁；
4、从野生型烟草和转AtIDH3基因烟草、转14-3-3c基因烟草以及14-3-3c抑制表达的健壮植株(转14-3-3c基因烟草参照ZL 201710974873.6中方法获得)中选出长势一致的健壮植株，取叶片1g，自来水清洗3-4次去除污尘，用无菌的吸水纸吸干表面残留的水分，转移至含有2mM、4mM、6mM HCHO的处理液各50mL的培养瓶中，25℃下持续光照(100μmol·m-2·s-1)并在100rpm振荡培养0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h，以未加植物叶片只加甲醛的样品作为对照(BC)，对不同类型烟草的甲醛吸收效率和生理生化指标进行比较；
5、通过酵母双杂、Pull-down及Co-IP实验证明了14-3-3c蛋白与AtIDH3发生了相互作用，说明14-3-3c通过与该代谢关键酶互作改变酶的活性，来调节甲醛代谢；2mM HCHO液体处理野生型和转基因烟草叶片24h的代谢产物种类相同，且过表达的代谢产物比野生型的含量高，结果表明过表达的转基因烟草比野生型烟草甲醛吸收能力强。
本发明的有益效果：本发明将AtIDH3基因转入烟草中，提高了烟草的甲醛吸收效率，转AtIDH3基因烟草容易通过无性繁殖的方式保存种质资源，栽培后获得的种子容易保存，便于推广种植，这也为我们对该基因功能的进一步研究提供了材料，也为研究其他相关基因提供了思路，该转基因烟草可种植于甲醛污染严重的土壤中。
附图说明
图1为拟南芥AtIDH3基因的扩增(A)、pMD-18T-AtIDH3载体验证(B)、pGEX-4T-1-AtIDH3载体验证(C)和BL21的转化检测(D)的电泳检测结果示意图；
图2为重组蛋白pGEX-4T-1-AtIDH3诱导表达(A)、可溶性表达分析(B)和纯化(C)检测结果示意图；
图3为温度对AtIDH3酶活力的影响；
图4为AtIDH3酶的热稳定性分析结果；
图5为pH对AtIDH3的酶活力的影响；
图6为AtIDH3抗体效价检测Western blot(A)、双向免疫扩散试验(B)；
图7为过表达AtIDH3因烟草基因组PCR(A)、qRT-PCR(B)及western blot(C)检测结果示意图；
图8为野生型烟草、过表达14-3-3c烟草(KC)、过表达AtIDH3烟草(IDH3)、抑制表达14-3-3c转基因烟草(RC)对浓度2mM甲醛液体吸收结果；
图9为野生型烟草、过表达14-3-3c烟草(KC)、过表达AtIDH3烟草(IDH3)、抑制表达14-3-3c转基因烟草(RC)对浓度4mM甲醛液体吸收结果；
图10为野生型烟草、过表达14-3-3c烟草(KC)、过表达AtIDH3烟草(IDH3)、抑制表达14-3-3c转基因烟草(RC)对浓度6mM甲醛液体吸收结果；
图11为野生型烟草中AtIDH3基因的相对表达量结果；
图12为过表达14-3-3c烟草中AtIDH3基因的相对表达量结果；
图13为抑制表达14-3-3c转基因烟草中AtIDH3基因的相对表达量结果图；
图14为液体HCHO下WT烟草和转基因烟草叶片中IDH3酶活性的变化；
图15为14-3-3c与IDH3相互作用分析Pull-down实验分析结果；
图16为酵母双杂交分析结果；
图17为免疫共沉淀(Co-IP)实验结果；
图18为过表达烟草14-3-3c、过表达拟南芥AtIDH3烟草、抑制表达14-3-3c烟草烟草、野生型烟草叶片2mM甲醛处理24h代谢谱；
图19为过表达烟草14-3-3c、过表达拟南芥AtIDH3烟草、抑制表达14-3-3c烟草烟草、野生型烟草叶片2mM甲醛处理后代谢产物的相对积分结果。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：AtIDH3基因的原核表达载体构建及其蛋白表达纯化
采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取拟南芥叶片的总RNA，操作按说明书进行；用M-MLV Reverse Transcriptase(Fermentas公司)反转录试剂盒将25μL RNA反转录成cDNA；以1μL cDNA为模板，进行PCR扩增目的片段。在NCBI查找Arabidopsis thaliana IDH3的CDS序列(At4G35650)，通过DNAman软件设计其双酶切位点(BamHⅠ和SalⅠ)和基因特异性引物(F-ATGGCGAGAAGATCCGTTTC；R-CTCAAGAGCTGCTATGACAGCA)。使用设计好的特异性引物进行PCR扩增，胶回收AtIDH3基因片段(图1A)，-20℃保存备用。胶回收AtIDH3基因与pMD18-T进行TA克隆获得pMD18-AtIDH3载体，热激转化DH5α，涂布接种于氨苄青霉素(Amp)固体培养基中，37℃恒温箱过夜培养。第二天挑取单菌落放于液体培养基中筛选培养，待菌液浑浊后，取1μL菌液为DNA模板进行PCR检测(图1B)，检测成功的菌液提取质粒送公司测序。用DNAman将测序结果与AtIDH3进行比对，将比对正确的pMD18-AtIDH3质粒和pGEX-4T-1载体使用BamH I和Sal I分别进行双酶切(25μL质粒；5μL BamH I；5μL Sal I；7.5μL 10×Buffer T；7.5μL ddH2O)，凝胶电泳观察目的片段，对目的基因片段AtIDH3和被切开的pGEX-4T-1载体片段进行胶回收。回收得到片段在16℃金属浴中过夜连接得到pGEX-4T-AtIDH3质粒；pGEX-4T-AtIDH3质粒通过热激转入DH5α中，涂布于Amp固体培养基中，37℃恒温箱中过夜培养，挑取单菌落于Amp液体培养大量增殖培养，取1μL培养液进行PCR检测，检测成功后提取质粒双酶切检测(图1C)。
将双酶切检测成功后的原核表达载体pGEX-4T-1-AtIDH3质粒通过热激转化转入大肠杆菌BL21蛋白表达菌中，涂布含有Amp固体培养基中于37℃恒温箱中过夜培养，挑取单菌落在Amp液体培养基中筛选培养，对菌体正常生长的培养基进行菌液PCR检测(图1D)。将检测成功的菌液接种到25mL LB液体培养基中，在摇床中(37℃、220rpm)培养至菌液OD值为0.5，再加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L；取诱导0、2、4、6、8h后菌液各2mL，12000rpm离心1min，收集菌体，加入2mL PBS重悬，取20μL重悬后的菌体加入20μL 2×蛋白质电泳上样缓冲液，沸水煮10min，冷却后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)泳分析蛋白表达情况(图2A)；实验发现AtIDH3蛋白在1mmol/L IPTG诱导6h蛋白表达量最大。
将AtIDH3基因重组表达菌株在1mmol/L IPTG条件下，分别在28℃和37℃摇床中进行诱导表达，用4mL TBS重复清洗菌体沉淀三次，加入2mL PBS重悬菌体沉淀，超声波破碎15min，离心获得上清和沉淀，将其进行SDS-PAGE分析，发现表达蛋白在诱导28℃的上清中表达量最高(图2B)。在最佳条件下，大量诱导菌株大量表达蛋白；4℃、12000rpm下离心15min收集菌体沉淀，加入PBS重悬，将重悬的菌体盛入50mL EP管，再将管置于冰中超声破碎细胞15min；破碎后的菌体离心后，将获得的含有大量目的表达蛋白的上清液过GST柱，得到纯化的IDH3融合蛋白，取20μL样品进行12％的SDS-PAGE分析(图2C)。
实施例2：异柠檬酸脱氢酶酶活力测定
蛋白浓度的测定使用上海捷瑞生物工程有限公司生产的BCA法蛋白定量试剂盒，以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)为标准蛋白，参照试剂盒操作手册按Bradford法操作。采用分光光度法测定酶活性，IDH的酶活测定体系为20mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、5mmol/L DL-isocitric acid trisodium或0.5mmol/L DL-isocitricacid trisodium、2mmol/L NAD+或0.5mmol/L NADP+。在25℃下，使用紫外分光光度计检测反应过程中340nm处光吸收值的变化。
(1)异柠檬酸脱氢酶AtIDH3的最适温度及其热稳定性
在上述反应体系中其他条件不变，在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，水浴10min，测定IDH的相对酶活力。以温度为横坐标，以相对酶活力为纵坐标绘制曲线图，求出IDH酶的最适反应温度。将IDH置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃水浴，20min后立即置于冰上冷却后，测定IDH酶的残余活力，以温度为横坐标，以酶的相对残余酶活力为纵坐标绘制曲线图，以确定酶的热稳定性；未经处理的酶活性为100％。
通过测定结果显示，温度对酶催化反应速度的影响实际上是温度对反应速度的影响与促使酶变性的综合的结果，结果如图3、4所示，图3显示AtIDH3酶的最适反应温度为45℃。IDH在30-55℃之间均保持80％以上的活力，说明AtIDH3酶活力受温度的影响较小。图4显示25-40℃范围内，AtIDH3酶活力保持在60％以上，30℃-35℃对酶活力热稳定性最好，都在80％以上；超过40℃后，酶活稳定性逐渐下降，热稳定明显减低，说明较高的温度对AtIDH3酶的稳定性影响相对较大。
(2)异柠檬酸脱氢酶最适pH
在上述反应体系中其他条件不变，在20mmol/L pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的Tris-HCl缓冲液中，25℃下测定IDH的相对酶活性；每个pH重复三次，统计结果计算出酶活性，把酶活力最高点设为100％，以pH值为横坐标，以相对酶活力为纵坐标作图，求出最适pH；
图5结果显示，AtIDH3酶在8.2时酶活达到最高，此为AtIDH3酶最适pH。当pH在6～8.2范围内时，IDH酶活力变化较慢；pH在8.2～10范围内下降迅速，说明过碱的环境可以使IDH酶失活。
(3)金属离子对异柠檬酸脱氢酶酶活力的影响
25℃条件下，保持其他组分不变的前提下，在反应体系中分别加入终浓度为5mmol/L的MgCl2、MnCl2、CoCl2、CaCl2、ZnSO4、CuCl2、NaCl和KCl测定AtIDH3酶活力，每个实验独立重复三次，统计结果并计算IDH的相对酶活性。
各种金属离子对异柠檬酸脱氢酶活力的影响结果显示，Mn2+和Mg2+对AtIDH3都有促进作用，但是两者对AtIDH3酶的活性激活作用有明显的差异，Mn2+存在时酶活性最强，Mg2 +的促进作用比Mn2+要弱；其余剩下的6种金属离子都在一定程度上抑制了IDH的活性，具体的抑制作用顺序为Ca2+＞Co2+＞Zn2+＞K+＞Na+＞Cu2+。不同的金属离子与AtIDH3产生亲和力的方式不同，而导致酶活性的变化。结果表明，不同金属离子对AtIDH3的活性的影响各不相同。实验指标均重复三次测定，实验数据采用Excel 2010进行统计学分析，结果见下表：
金属离子
相对酶活(％)±SD
对照
100％±0.02
Mg<sup>2+</sup>
115％±0.03
Mn<sup>2+</sup>
172％±0.01
Co<sup>2+</sup>
24％±0.04
Ca<sup>2+</sup>
11％±0.02
Zn<sup>2+</sup>
26％±0.01
Cu<sup>2+</sup>
36％±0.04
Na<sup>+</sup>
31％±0.03
K<sup>+</sup>
30％±0.02
。
实施例3：AtIDH3蛋白兔抗的制备及效价检测
将纯化好的1mL重组蛋白(约含有5mg纯化的AtIDH3蛋白)与1mL弗氏佐剂以1∶1比例进行乳化。在研钵里先加入弗氏佐剂，反复乳化数次；直至制备出合格的油包水剂，可进行兔免疫。初次对兔进行免疫时用等体积的完全弗氏佐剂乳化后，对兔全身进行少量多次免疫，每个点注射少量的抗原。通过肌肉、皮下或皮内注射等多种不同的方式将抗原尽量均匀的注射到每个免疫点。第一次免疫间隔两周后，用等体积的不完全弗氏佐剂乳化AtIDH3抗原，对兔进行加强免疫。进行每周的加强免疫，共加强免疫三次。
末次免疫后间隔一周，将兔麻醉，使其仰面，将兔的四肢固定，剪去心脏附近处的兔毛，用含酒精棉球对兔皮肤进行消毒。然后，触摸一般位于第三和第四肋骨之间的心脏搏动最强的部位，用50mL注射器连接16号针头，倾斜45°，对准兔心搏最强处进行心脏抽血。将抽取的血液立即注入无菌容器中，等待分离血清。将获得的兔血先置37℃恒温培养箱1h，然后置4℃冰箱内3-4h，直至血液凝固血块收缩，然后吸取血清；3000r/min离心15min，取上清加入终浓度0.02％叠氮纳防腐，用2mL灭菌的离心管分装后，置于-20℃冰箱中冷冻保存备用。
为了验证抗体是否有效，我们进行了AtIDH3抗体的特异性检测。取纯化的重组蛋白5μL、10μL、15μL(蛋白浓度分别为2.354μg、4.708μg、7.062μg)进行SDS-PAGE电泳，用上述兔抗为一抗，商业化的羊抗兔为二抗进行western blot分析，结果如图6A，说明本实施例制备的多克隆兔抗体可以和AtIDH3抗原发生特异性反应，抗体制备成功。
为了进一步检测抗体的有效性，我们又做了双向免疫扩散试验。试验结果如图6B所示，可以看到一条弧形的白色沉淀线，说明以AtIDH3纯化的蛋白与AtIDH3的免疫血清有特异性，它们在琼脂糖凝胶中自由扩散，相遇后形成了抗原抗体复合物。而这条线沿着中间孔的边缘弯曲，且除了生理盐水处没有白线外，其他稀释不同倍数的孔都有白线，说明该兔抗体效价较高。
实施例4：过表达AtIDH3转基因烟草株系的构建及过表达AtIDH3基因烟草的鉴定
本发明通过Gateway技术构建真核目的表达载体pMK-35S-AtIDH3；PCR扩AtIDH3基因目的片段(1107bp)。将pMD18T和目的片段通过T/A克隆获得pMD18T-AtIDH3质粒，对阳性克隆进行测序检测外源基因AtIDH3是否发生突变。检测成功未发生突变的pMD18T-AtIDH3质粒和pENTR质粒经过BamH I和Sal I分别双酶切胶回收获得目的片段AtIDH3和被切开的pENTR，将两个片段过夜连接，形成入门克隆载体pENTR-AtIDH3，双酶切后凝胶电泳观察AtIDH3基因是否成功克隆到pENTR载体上。检测成功后，将植物双元表达载体pMK7WG-cL-2和入门克隆载体pENTR-AtIDH3在LR Mix Enzyme的作用下进行LR反应，形成植物表达载体简称pMK-35S-AtIDH3。
将植物表达载体pMK-35S-AtIDH3通过电转化法转入农杆菌pMP90中，在壮观霉素(Spe)固体培养基中筛选培养得到阳性克隆，挑选单菌落在含Spe的LB液体培养基中筛选培养(终浓度50mg/L)，进行菌液PCR检测有外源植物表达载体质粒的阳性克隆，通过叶盘转化法，将含有目的基因的表达载体pMK-35S-AtIDH3农杆菌转染烟草，在含Kan抗性培养基(终浓度30μg/mL)筛选获得转基因烟草。
将抗性培养基中长根的转基因烟草通过CTAB法提取植物的基因组，凝胶电泳检测提取的基因组DNA。以提取的植物基因组DNA为模板，用AtIDH3基因的特异性引物，进行PCR反应，在1％琼脂糖凝胶电泳上对PCR产物进行检测；基因组PCR检测在基因组中有外源AtIDH3基因插入的植株，需要通过qRT-PCR分析其转录水平；将转基因株系通过TRIzol法提取总RNA，用酶标仪检测和1.5％琼脂糖凝胶电泳RNA的浓度和质量，然后取25μL RNA反转录合成第一条链cDNA；1μL cDNA为模板，用烟草的actin作为内参进行qRT-PCR分析IDH3在转基因烟草中的转录水平；经鉴定IDH3在烟草中转录后，再对其蛋白是否翻译进行检测，提取上述转基因烟草的植物总蛋白，以第二章制备的兔抗为一抗，用western blot对IDH3蛋白水平进行检测。
用pMK-35S-AtIDH3转化烟草获得具有卡那霉素抗性的转基因株系，以基因组DNA为模板，用AtIDH3基因的特异性引物，检测外源基因的插入情况；对基因组进行PCR反应后，得到如下结果(图7A)；结果说明15个(1、5、6、7、8、9、10、12、13、16、17、18、19、20、21)株系的基因组中有AtIDH3基因插入；qRT-PCR分析结果(图7B)，说明6株转基因植株中外源AtIDH3基因都能够正常转录，且各转基因烟草株系转录水平相似。蛋白水平的检测采用westernblot(图7C)用实施例3获得的抗体为一抗，western blot分析结果说明6个(9、10、12、13、17、20)株系转基因植株中外源AtIDH3基因都能够正常翻译，且各转基因烟草株系翻译水平相似。
通过DNA、RNA及蛋白三个水平检测分析结果说明外源AtIDH3基因已准确插入烟草基因组中，并且在35S的启动子下，外源AtIDH3基因能够正确的转录。本实验选择转录水平较高的转基因烟草株系10作为转基因烟草试验材料。
实施例5：转基因植物的甲醛胁迫处理
选出生长状况相同的植株，取叶片1g，自来水清洗3-4次去除污尘，用无菌的吸水纸吸干表面残留的水分，转移至含有2mM、4mM、6mM HCHO处理液各50mL的培养瓶中，25℃下持续光照(100μmol·m-2·s-1)并在100rpm振荡培养0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h，以未加植物叶片只加甲醛的样品作为对照(BC)。
1、转基因烟草对液体甲醛吸收能力检测
为检测14-3-3cc表达改变烟草(14-3-3c过表达烟草简称KC、抑制14-3-3c表达的烟草简称R)及过表达拟南芥AtIDH3对烟草吸收液体HCHO的影响，我们分别在14-3-3c表达改变烟草及拟南芥AtIDH3过表达烟草中各取三个样品，都是1g叶片材料，分别浸没在浓度为2mM、4mM、6mM的50mL HCHO溶液中进行HCHO吸收的检测，以不放叶片的HCHO溶液为对照监测HCHO的挥发量，取测定后所得的平均值绘制转基因烟草的液体HCHO吸收曲线。通过比较转基因烟草与野生型烟草吸收HCHO的能力，结果发现在2mM HCHO溶液中(图8)14-3-3c表达改变烟草及拟南芥AtIDH3过表达烟草吸收HCHO能力相似，过表达烟草均略高于野生型烟草，抑制表达略低于野生型烟草，且在24h后野生型与转基因烟草吸收HCHO速度产生明显差异，其中14-3-3c过表达烟草的HCHO吸收速率最快。
对比转基因烟草和野生型烟草在4mM HCHO溶液中的吸收曲线(图9)可以发现，14-3-3c表达改变烟草及过表达拟南芥AtIDH3烟草和野生型烟草吸收HCHO的整体趋势相似，14-3-3c过表达略高于AtIDH3过表达的吸收能力，AtIDH3过表达略高于野生型的吸收能力，而14-3-3c抑制表达的吸收HCHO的能力比野生型的更弱。
从转基因烟草与野生型烟草在6mM HCHO溶液中的吸收曲线(图10)中我们发现野生型烟草和抑制表达转基因烟草对HCHO的吸收能力明显比其他两种转基因烟草要弱。而过表达14-3-3c烟草比过表达拟南芥AtIDH3烟草的HCHO吸收能力要高一些。这些结果表明在烟草中过表达烟草14-3-3c基因及拟南芥AtIDH3基因增强了烟草对液体HCHO的吸收能力，抑制14-3-3c表达烟草基因会降低烟草对液体HCHO的吸收能力。
2、14-3-3c表达改变对AtIDH3的表达量的影响
用2mM液体甲醛处理14-3-3c过表达烟草和抑制14-3-3c表达烟草12h、24h，以未处理的作为对照来测定AtIDH3的表达量，结果如图11-13所示，在2mM液体甲醛处理0h、12h、24h后，对AtIDH3的相对表达量进行分析。在野生型烟草中AtIDH3的表达量随处理时间的增大而增大(如图11)；14-3-3c过表达烟草与野生型趋势相同，处理时间越长AtIDH3表达量越高(如图12)；14-3-3c抑制表达的烟草AtIDH3的表达量也是上升的，但只是略微升高，并没有野生型和过表达的表达量高(图13)。经过24h处理后，野生型和14-3-3c过表达烟草的AtIDH3表达量显著升高，且14-3-3c过表达比野生型烟草的AtIDH3表达量高，但抑制表达14-3-3c烟草的AtIDH3表达量升高与处理12h差异不大，甚至还稍微降低；该结果证明14-3-3c表达改变后经甲醛处理后AtIDH3的表达量都会增加，14-3-3c过表达烟草增加＞野生型烟草＞14-3-3c抑制表达烟草。
3、14-3-3c表达改变对AtIDH3酶活的影响
为了检测14-3-3c表达改变的转基因烟草经甲醛胁迫后，AtIDH3酶活是否会受到影响，我们用经过甲醛处理不同时间的野生型烟草及14-3-3c过表达烟草和抑制表达14-3-3c烟草为材料，测定AtIDH3的相对酶活性，结果如图14所示，经过甲醛处理后14-3-3c过表达烟草的AtIDH3酶活性整体比野生型烟草和14-3-3c烟草的要高；除了甲醛处理6h和60h外，14-3-3c抑制表达烟草比野生型的AtIDH3相对酶活要高。14-3-3c过表达烟草经过甲醛处理后，在6h时AtIDH3的相对酶活升高，但在12h处又下降至比未处理略高，之后酶活性随着甲醛处理时间的增加而增加；而14-3-3c抑制表达烟草和野生型烟草在处理24h前与14-3-3c过表达烟草恰恰相反，在处理6h时酶活下降，在12h处反而上升，24h后又下降之后又缓慢上升。该结果说明，甲醛处理后的14-3-3c过表达烟草中AtIDH3的酶活提高，而野生型与14-3-3c抑制表达烟草下降或稍有提升。
4、体内及体外AtIDH3与14-3-3c互作分析
为了了解14-3-3c与AtIDH3是否产生互作来影响甲醛代谢，首先进行了Pull-down分析(如图15)，纯化的14-3-3c-His融合蛋白分别与GST和GST-AtIDH3融合蛋白，在结合缓冲液中结合，然后加入GST琼脂糖结合树脂在孵育后离心，沉淀下来的蛋白质做Westernblot分析检测，具体的实验操作如下：
(1)表达载体的构建：使用pMD-18T载体进行TA克隆把14-3-3c插入pMD-18T，使用Nco I和BamH I双酶切后胶回收得到14-3-3c目的基因片段。同时使用Nco I和BamH I双酶切pET-28a表达载体，回收线性pET-28a载体。16℃进行连接2h，热激法转化DH5α，转在含有Amp抗性培养基上进行筛选，测序正确后转化BL21表达菌株；
(2)诱导重组蛋白的表达：将构建好的载体pET-14-3-3c转化BL21感受态，诱导14-3-3c重组蛋白表达并检测蛋白的表达情况；
3、结合：纯化的14-3-3c-His融合蛋白分别与GST和GST-IDH3融合蛋白各50μg，加入结合缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.5，100mmol/L NaCl，0.25％，TritonX-100，1mmol/LEDTA，1mmol/L DTT)室温振荡结合2h，然后加入30μL GST琼脂糖结合树脂在4℃摇床(40r/min)孵育过夜；
4、洗涤：4℃离心(3500g)5min收集沉淀物，收集的沉淀蛋白混合物用结合缓冲液洗涤三次；
沉降下来的蛋白质用沸水浴煮，并在SDS-PAGE胶分离所沉淀的蛋白质，然后转移到PVDF膜上进行Western blot分析，然后分别用Anti-His和Anti-14-3-3c特异性抗体(实验室先前做的兔抗)为一抗做Western blot检测14-3-3c与IDH3蛋白在体外是否产生互作。
结果发现，His和14-3-3c都能被GST-AtIDH3蛋白沉淀，而GST对照组没有沉淀到His和14-3-3c蛋白，表明14-3-3c和AtIDH3发生相互作用被沉淀下来。
其次，我们对14-3-3c和AtIDH3重组蛋白进行了酵母双杂交实验(如图16)。我们先将14-3-3c基因的全长连到pGADT7载体中，转化Y187酵母菌株；将AtIDH3基因的CDS序列克隆到pGBKT7载体中，转化Y2HGold酵母菌株。两两融合，使用缺少Leu-Trp的培养基进行培养。我们已确定在酵母双杂交试验中p35和大T抗原可以发生相互作用，我们用Y2HGold[pGBKT7-53]与Y187[pGADT7-T]互作设置为阳性对照，使用pGBKT7-Lam和pGADT7-T作为阴性对照，具体实验操作如下：
(1)载体的构建：用酶切连接将AtIDH3基因连入pGBKT7载体、14-3-3c基因连入pGADT7载体，使AtIDH3分别与GAL4的DNA结合结构域融合(BD-AtIDH3)以及14-3-3c与GAL4的DNA激活结构域融合(AD-14-3-3c)。
转化：Y187或Y2H Gold 10μL菌液加入2mL 0.25×YPDA 中，28℃、200rpm过夜培养12h；
(2)取250μL菌液，12000rpm速离15s，收集沉淀，加1mLddH2O重悬，速离收集沉淀；
(3)依次缓慢加入240μL PEG 3350(50％w/v)；36μL LiAc(1M)；20μL ss-DNA(2mg/mL)；10μL重组质粒；54μL ddH2O涡旋1min；42℃水浴30min。速离15s，去悬浮液，加100μLddH2O，轻轻吹打涂一缺培养基，28℃恒温箱培养2到4天。
(4)挑单菌落在一缺培养液中28℃、200rpm过夜培养；
(5)杂交：上一步菌液两两混合于2mL的2×YPDA培养液中，28℃、200rpm过夜培养；
(6)取1mL菌液速离，ddH2O洗2次，轻轻吹打混匀，吸20μL涂二缺板；
(7)挑单菌落至离心管中加入50-100μL ddH2O溶解，低速离心后吸除ddH2O；再用ddH2O洗一次。加入30-50μL ddH2O混匀待用；吸1.5-2μL分别滴在不含AbA、X-α-gal和含有AbA、X-α-gal的二缺板上，28℃培养2-4天，观察；
以pGADT7-14-3-3c和pGBKT7-AtIDH3为实验组，结果实验组和阳性对照一样能在含有AbA和X-α-gal的二缺板上长出蓝斑，证明14-3-3c和AtIDH3有相互作用。
最后，我们利用免疫共沉淀来验证AtIDH3是否能与14-3-3c蛋白结合：用2mM甲醛处理野生型烟草、14-3-3c过表达烟草、抑制表达14-3-3c烟草的叶片0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h后分别提取其植物总蛋白，取200μg植物总蛋白中加入2μg 14-3-3c蛋白特异性抗体中，再加入20μL琼脂蛋白A/G，4℃摇床(40rpm)振摇过夜；第二天将其离心5min(4℃，3000rpm)，收集蛋白沉淀，用预冷的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次，再将清洗后的沉淀溶解于40μL 1×loading buffer，取40μL经SDS-PAGE(12％)电泳分离后，进行Western blot分析。蛋白经半干电转仪将蛋白转移至PVDF膜上，IDH3特异性抗体为一抗4℃过夜孵育，羊抗兔二抗常温孵育2h，通过凝胶成像仪观察实验结果。AtIDH3和14-3-3c蛋白互作水平分析凝胶成像仪结果(图17)，结果表明，14-3-3c和IDH3在不同甲醛处理时间都能发生相互作用。
5、14-3-3c过表达/抑制表达14-3-3c及AtIDH3过表达对烟草甲醛吸收代谢影响
利用13C-NMR技术分析了H13CHO在各种转基因烟草叶片的代谢情况，图18显示2mM液体H13CHO处理24h时野生型和转基因叶片中主要代谢中间产物13C-NMR共振峰强度的变化情况；通过比较野生型和各种转基因烟草叶片H13CHO处理样品与对照样品中各中间产物含量的变化，结果发现经过H13CHO处理24h后的14-3-3c过表达(KC)、14-3-3c抑制表达(RC)、AtIDH3过表达(IDH3)比野生型叶片(WT)和未经任何处理的野生型叶片(CK)的含量都高，并且三种转基因烟草的中间代谢产物比未经任何处理的要高。
本研究通过对核磁图谱中的各峰进行积分，分析了各主要代谢产物的相对含量，图19B、C、D、E结果发现野生型烟草叶片中的异柠檬酸、苹果酸、葡萄糖、柠檬酸分别比未经任何处理的野生型叶片(CK)的高出4倍、1.25倍、4倍和2倍；14-3-3c过表达叶片中的异柠檬酸、苹果酸、葡萄糖、柠檬酸分别比未经任何处理的野生型叶片(CK)的高出6.5倍、4.2倍、22倍和3.75倍；14-3-3c抑制表达烟草叶片中的异柠檬酸、苹果酸、葡萄糖、柠檬酸分别比未经任何处理的野生型烟草叶片(CK)的高出2倍、3.25倍、13倍和3.75倍；AtIDH3过表达叶片中的异柠檬酸、苹果酸、葡萄糖、柠檬酸分别比未经任何处理的野生型叶片(CK)的高出6.5倍、9.75倍、21倍和3.75倍；通过这些结果我们推测，异柠檬酸、苹果酸、葡萄糖、柠檬酸可能是烟草甲醛代谢2mM液体H13CHO的主要中间产物。14-3-3c和AtIDH3基因过表达后烟草叶片代谢低浓度甲醛(2mM)的能力比野生型强。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 异柠檬酸脱氢酶在提高植物甲醛吸收代谢能力中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1107
<212> DNA
<213> 拟南芥异(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
atggcgagaa gatccgtttc gatatttaat cgccttctgg cgaatcctcc ttctccattc 60
acatcactgt cccgatccat cacctacatg cctagacccg gagatggagc tccacgaacc 120
gtaaccctaa ttcccggcga cggaatcgga cctttggtga ccggtgcggt ggaacaggtc 180
atggaagcga tgcacgcgcc agtgcatttc gagagatacg aggttctagg aaacatgaga 240
aaagtccctg aagaagtgat cgagtctgtg aagagaaaca aggtttgtct caaaggtgga 300
ttagcgactc ctgttggtgg gggtgtcagt tctttgaata tgcaattgag gaaagaactc 360
gatatcttcg cttctcttgt caattgcatc aatgtccctg gattagtgac gcgacacgaa 420
aatgttgata tcgttgtgat aagagagaac actgaaggag agtactcagg tctcgagcat 480
gaggttgttc ctggtgttgt cgagagcctt aaggtgataa caaagttttg ttctgagaga 540
atagcgagat atgcatttga gtatgcgtat ctaaacaata ggaagaaagt gactgctgtt 600
cataaagcta acattatgaa gcttgcggat gggctcttcc ttgaatcttg tagagaggtt 660
gctaaacatt attcggggat tacttacaat gaaataatcg tagacaattg ctgtatgcag 720
cttgtcgcca agcctgagca atttgatgtc atggtgacac ctaatttgta tggtaacctt 780
atagcaaaca cggcggctgg aatagccggt ggcactggag tgatgccagg agggaatgtt 840
ggtgcagaac atgcgatatt cgagcaaggt gcatcagcag ggaatgtggg gaatgataag 900
atggtggaac agaagaaagc gaatccggtg gctctacttc tctcgtcggc tatgatgcta 960
agacatctcc ggtttcctac ttttgctgat cggcttgaaa cagcagtgaa acaagtgatt 1020
aaagaaggaa aatatagaac aaaagatctt ggaggagatt gtaccacgca ggaagttgtt 1080
gatgctgtca tagcagctct tgagtga 1107
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
atggcgagaa gatccgtttc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
ctcaagagct gctatgacag ca 22