阅读说明：本技术 对羟基苯甲酸钠在制备治疗或预防炎症性肠病药物中的应用 (Application of sodium p-hydroxybenzoate in preparing medicine for treating or preventing inflammatory bowel disease ) 是由 王宇晖 段小群 徐笑天 郑董璇 张溪杨 魏承琼 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了对羟基苯甲酸钠在制备治疗或预防炎症性肠病药物中的应用。在剂量明显低于美沙拉嗪的情况下,对羟基苯甲酸钠可明显抑制葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎模型小鼠疾病活动指数评分的升高,改善结肠炎模型小鼠结肠长度缩短,降低小鼠结肠MPO活力,减轻结肠炎模型结肠组织炎性细胞浸润。本发明还公开了一种治疗或预防炎症性肠病的药物,该药物以对羟基苯甲酸钠为有效成分,含有治疗上有效剂量的对羟基苯甲酸钠。(The invention discloses an application of sodium p-hydroxybenzoate in preparing a medicine for treating or preventing inflammatory bowel disease. Under the condition that the dosage is obviously lower than that of mesalazine, the sodium p-hydroxybenzoate can obviously inhibit the increase of disease activity index scores of enteritis model mice induced by dextran sodium sulfate, improve the reduction of colon length of colitis model mice, reduce the MPO activity of the colon of mice and reduce the infiltration of colitis model colon tissue inflammatory cells. The invention also discloses a medicament for treating or preventing inflammatory bowel diseases, which takes sodium p-hydroxybenzoate as an effective component and contains the sodium p-hydroxybenzoate with a therapeutically effective dose.)

对羟基苯甲酸钠在制备治疗或预防炎症性肠病药物中的应用

技术领域

本发明涉及对羟基苯甲酸钠的应用，具体涉及对羟基苯甲酸钠在制备治疗或预防炎症性肠病药物中的应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种主要累及回肠、直肠、结肠的特发性肠道炎症性疾病，临床表现为腹泻、腹痛，甚至可有血便。炎症性肠病包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(crohn’s disease,CD)。溃疡性结肠炎是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症，疾病通常先累及直肠，逐渐向全结肠蔓延；克罗恩病为非连续性全层炎症，可累及全消化道，最常累及部位为末端回肠、结肠和肛周。UC作为一种典型的炎症性肠病，好发于30-40岁青壮年，且无性别差异，表现为腹泻、腹痛、黏液脓血便等临床症状，多并发肠穿孔、息肉、溃疡等，病程漫长且癌变率高，严重影响患者生活质量和生存。流行病学研究表明，欧洲地区的UC发病率高达505/100000，加拿大地区的发病率为248/100000，美国的发病率为214/100000。随着生活方式、饮食规律的改变，亚洲和中东等地区的UC发病率呈逐年增高的趋势。

目前，药物治疗和手术切除是控制UC的主要方法，常用治疗药物有以下5类：(1)、氨基水杨酸类，如柳氮磺胺吡啶和美沙拉嗪；(2)、糖皮质激素类，如***和二丙酸倍氯米松；(3)、免疫抑制剂，如6-巯基嘌呤和环孢素；(4)、生物制剂，如TNF-α抑制剂英夫利昔单抗；(5)、抗感染药物，如抗菌素甲硝唑和环丙沙星。这些药物主要通过抑制异常的免疫应答，减轻结肠局部炎症，阻止病情进展，但存在疗效不稳定、不良反应多、耐受性差、无法完全改善全部病症和不适合长期用药或价格昂贵等不足。因此，寻找疗效确切、不良反应少，且质量可控的抗UC药物具有重要的价值。

发明人在前期实验中发现对羟基苯甲酸在剂量低于美沙拉嗪的情况下，能够有效缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎模型小鼠的症状，但在后续研究中发现灌胃给予模型小鼠对羟基苯甲酸时，虽然对UC症状有明显缓解作用，却会对肝脏产生副作用。

发明内容

发明人对对羟基苯甲酸钠进行研究，通过大量实验发现，在剂量明显低于美沙拉嗪的情况下，对羟基苯甲酸钠可明显抑制葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎模型小鼠疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分的升高，改善结肠炎模型小鼠结肠长度缩短，降低小鼠结肠MPO活力，减轻结肠炎模型结肠组织炎性细胞浸润。发明人进一步发现对羟基苯甲酸钠对炎症性肠病疾病的缓解作用明显优于对羟基苯甲酸，副作用不明显。同时，羟基苯甲酸钠pH为7.3，对羟基苯甲酸的pH约在3，根据离子障原理，偏碱性的对羟基苯甲酸钠在人胃肠道中更利于被吸收，且酸性物质对肠道会产生明显的刺激，尤其对于溃疡性结肠炎患者，在受到酸性物质的反复感染和影响后病情明显加重。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

对羟基苯甲酸钠在制备治疗或预防炎症性肠病药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种治疗或预防炎症性肠病的药物，该药物以对羟基苯甲酸钠为有效成分，含有治疗上有效剂量的对羟基苯甲酸钠。

所述的药物的剂型可以是药学上可接受的剂型；所述的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、栓剂、缓释剂等剂型。

优选的，所述的炎症性肠病为溃疡性结肠炎。

优选的，所述的炎症性肠病为DSS诱导结肠炎。

附图说明

图1为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠体重的影响曲线；其中，normal表示正常组，DSS表示模型组，HBSS(10mg/kg)表示对羟基苯甲酸钠低剂量组，HBSS(20mg/kg)表示对羟基苯甲酸钠高剂量组，HHA(20mg/kg)表示对羟基苯甲酸组，Mesalazine(200mg/kg)表示美沙拉嗪组；与正常组比较，##表示p<0.01；与模型组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图2为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠DAI评分的影响曲线；与正常组比较，##表示p<0.01；与模型组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图3为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠结肠长度的影响；与正常组比较，##表示p<0.01；与模型组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图4为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠MPO活力的影响；与正常组比较，##表示p<0.01；与模型组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图5为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠结肠组织病理评分的影响。

图6为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠病理形态学的影响。

图7为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠肝脏指数的影响。

图8为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠肝脏组织病理评分的影响。

图9为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠肝脏病理形态学的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。

动物实验采用2.5％葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)溶液诱导C57BL/6小鼠构建UC模型，灌胃给予模型小鼠对羟基苯甲酸钠、对羟基苯甲酸和阳性药美沙拉嗪，分析对羟基苯甲酸钠对UC的改善作用。

1.材料

1.1实验动物

SPF级C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄，体重20±2g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002，合格证号：SYXK(桂)2013-0001。于温度25±2℃、相对湿度55±10％环境中饲养，自由摄食和饮水。适应饲养一周后使用。

1.2实验试剂

对羟基苯甲酸钠；对羟基苯甲酸；美沙拉嗪，上海爱的发制药有限公司，货号：151007；葡聚糖硫酸钠，美国MP Biomedicals公司，货号：160110；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20170717；TRIzol试剂，美国Invitrogen公司，货号：152104；其它试剂均为市售分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.3实验仪器

超低温冰箱(型号：MDF-U74V)，Panasonic；

全波长多功能酶标仪(型号：Epoch)，Biotek；

药品储存柜(型号：YC-300L)，中科美菱低温科技有限责任公司；

光学读数分析天平(型号：BS110S)，北京赛多利斯天平有限公司；

循环式水泵(型号：SHZ-III)，南京科尔仪器设备有限公司；

超纯水仪(型号：Master Touch series)，上海和泰仪器有限公司；

低温高速离心机(型号：Centrifuge 5434R)，eppendorf公司；

超声波清洗仪(型号：KQ2200B)，昆山市超声仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱(型号：GZX-9140MBE)，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

磁力搅拌器(型号：GL-3250C)，Qilinbeier；

微型点动涡旋混合仪(型号：VORTEX-5)，Qilinbeier。

2.实验方法

2.1小鼠结肠炎模型的建立

为考察对羟基苯甲酸钠对DSS诱导小鼠结肠炎的抑制作用，将小鼠随机分成6组：正常组(normal)，模型组(DSS)，对羟基苯甲酸钠(HBSS)低剂量组(10mg/kg)、对羟基苯甲酸钠(HBSS)高剂量组(20mg/kg)、对羟基苯甲酸(HHA)组(20mg/kg)、美沙拉嗪(Mesalazine)组(200mg/kg)，每组8只。正常组自由饮用双蒸水；除正常组外，其余组均自由饮用2.5％DSS 7天，随后自来水饮用3天。

开始造模当日记为d1，记录此时小鼠体重作为初始体重。造模当天开始灌胃给药(0.1mL/10g)，每天一次，连续10天。

葡聚糖硫酸钠、对羟基苯甲酸钠、对羟基苯甲酸、美沙拉嗪均采用双蒸水溶解给药。

2.2疾病活动指数评价

每天观察小鼠精神状态、毛色、大便性状，活动状态和便血等情况，记录小鼠体重、腹泻指数和粪便隐血情况，计算疾病活动指数(DAI)，DAI＝(体重降低+腹泻指数+粪便隐血)3。DAI评分标准详见表1。

表1：DAI评分标准

隐血检测：采用邻甲苯胺法，用棉签挑取少许粪便，先滴加邻甲苯胺冰乙酸溶液0.3mL，然后迅速滴加3％过氧化氢溶液0.3mL，2min内显蓝褐色为阳性。

2.3标本采集

末次给药后1h，自眼底静脉丛采血，4℃静置2h，离心(3500rpm,4℃)15min，吸取上层血清并分装，-80℃冻存备用。于距离***1cm处取出结肠，直尺测量结肠长度并拍照，PBS清洗结肠2次，从靠近直肠端量取结肠0.4cm，置于4％多聚甲醛溶液中固定，剩余结肠-80℃冻存。

2.4结肠MPO活力测定

称取2.3中采集的直肠端结肠组织40mg，加入磷酸盐缓冲液(PBS)制备成10％组织匀浆，按照MPO试剂盒说明书，于460nm处测定吸光度(OD)，根据公式计算得到MPO含量。计算公式如下：

MPO活力单位/g组织＝(测定管OD值-对照管OD值)×2/22.6×取样量(g)。

2.5结肠组织病理学检查

取固定于4％多聚甲醛溶液(不少于24h)的结肠组织，以5％硫酸钠溶液中和36h，流水冲洗过夜，无水乙醇脱水，石蜡包埋切片，常规脱蜡，经苏木素伊红(H&E)染色，中性树脂封片后于光学显微镜观察肠壁病理组织学变化，具体评分细则如下：

(1)肠壁炎症的严重程度，记为1、2和3分，分别代表轻度、中度和重度炎症；

(2)病变严重程度，记为1、2和3分，即病变位于黏膜层、黏膜和黏膜下层及透壁性损伤；

(3)隐窝损害程度，记为1、2、3和4分，即1/3隐窝损害、2/3隐窝损害、隐窝缺失但表面上皮完整和隐窝表面上皮都缺失。

2.6数据分析

所有数据均以means±S.E.M.表示，组间统计学差异采用SPSS软件中one-wayANONA和Dunnett’s检验。p值小于0.05被认为有显著性差异。

3.实验结果

3.1对羟基苯甲酸钠对DSS诱导UC小鼠体重的影响

图1为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导UC小鼠体重的影响，表明：DSS诱导的结肠炎小鼠体重逐渐降低。与正常组相比，模型组小鼠体重明显降低(p＜0.01)；与模型组相比，对羟基苯甲酸钠低剂量组、对羟基苯甲酸钠高剂量组、对羟基苯甲酸组和美沙拉嗪组小鼠的体重降低率明显低于模型组(p＜0.01)，且对羟基苯甲酸钠低剂量组、对羟基苯甲酸钠高剂量组中DSS诱导结肠炎小鼠的体重降低率低于对羟基苯甲酸组和阳性药美沙拉嗪组。

3.2对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠DAI评分的影响

图2为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导UC小鼠DAI评分的影响，表明：DSS诱导的结肠炎小鼠疾病炎症活动指数DAI逐渐升高，主要表现为体重降低、腹泻和便血。与正常组相比，模型组小鼠DAI评分明显升高(p＜0.01)；与模型组相比，对羟基苯甲酸钠低剂量组、对羟基苯甲酸钠高剂量组、对羟基苯甲酸组和美沙拉嗪组的DAI明显降低(p＜0.01)，且对羟基苯甲酸钠低剂量组、对羟基苯甲酸钠高剂量组对DSS诱导结肠炎的抑制作用强于对羟基苯甲酸和阳性药美沙拉嗪。

3.3对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠结肠长度的影响

图3为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠结肠长度的影响，表明：与正常组相比，DSS诱导的结肠炎小鼠结肠长度明显缩短(p＜0.01)。与模型组相比，灌胃给予对羟基苯甲酸钠能保护模型小鼠结肠缩短(p＜0.01)，其抑制结肠缩短的能力强于阳性药美沙拉嗪(p＜0.05)。且对羟基苯甲酸钠在使用剂量为对羟基苯甲酸剂量一半的情况下，其抑制结肠缩短的能力仍然强于对羟基苯甲酸。

3.4对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠MPO活力的影响

图4为对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠MPO活力的影响，表明：与正常组相比，DSS诱导的结肠炎小鼠MPO活力明显增强(p＜0.01)。与模型组相比，灌胃给予对羟基苯甲酸钠明显降低模型小鼠结肠MPO活力(p＜0.01)，其降低MPO活力的能力强于对羟基苯甲酸和阳性药美沙拉嗪(p＜0.05)。且在对羟基苯甲酸钠的剂量为对羟基苯甲酸剂量一半的情况下，其降低模型小鼠结肠MPO活力的能力仍然强于对羟基苯甲酸。

3.5对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠病理形态学的影响

由图5和图6可知，正常组小鼠结肠组织无明显病理改变；模型组小鼠结肠组织病变主要累及粘膜层和粘膜下层，炎细胞类型主要为单核巨噬细胞和中性粒细胞，炎症严重区域局部粘膜层全层坏死，形成溃疡。与正常组相比，模型组小鼠结肠组织炎性细胞浸润、隐窝损伤(p＜0.01)。与模型组相比，灌胃给予对羟基苯甲酸钠(p＜0.01)明显减轻上述组织病理学改变，其对降低组织病变的作用强于对羟基苯甲酸和阳性药美沙拉嗪(p＜0.05)。

3.6对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠肝脏指数的影响

由图7可知，与正常组相比，模型组小鼠肝脏与体重比较高。与模型组相比，对羟基苯甲酸钠低剂量组、对羟基苯甲酸钠高剂量组、对羟基苯甲酸组、美沙拉嗪组小鼠的肝脏指数略低，对羟基苯甲酸钠肝脏指数与对羟基苯甲酸组相比较低。

3.7对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的UC小鼠肝脏H&E的影响

由图8和图9可知，与正常组相比，模型组小鼠肝脏出现少量淋巴细胞浸润，对羟基苯甲酸组小鼠肝脏出现碎片状坏死和淋巴细胞浸润。与对羟基苯甲酸组相比，对羟基苯甲酸钠处理的小鼠的肝脏组织病变程度良好(p＜0.01)。

4.结论与讨论

在剂量明显低于美沙拉嗪的情况下，对羟基苯甲酸钠明显改善DSS诱导的UC模型小鼠体重降低，抑制DAI升高，减轻DSS所致小鼠结肠长度缩短，降低模型小鼠结肠MPO活力，同时减少炎性细胞浸润和组织损伤，相较于同剂量以及高剂量下的对羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸钠对DSS诱导的小鼠结肠炎的抑制作用更好，对肝脏的副作用也不明显。