阅读说明：本技术 ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用 (Application of ssc-miR-151-3p in preparation of medicine for regulating replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus ) 是由 张婧 卢曾军 孙普 李凤娟 曹轶梅 李冬 刘在新 于 2020-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用,属于抗病毒药物技术领域。本发明提供了ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用,所述ssc-miR-151-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明为研究拮抗PRRSV病毒复制的药物提供了新靶标,也为深入认识PRRSV感染后宿主抗病毒信号通路提供了候选miRNA。(The invention relates to application of ssc-miR-151-3p in preparation of a medicine for regulating replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, and belongs to the technical field of antiviral medicines. The invention provides application of ssc-miR-151-3p in preparation of a medicine for regulating replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, wherein a nucleotide sequence of the ssc-miR-151-3p is shown in SEQ ID No. 1. The invention provides a new target for researching drugs for antagonizing PRRSV virus replication and also provides a candidate miRNA for deeply knowing a host antiviral signal path after PRRSV infection.)

ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的 药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗病毒药物技术领域，具体涉及ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用。

背景技术

微小非编码RNA(miRNA)是生物体内源长度约为20～25个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA互补配对，在转录后水平对基因的表达进行负调控，主要通过抑制mRNA翻译或诱导mRNA降解。miRNA参与调控动物体发育、细胞增殖与死亡、免疫应答等各种生物学过程。近年来，越来越多的研究表明miRNA是机体先天性/获得性免疫以及宿主-病原体相互作用的复杂网络中不可或缺的调节因子，在宿主与病毒互作中扮演着重要角色。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和生长育肥猪呼吸困难为主要特征的高度接触性传染病，每年给世界养猪业造成巨大的损失，现已成为严重影响养猪生产的主要疫病。它的病原PRRSV，是一种单股正链RNA病毒，猪是其唯一的天然宿主，主要靶向猪肺泡巨噬细胞(PAM)，破坏宿主免疫系统，引起严重的免疫抑制，致使获得性免疫应答延迟甚至缺陷，造成持续性感染。现有的疫苗难以有效的防控该病，迫切需要发展新的抗病毒策略。

发明内容

本发明的目的在于提供ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用。本发明为研究拮抗PRRSV病毒复制的药物提供了新靶标，也为深入认识PRRSV感染后宿主抗病毒信号通路提供了候选miRNA。

本发明提供了ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc-miR-151-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上调ssc-miR-151-3p表达的物质在制备拮抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc-miR-151-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用。试验结果表明，在PAM细胞中上调ssc-miR-151-3p的表达量可以抑制PRRSV复制，下调该miRNA的表达量可以促进PRRSV复制。本发明为研究拮抗PRRSV病毒复制的药物提供了新靶标，为开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为深入认识PRRSV感染后宿主拮抗病毒复制机制提供了候选miRNA。

附图说明

图1为本发明提供的PAM细胞以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，24小时后提取总细胞miRNA，实时荧光定量PCR结果；

图2为本发明提供的PAM细胞中分别转染阴性对照和ssc-miR-151-3p的模拟物，24小时后提取细胞总miRNA，实时荧光定量PCR结果；

图3为本发明提供的PAM细胞中分别转染阴性对照和ssc-miR-151-3p抑制剂，24小时后提取细胞总miRNA，实时荧光定量PCR结果；

图4为本发明提供的PAM细胞中分别转染阴性对照和ssc-miR-151-3p模拟物，24小时后，以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，感染24小时后提取总RNA，实时荧光定量PCR结果；

图5为本发明提供的PAM细胞中分别转染阴性对照和ssc-miR-151-3p抑制剂，24小时后，以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，感染24小时后提取总RNA，实时荧光定量PCR结果。

具体实施方式

本发明提供了ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc-miR-151-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(CUAGACUGAAGCUCCUUGAGGA)。

本发明还提供了上调ssc-miR-151-3p表达的物质在制备拮抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc-miR-151-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明具体实施例中，感染PPRSV毒株GSWW/2015 24小时后，ssc-miR-151-3p在猪肺泡巨噬细胞(PAM)中的表达量下降。在PAM细胞中上调ssc-miR-151-3p的表达量(ssc-miR-151-3p模拟物，SEQ ID NO.1，(5’-3’)CUAGACUGAAGCUCCUUGAGGA)可以抑制PRRSV复制，下调该miRNA的表达量(ssc-miR-151-3p抑制剂，SEQ ID NO.2，UCCUCAAGGAGCUUCAGUCUAG)可以促进PRRSV复制。本发明为研究拮抗PRRSV病毒复制的药物提供了新靶标，也为深入认识PRRSV感染后宿主抗病毒信号通路提供了候选miRNA。

下面结合具体实施例对本发明所述的ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)分离：选取3周龄PRRSV阴性健康猪，麻醉处死后无菌分离肺脏，用无菌、1％双抗的PBS缓冲液灌洗肺脏。将收集的灌洗液400g离心10分钟后弃去上清，加入50mLPBS缓冲液重悬细胞，反复洗涤2次后收集沉淀细胞，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，计数后调整细胞浓度达1.5×10⁶个细胞/mL，每孔1mL接种于12孔板，于37℃温箱培养(或以1×10⁷个细胞/mL冻存)，贴壁细胞即为PAM。

病毒接种：将GSWW/2015毒株(Weijie B,Zhijia W,Pu S,et al.The molecularcharacteristic analysis of PRRSV GSWW/2015 strain and its pathogenicity topigs[J].BMC Veterinary Research,2018,14(1):240，GSWW/2015毒株的NCBI登录号为：KX767091)以MOI为0.5接种于PAM细胞，同时设未接病毒的对照(Mock)，补充含2％FBS的RPMI-1640培养基至1mL，于37℃温箱培养。

总miRNA提取，第一链cDNA合成及实时荧光定量PCR：接毒24小时后收集裂解细胞，用Qiagen miRNeasy Mini Kit提取总miRNA。采用广州易锦生物技术有限公司的All-inOne^TM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit反转录总miRNA，每25μL体系加入500ng总miRNA，反转录应用的程序为37℃60分钟，85℃5分钟，反应后得到cDNA。采用广州易锦生物技术有限公司的All-inOne^TM miRNA qPCR kit，根据说明书配置体系和设定程序，以反转录得到的cDNA为模板，将引物稀释为10μM，进行荧光定量实验检测ssc-miR-151-3p的表达量。根据荧光定量PCR实验的Ct值，以U6为内参(U6F:CTCGCTTCGGCAGCACA，SEQ ID NO.4，U6R(通用下游引物):AACGCTTCACGAATTTGCGT，SEQ ID NO.5)，用2^-△△Ct公式计算出接毒组和对照组之间的ssc-miR-151-3p表达变化倍数。如图1(PAM细胞以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，24小时后提取总细胞miRNA，实时荧光定量PCR结果)所示，RT-QPCR结果显示ssc-miR-151-3p在GSWW/2015感染的PAM细胞中下调表达。ssc-miR-151-3p上游引物序见序列表SEQ IDNO.3(CCTAGACTGAAGCTCCTTGAGGA)，U6上游引物(U6F)序列见序列表SEQ ID NO.4，通用下游引物序列见SEQ ID NO.5(U6R)。

ssc-miR-151-3p模拟物上调ssc-miR-151-3p在PAM细胞中的表达。将2.5μL 100μMssc-miR-151-3p和阴性对照的模拟物(UUGUACUACACAAAAGUACUG，SEQ ID NO.9由吉玛公司合成)分别加至125μL Opti-MEM培养基中混匀，将2.5μL Lipofectamine 3000 Reagent加至125μL Opti-MEM培养基中混匀，室温静置5分钟；将稀释的模拟物溶液与脂质体充分混匀，室温静置15分钟；用Opti-MEM培养基润洗预先接种在12孔板的PAM细胞，将模拟物和脂质体的混合液加入各孔细胞中，最后补加745μL 10％FBS RPMI-1640完全培养基，轻轻摇匀，最终于37℃、5％CO₂的温箱培养。24小时后收集细胞，提取总miRNA，进行反转录，用实时荧光定量PCR检测ssc-miR-151-3p表达水平。如图2(PAM细胞中分别转染阴性对照和ssc-miR-151-3p的模拟物，24小时后提取细胞总miRNA，实时荧光定量PCR结果)所示，转染ssc-miR-151-3p的模拟物后，ssc-miR-151-3p的表达显著上调，ssc-miR-151-3p的表达量增加了3000多倍。

ssc-miR-151-3p抑制剂下调ssc-miR-151-3p在PAM细胞中的表达。将1.25μL100μMssc-miR-151-3p和阴性对照的抑制剂(CAGUACUUUUGUGUAGUACAA，SEQ ID NO.10由吉玛公司合成)分别加至125μLOpti-MEM培养基中混匀，将1.25μL Lipofectamine 3000Reagent加至125μL Opti-MEM培养基中混匀，室温静置5分钟；将稀释好的抑制剂溶液与脂质体溶液充分混匀，室温静置15分钟；用Opti-MEM培养基润洗预先接种在12孔板的PAM细胞，接着将抑制剂和脂质体的混合液加入各孔细胞中，最后补加747.5μL 10％BS轻轻摇匀，最终于37℃、5％CO₂的温箱培养。24小时后收集细胞，提取总miRNA，进行反转录，用实时荧光定量PCR检测ssc-miR-151-3p表达水平。如图3(PAM细胞中分别转染阴性对照和ssc-miR-151-3p抑制剂，24小时后提取细胞总miRNA，实时荧光定量PCR结果)所示，转染ssc-miR-151-3p的抑制剂后，ssc-miR-151-3p的表达显著下调。

增加ssc-miR-151-3p的表达量对PRRSV复制的影响。PAM细胞以50nM终浓度转染ssc-miR-151-3p和阴性对照的模拟物，24小时后，将GSWW/2015以MOI为0.5接种细胞，24小时后收获病毒，弃上清后收集细胞，用Qiagen RNeasy Mini Kit提取总RNA；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(RR036A)反转录，然后用实时荧光定量PCR测定PRRSV病毒ORF6的表达量，以GAPDH为内参计算PRRSV ORF6 mRNA相对表达量。PRRSV ORF6上下游引物序列分别见序列表SEQ ID NO.6(CGGCAAATGATAACCACGC和SEQ ID NO.7(TTCTGCCACCCAACACGAG)。如图4(PAM细胞中分别转染阴性对照和ssc-miR-151-3p模拟物，24小时后，以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，感染24小时后提取总RNA，实时荧光定量PCR结果)所示，上调ssc-miR-151-3p表达量，PRRSV的复制水平下降。提示ssc-miR-151-3p有抑制PRRSV复制的功能。

下调ssc-miR-151-3p的表达量对PRRSV复制的影响。PAM细胞以25nM终浓度转染ssc-miR-151-3p和阴性对照的抑制剂，24小时后，将GSWW/2015以MOI为0.5接种细胞，24小时后，收获病毒，用Qiagen RNeasy Mini Kit提取总RNA；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(RR064A)绝对定量PCR测定PRRSV病毒的拷贝数，PRRSV探针序列见序列表SEQ IDNO.8(TGTGCCGTTRACCGTAGTGGAGCC)。如图5(PAM细胞中分别转染阴性对照和ssc-miR-151-3p抑制剂，24小时后，以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，感染24小时后提取总RNA，实时荧光定量PCR结果)所示，下调ssc-miR-151-3p表达，PRRSV的复制水平上升。提示ssc-miR-151-3p有抑制病毒复制的功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> ssc-miR-151-3p在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cuagacugaa gcuccuugag ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uccucaagga gcuucagucu ag 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctagactga agctccttga gga 23

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggcaaatga taaccacgc 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttctgccacc caacacgag 19

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtgccgttr accgtagtgg agcc 24

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uuguacuaca caaaaguacu g 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caguacuuuu guguaguaca a 21