阅读说明：本技术 γ-谷维素的用途与内包有γ-谷维素的脂质体的用途 (Application of gamma-oryzanol and application of liposome containing gamma-oryzanol ) 是由 平野晶子 木下雅崇 福永丈朗 米田早织 后藤昌史 于 2019-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种γ-谷维素的用途与内包有γ-谷维素的脂质体的用途,用于有效率地获得抗皮肤老化效果的方法。本发明是一种含有γ-谷维素(优选内包有γ-谷维素的脂质体)的抗皮肤老化外用组合物。(The invention provides an application of gamma-oryzanol and an application of liposome containing the gamma-oryzanol, and a method for efficiently obtaining an anti-skin aging effect. The present invention is an anti-skin aging external composition containing gamma-oryzanol (preferably liposome internally containing gamma-oryzanol).)

γ-谷维素的用途与内包有γ-谷维素的脂质体的用途

技术领域

本发明涉及一种γ-谷维素的用途与内包有γ-谷维素的脂质体的用途等。

背景技术

近年来，尤其在美容领域中，取得抗皮肤老化效果的外用组合物的需求越来越高。其中，对于抑制皮肤的皱纹或松弛的关心非常高。

作为在皮肤中形成皱纹或松弛的一个原因，可列举光(紫外线，特别是长波紫外线(Ultraviolet A，UVA))对于皮肤的照射。认为光中的紫外线(特别是UVA)到达真皮为止，经由活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)的生成而伤害组织，并引起皮肤老化(例如表皮的肥厚、深且大的皱纹的形成或松弛)(非专利文献1)。因此，期待在皮肤中取得抗氧化效果的成分抑制ROS的生成，由此抑制皮肤老化。

另外，真皮弹性纤维或胶原纤维的分解及减少与皮肤光老化相关联。而且，已知基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)与真皮结构成分的分解相关联，尤其MMP-1、MMP-2、及MMP-9等使构成基底膜的IV型胶原蛋白，或构成真皮的弹性蛋白、I型胶原蛋白、及III型胶原蛋白分解。MMP使真皮胶原蛋白或基底膜分解，皮肤结构变得无法保持，由此皮肤大幅度地凹陷，而达到形成深的皱纹。尤其，也认为因UV照射或ROS暴露而从角化细胞(keratinocyte)或成纤维细胞(fibroblast)中衍生出MMP-2或MMP-9(非专利文献1)。另外，也有如下的报告：MMP-1在自然老化皮肤及光老化皮肤的任一者中活性均高，尤其在光老化皮肤中活性更高(非专利文献2)。因此，期待抑制ROS的生成的成分之中，也可以抑制MMP的衍生的成分对于抗皮肤老化特别有效。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2007-246436号公报

非专利文献

非专利文献1：四国医学杂志63卷5，6号219～223 12月20日，2007

非专利文献2：Chung JH、Seo JY、Choi HR等人：《在体内调节老化及光老化人体皮肤的皮肤胶原蛋白代谢(Modulation of skin collagen metabolism in aged andphotoaged human skin in vivo)》.《皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol)》117；1218-1224：2001

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于提供一种用于有效率地获得抗皮肤老化效果的方法。

解决问题的技术手段

本发明人等人发现γ-谷维素(oryzanol)是不仅可以取得ROS生成抑制效果，也可以取得MMP衍生抑制效果的优异的抗皮肤老化原材料，进而发现通过将γ-谷维素内包在脂质体(liposome)中来使用，可获得更优异的抗皮肤老化效果的可能性，进而重复改良而完成了本发明。

本发明例如包含以下的项目中记载的主体。

项1.

一种抗皮肤老化外用组合物，其包括γ-谷维素。

项2.

根据项1中记载的组合物，其用于抑制活性氧的产生和/或用于抑制基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的产生。

项3.

一种抗皮肤老化外用组合物，其包括内包有γ-谷维素的脂质体。

项4.

根据项3中记载的组合物，其用于抑制基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的产生和/或用于抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的产生。

项5.

根据项1或项3中记载的组合物，其中皮肤老化是皱纹或松弛。

项6.

根据项1～项5的任一者中记载的组合物，其中皮肤老化是由光所引起的皮肤老化。

项7.

根据项1～项6的任一者中记载的组合物，其是化妆品组合物。

发明的效果

通过本发明，而提供一种取得优异的抗皮肤老化效果的外用组合物。

附图说明

图1表示针对γ-谷维素，评估对于对成纤维细胞照射了紫外线(UVA)时产生的活性氧簇(ROS)的产生的效果的结果。

图2表示针对γ-谷维素，评估对于对成纤维细胞照射了紫外线(UVA)时的MMP-1的产生的效果的结果。

图3表示利用实时聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)对通过γ-谷维素而使抗氧化基因(核因子红细胞2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid 2RelatedFactor 2，Nrf2)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸:醌氧化还原酶1(Nicotinamide AdenineDinucleotide Phosphate quinone oxidoreductase 1，Nqo1)、血红素加氧酶-1(HemeOxygenase-1，HO-1)、及超氧化物歧化酶1(Superoxide Dismutase 1，SOD1))的表达量如何变化进行分析的结果。

图4表示利用实时PCR对通过内包有γ-谷维素的脂质体而使抗氧化基因(Nrf2及Nqo1)的表达量如何变化进行分析的结果。

具体实施方式

以下，对本发明的各实施方式进行更详细的说明。

本发明中所包含的抗皮肤老化组合物是含有γ-谷维素的外用组合物(优选含有内包有γ-谷维素的脂质体的外用组合物)。以下，有时将所述组合物称为本发明的抗皮肤老化外用组合物。

脂质体是通过利用大量的水对将磷脂质作为主体的脂质进行水合所形成的具有双分子膜的脂质囊泡。脂质体根据脂质分子膜层的数量来分类，具体而言，被分类成多重膜脂质体(多层囊泡(Multilamellar Vesicle，MLV))与单层膜脂质体(单层囊泡(Unilamellar Vesicle，ULV))。另外，单层膜脂质体有时对应于脂质囊泡的大小而进一步进行分类，具体而言，按从小到大的顺序分类成小单层囊泡(Small Unilamellar Vesicle，SUV)、大单层囊泡(Large Unilamellar Vesicle，LUV)、巨单层囊泡(Giant UnilamellarVesicle，GUV)。在本发明中，脂质体可以是它们中的任一者。优选MLV。在本发明中，脂质体的大小并无特别限制，但作为平均粒径，例如优选30nm～1000nm，更优选30nm～600nm，进而更优选50nm～300nm。

在含有内包有γ-谷维素的脂质体的外用组合物中，内包在脂质体中的γ-谷维素量也无特别限制，但例如相对于脂质体膜成分(优选脂质体中所含有的磷脂质)10质量份，例示0.2质量份～3质量份左右、0.5质量份～2质量份、或1质量份～1.5质量份左右。

另外，在本发明的抗皮肤老化外用组合物中，优选在所述组合物中含有例如0.001质量％～5质量％左右、0.005质量％～4.5质量％左右、0.01质量％～4质量％左右、0.02质量％～2.5质量％左右、0.05质量％～1质量％左右、或0.05质量％～0.5质量％左右的γ-谷维素。另外，例如也优选含有0.001质量％～0.01质量％左右的γ-谷维素，尤其当以未内包在脂质体中的状态含有γ-谷维素时，优选含有0.001质量％～0.01质量％左右。

另外，当所述组合物是含有内包有γ-谷维素的脂质体的外用组合物时，优选内包在脂质体中的γ-谷维素的相对于所述组合物的含量例如为0.01质量％～5质量％左右、0.02质量％～2.5质量％左右、0.05质量％～1质量％左右、或0.05质量％～0.5质量％左右。另外，优选所述组合物中所含有的γ-谷维素之中，例如80质量％～100质量％、90质量％～100质量％、或实质上100质量％包含在内包有γ-谷维素的脂质体中。另外，所述组合物中所含有的γ-谷维素之中，实质上100质量％包含在内包有γ-谷维素的脂质体中意味着当以使所有γ-谷维素内包在脂质体中的方式制造组合物时，也包含不可避免地在脂质体外也存在γ-谷维素的情况。

作为使γ-谷维素包含在脂质体中的方法，可使用众所周知的方法或可根据众所周知的方法而容易地想到的方法，通常可作为脂质体分散在水溶液中的状态，即脂质体悬浮液而获得。脂质体悬浮液的制造方法并无特别限定，例如可列举以下的方法。(1)将磷脂质、内包在脂质体中的成分(包含谷维素；以下相同)、及视需要的其他抗氧化剂等均质地混合后，进行水合，而形成脂质体的方法(所述水合优选利用包含pH调整剂、多元醇、糖类等的水溶液来进行)。(2)使磷脂质、内包在脂质体中的成分、及视需要的其他抗氧化剂等溶解在醇、多元醇等中，利用包含pH调整剂、多元醇、糖类等的水溶液进行水合，而制备脂质体的方法。(3)使用超声波、法压壶(french press)或均化器，使磷脂质、内包在脂质体中的成分、及视需要的其他抗氧化剂等在水中复合化，而制备脂质体的方法。(4)使磷脂质、内包在脂质体中的成分、及视需要的其他抗氧化剂等混合溶解在乙醇中，将此乙醇溶液添加至氯化钾水溶液中后去除乙醇，而制备脂质体的方法。γ-谷维素可以直接使用，可在事先溶解在少量的溶剂(例如水或水系溶剂)中后使用。

作为使用的磷脂质，并无特别限制，但例示：大豆卵磷脂、菜籽卵磷脂、玉米卵磷脂、棉籽油卵磷脂、向日葵卵磷脂、蛋黄卵磷脂、蛋白卵磷脂、花生卵磷脂等。卵磷脂也被称为磷脂酰胆碱或1,2-二酰基甘油-3-磷酸胆碱，通常在甘油的1位及2位上键结有脂肪酸。在本发明中，例如优选使用在1位及2位两者或一者上键结有碳数12～24的不饱和脂肪酸的卵磷脂，更优选使用在1位上键结有碳数12～24的饱和脂肪酸、在2位上键结有碳数12～24的不饱和脂肪酸的卵磷脂。此处，饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸可为直链状及分支状的任一种。另外，也可以使用卵磷脂衍生物来代替卵磷脂，或除卵磷脂以外，使用卵磷脂衍生物。作为卵磷脂衍生物，可例示：氢化卵磷脂，或将聚乙二醇、氨基聚糖类等导入所述例示的卵磷脂中的磷脂质中而成的化合物。其中，优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂，特别优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂。另外，也可以优选使用提高了卵磷脂中所存在的磷脂质(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂(sphingomyelin)等)的纯度的精制卵磷脂。这些卵磷脂或卵磷脂衍生物可使用一种、或将两种以上组合使用。本发明中所使用的卵磷脂也能够以商业方式从例如SLP-PC35(磷脂酰胆碱(以下有时略记为PC)含量35％)、SLP-PC70(PC含量70％)、SLP-White Lyso(溶血卵磷脂)(以上，辻制油(股份)公司制造)；蛋黄卵磷脂LPL-20S、LPL-20W(溶血磷脂质含量约20％)，蛋黄卵磷脂PL-30S(磷脂酰胆碱含量约30％)(以上，丘比(Kewpie)(股份)公司制造)；大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、甘油磷酸胆碱(以上，H.荷尔斯泰因(H.Holstein)公司制造)；莱七格林(Lecigran)(粉末卵磷脂)、米塔林(Metarin)(分馏卵磷脂)、莱七姆森(Lecimulthin)(粉末溶血卵磷脂)(以上，嘉吉(Cargill)公司制造)；莱萨恩P(Lecion P)(磷脂质含量90％以上)、Lecion LP-1(卵磷脂含量约70％)、莱七迈乐(Lecimale)(酶分解卵磷脂，磷脂质含量50％)(以上，理研维他命(Riken Vitamin)公司制造)；力至优PS25(Nichiyu PS25)(磷脂酰丝氨酸含量约25％)、Nichiyu PS50(磷脂酰丝氨酸含量约50％)；桑卵磷脂A-1(San lecithin A-1)(酶分解大豆卵磷脂，卵磷脂含量约30％)等获得。

本发明的抗皮肤老化外用组合物对于皮肤老化之中，特别是皮肤的皱纹或松弛有效果，可以为了抑制皮肤的皱纹或松弛而优选地使用。另外，也可以为了抑制由年龄增长所引起的皮肤老化而使用，但可以尤其为了抑制由光所引起的皮肤老化而优选地使用。可以为了抑制由光中的紫外线(特别是UVA)的照射所引起的皮肤老化而优选地使用。

另外，本发明的抗皮肤老化外用组合物可优选地用作活性氧(ROS)产生抑制用组合物和/或基质金属蛋白酶(MMP)产生抑制用组合物。可对MMP中的MMP-1、MMP-2、MMP-9良好地发挥MMP产生抑制效果。

当本发明的抗皮肤老化外用组合物为含有内包有γ-谷维素的脂质体的外用组合物时，可对MMP-2、MMP-9特别良好地发挥MMP产生抑制效果。另外，当本发明的抗皮肤老化外用组合物为含有脂质体非内包γ-谷维素的外用组合物时，可对MMP-1特别良好地发挥MMP产生抑制效果。

例如，可在γ-谷维素中添加其他成分来用作本发明的抗皮肤老化外用组合物。另外，例如作为本发明的抗皮肤老化外用组合物，可以直接使用所述脂质体悬浮液，也可以在所述脂质体悬浮液中进一步添加其他成分来使用。

作为其他成分，例如可调配高分子、蛋白质及其水解物、粘多糖(mucopolysaccharide)类等。作为高分子，例如可例示羧基乙烯基聚合物、黄原胶、海藻酸钠等，但并不限定于这些高分子。优选羧基乙烯基聚合物、黄原胶，特别优选羧基乙烯基聚合物。这些高分子等可使用一种、或将两种以上组合使用。高分子的调配量并无特别限定，但为0.001％～20％，优选0.005％～10％，特别优选0.01％～5％。作为蛋白质及其水解物，可列举胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、酪蛋白、它们的水解物、水解物的盐、水解物的酯、或经酶处理而成者，特别优选胶原蛋白。蛋白质及其水解物的调配量并无特别限定，但为0.001％～5％，优选0.01％～1％。作为粘多糖，可列举硫酸软骨素(chondroitinsulfate)、透明质酸、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、硫酸粘液素(mucoitin sulfate)、肝素与其衍生物、及它们的盐类等，特别优选硫酸软骨素、透明质酸及它们的钠盐。粘多糖的调配量并无特别限定，但为0.0005％～5％，优选0.001％～1％。

另外，除此以外，也可以在无损本发明的效果的范围内，调配通常用于外用组合物的众所周知的成分(包含在脂质体分散液的连续相中)。作为此种成分，可例示：保湿剂、水溶性高分子、油成分、着色剂、抗氧化剂、金属螯合剂、防腐剂、pH调整剂、清凉剂、香料、紫外线吸收·散射剂、抗氧化剂、药效成分等。

另外，当本发明的抗皮肤老化外用组合物含有内包有γ-谷维素的脂质体时，在脂质体的制备过程中，也可以在无损本发明的效果的范围内，使用通常可包含在脂质体中的成分。例如可例示：抗坏血酸等抗氧化剂，乳酸、柠檬酸等有机酸，磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺等脂质，壳聚糖(chitosan)、岩藻多糖(fucoidan)、透明质酸等天然高分子，聚乙二醇、羧基乙烯基聚合物等合成高分子，海藻糖(trehalose)、乳果糖(lactulose)、麦芽糖醇(maltitol)等糖质，甘油等多元醇等。

本发明的外用组合物优选用作特别适用于皮肤的组合物。作为外用组合物，例如例示药品组合物、准标准药物(quasi drug)组合物、及化妆品组合物。作为剂型，并无特别限定，但可列举面膜、膏、软膏、乳霜、凝胶、护肤液、乳液、美容液、化妆水、喷雾剂等。

本发明的抗皮肤老化外用组合物的适用对象并无特别限定，但优选期望抗皮肤老化(特别是皱纹或松弛的抑制)的人。

如上所述，本发明的抗皮肤老化外用组合物通过抗氧化基因表达增强来取得抑制(特别是减少)活性氧(ROS)的效果、和/或抑制基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase，MMP)的效果，由此发挥抗皮肤老化。因此，本发明也包含：含有γ-谷维素(优选内包有γ-谷维素的脂质体)的抗氧化基因表达增强用外用组合物、及含有γ-谷维素(优选内包有γ-谷维素的脂质体)的MMP抑制用外用组合物。

作为抗氧化基因，例如可列举：Nrf2(NFE2related factor 2)、Nqo1(NAD(P)Hquinone oxidoreductase 1)、HO-1(heme oxygenase-1)、及SOD1(Superoxide dismutase1)等。优选选自由Nrf2、Nqo1、HO-1、及SOD1所组成的群组中的至少一种抗氧化基因，特别优选Nrf2基因和/或Nqo1基因。

另外，作为被抑制的MMP，可特别优选地列举MMP-1、MMP-2、及MMP-9。

另外，Nrf2是通过活性氧等而活化，统一地控制高等动物中的氧化应激适应反应的转录因子。Nrf2增强作为亲电子性物质的解毒酶的谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase，GST)或Nqo1等异物代谢酶、谷胱甘肽合成酶等的基因表达，对亲电子性物质进行解毒。已知血红素加氧酶1(HO-1)通过以氧化应激为首的各种急性应激来衍生，其也是Nrf2靶向基因的一种。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是将已在细胞内产生的活性氧分解的酶，在哺乳动物中存在三种SOD，SOD1存在于细胞质中。

另外，在本说明书中，所谓“含有”，也包含“本质上由……组成”与“由……组成”(The term“comprising”includes“consisting essentially of”and“consisting of.”)。

实施例

以下，更具体地说明本发明，但本发明并不限定于下述的例子。另外，以下只要事先无特别说明，则表示各种组合物中的成分含有比例的％表示质量％(w/w％)。CO₂浓度的％为v/v％。另外，关于细胞、培养基及培养基关联试剂，全部购入市售品来使用。

对于由紫外线照射所引起的活性氧产生的效果的研究

针对γ-谷维素，评估对于对成纤维细胞照射了紫外线(UVA)时产生的活性氧簇(以下ROS)的产生的效果。

＜使用材料＞

·来自53岁女性的人皮肤成纤维细胞(以下称为高密度纤维板(high densityfiberboard，HDF)53)

·HDF53用培养基：在低限量Eagle培养基(Minimum Essential Medium Eagle)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)，M4655)中添加10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)及1％抗生物质(基波修^TM(Gibco^TM)，15240062)来制备。以下设为MEM(+)。

·磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)(西格玛奥德里奇，D8537)

·2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2',7'-DichlorodihydrofluoresceinDiacetate，DCFH-DA)(西格玛奥德里奇)

另外，DCFH-DA探针分散在细胞内，通过细胞内酯酶而脱乙酰化，变成非荧光型2',7'-二氯二氢荧光素(DCFH)，进而通过ROS而迅速地氧化，并变化成强烈地发出荧光的二氯二氢荧光素(DCF)。由此，可通过荧光强度来测定细胞内的ROS量。

·珀瑞米克斯WST-1(Premix WST-1)细胞增殖检测系统(Cell ProliferationAssay System)(宝生物工程(TaKaRa Bio)，MK400)(以下WST-1)

另外，WST-1是用于通过显色测定来对细胞生存能力进行定量的试剂。将利用活细胞中的线粒体脱氢酶所进行的四唑盐(WST-1)朝甲臜染料(formazan dye)的转换作为基本，若活细胞数增加，则样品中的线粒体脱氢酶的整体的活性增加，所述酶活性的增加导致甲臜染料的生成增加，因此甲臜染料与培养基中的具有代谢活性的细胞的数量显示线性相关。

＜实验操作＞

以1.2×10⁴cells/well将HDF53接种在48孔孔板(well plate)中，在37℃、CO₂5％培养箱(incubator)内培养3日(使用培养基：MEM(+))直至变成融合为止。3日后，将MEM(+)去除并利用PBS进行一次清洗，然后在各孔中各添加200μl的新的PBS。以6000mJ/cm²对所述HDF53照射UVA。将PBS抽吸去除，并利用新的PBS进行一次清洗。在各孔中各添加500μl的含有50μg/ml的γ-谷维素的MEM(+)。在各孔中各添加3μl的5mM的DCFH-DA(二(乙酰基甲酯)(6-羧基-2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯))(最终浓度为30μM)。在37℃、CO₂5％培养箱内培养30分钟。将培养基抽吸去除，并利用PBS进行一次清洗。在各孔中各添加300μl的新的PBS。利用GEMINI XPS(美谷分子仪器(Molecular Devices))，以激发488nm/发射530nm的波长测定荧光强度。其后，将PBS抽吸去除，在各孔中各添加500μl的含有稀释了10倍的WST-1的MEM(+)，然后在37℃、CO₂5％培养箱内培养2小时。利用xMark微孔板分光光度计(Microplate Spectrophotometer)(伯乐(BIO RAD))测定450nm的吸光度。此实验以N＝3来实施。另外，将不含γ-谷维素的MEM(+)作为对照物(control)。

将经测定的荧光强度示于图1中。但是，图1中所示的荧光强度是使由GEMINI XPS所测定的荧光强度除以细胞生存率并进行修正所得的值。在使用WST-1的研究中，使由xMark所测定的各孔的吸光度除以未照射UVA的对照物的吸光度的平均值，由此算出细胞生存率。另外，将未照射UVA的对照物中的生存率设为“1”。另外，在图1中，﹡表示p＜0.05，﹡﹡表示p＜0.01(均利用T检验(T-test))。

对于由紫外线照射所引起的MMP-1产生的效果的研究

针对γ-谷维素，评估对于对成纤维细胞照射了紫外线(UVA)时的MMP-1的产生的效果。

＜使用材料＞

·来自53岁女性的人皮肤成纤维细胞(以下称为HDF53)

·HDF53用培养基：在低限量Eagle培养基(西格玛奥德里奇，M4655)中添加10％FBS及1％抗生物质(Gibco^TM，15240062)来制备。以下也称为MEM(+)。

·PBS(西格玛奥德里奇，D8537)

·汉克平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)(西格玛奥德里奇，H8264)

·Premix WST-1细胞增殖检测系统(宝生物工程，MK400)(以下WST-1)

·人总基质金属蛋白酶-1(Human Total MMP-1)(R&D系统(R&D systems)，DY901B)﹡MMP-1检测用酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)试剂盒

·双联辅助试剂试剂盒2(DuoSet Ancillary Reagent Kit2)(R&D系统，DY008)

＜实验操作＞

以1.2×10⁴cells/well将HDF53接种在48孔孔板中，在37℃、CO₂5％培养箱内培养3日(使用培养基：MEM(+))直至变成融合为止。3日后，将MEM(+)去除并利用HBSS进行一次清洗，然后在各孔中各添加200μl的新的HBSS。以8000mJ/cm²对所述HDF53照射UVA。将HBSS抽吸去除，并利用PBS进行一次清洗。在各孔中各添加500μl的含有50μg/ml的γ-谷维素的MEM(+)，在37℃、CO₂5％培养箱内培养72小时。72小时后，回收培养基并以12000rpm进行1分钟离心分离，然后在-30℃下保管直至回收并使用上清液为止。另外，将各孔的剩余的培养基抽吸去除，并利用新的PBS进行一次清洗。在各孔中各添加300μl的含有稀释了10倍的WST-1的MEM(+)，然后在37℃、CO₂5％培养箱内培养2小时。培养后，利用xMark微孔板分光光度计(伯乐)测定450nm的吸光度。另外，按照艾丽萨(ELISA)试剂盒附属的实验操作流程进行经离心分离所获得的培养基上清液中的MMP-1的浓度测定。在ELISA的测定中，吸光度是利用xMark微孔板分光光度计(伯乐)测定450nm的吸光度。

此实验以N＝3来实施。另外，将不含γ-谷维素的MEM(+)作为对照物。

将经测定的MMP-1的浓度示于图2中。但是，图2中所示的浓度是在ELISA的测定中，使由xMark所测定的吸光度除以细胞生存率并进行修正所得的值。在使用WST-1的研究中，使由xMark所测定的各孔的吸光度除以未照射UVA的对照物的吸光度的平均值，由此算出细胞生存率。另外，将未照射UVA的对照物中的生存率设为“1”。另外，在图2中，﹡﹡表示p＜0.01(利用T检验)。

抗氧化基因表达的研究

使用正常人表皮角质形成细胞(Normal Human Epidermal Keratinocytes，NHEK)(正常人表皮角化细胞；来自新生儿)，对抗氧化基因的表达是否因含有γ-谷维素的组合物或含有内包有γ-谷维素的脂质体的组合物而变化进行研究。

＜增殖培养基制备方法＞

向恒温化成37℃的修穆迪(Humedia)-KB2培养基500mL中添加同样进行了恒温化的胰岛素0.5ml、人表皮生长因子(human Epidermal Growth Factor，hEGF)0.5ml、氢化皮质醇0.5ml、牛脑垂体提取液(Bovine Pituitary Extract，BPE)2ml、庆大霉素/两性霉素B0.5ml(抗菌剂)。将其缓慢地混合后，保存为4℃。

＜冷冻NHEK细胞的解冻及培养基更换方法＞

在37℃的恒温槽中将两瓶放入有冷冻NHEK细胞的安瓿解冻。解冻后，在事先分注至15ml管中的4℃的Humedia-KG2培养基6ml中混合细胞溶液。将事先恒温化成37℃的Humedia-KG2培养基39ml朝三个烧瓶中各移入13ml。将经混合的细胞溶液朝粘附细胞培养烧瓶(苏米龙(SUMILON)250mL)中各移入2ml，以细胞变得均匀的方式进行混合后，暂时静置。在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。次日以后，每日进行一次培养基更换，直至细胞密度融合至80％为止。

＜NHEK细胞的继代培养方法＞

对增殖培养基进行抽吸，添加恒温化成37℃的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液5mL，轻轻地清洗细胞层。对HEPES缓冲液进行抽吸，添加0.25％胰蛋白酶溶液2mL，并在37℃、5％CO₂培养箱中静置3分钟。其后，将粘附在烧瓶底面上的细胞剥下(轻敲***边缘，将细胞剥下)。向其中添加恒温化成37℃的胰蛋白酶中和液4mL后使胰蛋白酶的反应停止。将细胞悬浮液回收至50ml猎鹰管(falcon tube)中，并进行离心(RT，1,000rpm，5min)。对上清液进行抽吸，将其混合至Humedia-KG2培养基10ml中后，利用血球计数板对细胞数进行计测。其后，以培养基量为950μL，细胞数变成1.33×10⁵个的方式在粘附细胞24孔板中播种。次日，进行培养基更换。

＜试样添加方法＞

对增殖培养基进行抽吸，利用1ml的PBS进行清洗后，添加混合在Humedia-KB2培养基1ml中的试样(γ-谷维素或牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA))，并培养24小时。另外，γ-谷维素是以培养基中的γ-谷维素终浓度变成10μg/ml、50μg/ml、或100μg/ml的方式添加。BSA是以终浓度变成约0.14％的方式添加。γ-谷维素是从奥力榨(Oryza)油化股份有限公司购入来使用。

＜细胞回收方法＞

对Humedia-KB2培养基进行抽吸，并利用1ml的PBS进行清洗。对PBS进行抽吸，添加RLT(细胞溶解液)350μl，利用平板振荡器振荡3分钟。利用聚氯乙烯绝缘带(vinyl tape)覆盖24孔板的四周，并保存为-80℃。

＜互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)的制作＞

从-80℃取出24孔板，并利用恒温槽进行解冻。添加350μl的70％乙醇(EtOH)，并利用平板振荡器振荡3分钟。总核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)样品使用R萘斯迷你试剂盒(RNeasy Mini Kit)(凯杰(Qiagen)公司)来提取。利用纳农迪隆波(NANODROP 2000)分光光度计(赛默飞科技(Thermo SCIENTIFIC))测定RNA浓度，并使用珀莱米思科瑞特RT试剂试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit)(宝生物工程公司)，从约500ng的总RNA制作cDNA。

＜实时PCR＞

向Primix Ex Taq(宝生物工程公司)10μl中添加引物(primer)、ROX染料II与无RNA水，制备18μl的混合液，然后添加2μl(约50ng)的cDNA样品，针对各引物制备实时PCR测定样品。作为内源性对照物，选择β-肌动蛋白、或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，作为靶向抗氧化基因，选择Nrf2、Nqo1、HO-1、及SOD1。利用实时PCR标准7500(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行靶向基因的表达分析(相对定量)。将利用校准曲线法的分析结果示于图3中。另外，图3的结果是将β-肌动蛋白用作内源性对照物进行分析的结果。另外，图3表示将添加有BSA的培养基中的基因表达量设为1时的各培养基中的基因表达量比。另外，在图3中，+、﹡、﹡﹡、﹡﹡﹡分别表示与对照物(添加有BSA)相比具有显著差异(+：P＜0.1，﹡：P＜0.05，﹡﹡：P＜0.01，﹡﹡﹡：P＜0.001)

另外，用于PCR的各引物的碱基序列如下所示。(F：正向引物，R：反向引物)

β-肌动蛋白

F：TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC

R：ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG

GAPDH

F：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC

R：TGGTGAAGACGCCAGTGGA

Nrf2

F：CTTGGCCTCAGTGATTCTGAAGTG

R：CCTGAGATGGTGACAAGGGTTGTA

Nqo1

F：GGATTGGACCGAGCTGGAA

R：AATTGCAGTGAAGATGAAGGCAAC

HO-1

F：AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC

R：AAAGCCCTACAGCAACTGTCG

SOD1

F：AGTGCAGGGCATCATCAATTTC

R：CCATGCAGGCCTTCAGTCAG

＜脂质体的制备＞

以变成表1中所示的组成(合计100％)的方式将原料混合，利用高压乳化机(Starburst Mini HJP-25001：杉野机械(Sugino Machine)(股份)公司制造)以200Mpa、穿过五次的条件进行处理，而制备脂质体悬浮液(含有内包有γ-谷维素的脂质体)。另外，γ-谷维素是从奥力榨油化股份有限公司购入来使用。卵磷脂是从日油股份有限公司购入大豆卵磷脂来使用。另外，已制作的脂质体通过穿透式电子显微镜HT7700(日立(HITACHI))来确认存在。

[表1]

在以下的研究中，使用所获得的脂质体悬浮液(内包有0.5％γ谷维素的脂质体悬浮液、及空脂质体悬浮液)。

＜细胞的三维培养＞

使用作为三维(3D)皮肤模型制作用工具的艾皮德密200X(Epiderm 200X)试剂盒及EPI-100MM培养基(均为库拉博(Kurabo)公司)，培养三维皮肤模型。具体而言，使用Epiderm 200X试剂盒，以如下的程序来制作。向粘附细胞24孔板中添加事先恒温化成37℃的EPI-100MM培养基500μl。将放入有三维皮肤模型的内置罩杯(insert cup)以气泡不进入的方式移至粘附细胞24孔板中。在37℃、5％CO₂培养箱中培养2小时～3小时，而制作3D皮肤模型。

＜基因表达研究＞

将试样(内包有0.5％γ谷维素的脂质体悬浮液、或空脂质体悬浮液)40μl添加至3D皮肤模型上部，并培养24小时。其后，对培养基进行抽吸，一边注意不使组织崩溃，一边利用PBS对3D皮肤模型上部进行三次清洗。利用手术刀从内置罩杯中切出3D皮肤模型与薄膜，其后从3D皮肤模型中剥下薄膜。将3D皮肤模型放入细胞存储用管中，利用液态氮进行冷冻并在-80℃下保存。其后，以与所述方法相同的方式提取RNA来制作cDNA，并进行实时PCR来对基因(Nrf2及Nqo1)表达进行分析。将利用计算机断层成像(Computed tomography，Ct)法所得的分析结果示于图4中。另外，图4的结果是将GAPDH用作内源性对照物进行分析的结果。另外，在图4中，+、﹡分别表示与对照物(空脂质体)相比具有显著差异(+：P＜0.1，﹡：P＜0.05)。

＜微阵列分析＞

使用如所述那样制备的3D皮肤模型细胞的RNA进行DNA微阵列分析，对MMP-2基因及MMP-9基因的表达进行研究。作为DNA微阵列，使用DNA芯片格农普(Genopal)皮肤芯片(三菱化学(Mitsubishi Chemical)股份有限公司)。将基准样品(即，添加空脂质体所培养的3D皮肤模型细胞的RNA)的修正值设为1时的添加内包有γ-谷维素的脂质体所培养的3D皮肤模型细胞的RNA的表达量是MMP-2基因为0.68，MMP-9基因为0.78。因此，也可知在内包有γ-谷维素的脂质体中存在抑制MMP-2及MMP-9基因的表达的倾向。

<110> 太阳星光齿磨公司

<120> γ-谷维素的用途与内包有γ-谷维素的脂质体的用途

<130> P19-510JP

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-肌动蛋白（β-actin）的正向引物

<400> 1

ttgttacagg aagtcccttg cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-肌动蛋白（β-actin）的反向引物

<400> 2

atgctatcac ctcccctgtg tg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH的正向引物

<400> 3

gcaccgtcaa ggctgagaac 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH的反向引物

<400> 4

tggtgaagac gccagtgga 19

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nrf2的正向引物

<400> 5

cttggcctca gtgattctga agtg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nrf2的反向引物

<400> 6

cctgagatgg tgacaagggt tgta 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nqo1的正向引物

<400> 7

ggattggacc gagctggaa 19

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nqo1的反向引物

<400> 8

aattgcagtg aagatgaagg caac 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HO-1的正向引物

<400> 9

aagactgcgt tcctgctcaa c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HO-1的反向引物

<400> 10

aaagccctac agcaactgtc g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOD1的正向引物

<400> 11

agtgcagggc atcatcaatt tc 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOD1的反向引物

<400> 12

ccatgcaggc cttcagtcag 20