阅读说明：本技术 一种戊型肝炎-***联合疫苗及其制备方法 (Hepatitis E-foot-and-mouth disease combined vaccine and preparation method thereof ) 是由 孟继鸿 刘真真 艾丁 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种戊型肝炎-口蹄疫联合疫苗及其制备方法。这种戊型肝炎-口蹄疫联合疫苗同时含有戊型肝炎病毒重组蛋白和口蹄疫灭活疫苗。该联合疫苗的制备方法：将戊型肝炎病毒重组蛋白、口蹄疫灭活疫苗吸附于ISA 206凝胶,再调整pH,制备最终的戊型肝炎-口蹄疫联合疫苗。与现有技术相比,本发明具有方便、多效、低成本、能够有效预防戊型肝炎和口蹄疫的优点。(The invention relates to a combined vaccine for hepatitis E and foot-and-mouth disease and a preparation method thereof. The combined vaccine of hepatitis E and foot-and-mouth disease contains recombinant hepatitis E virus protein and inactivated foot-and-mouth disease vaccine. The preparation method of the combined vaccine comprises the following steps: and adsorbing the hepatitis E virus recombinant protein and the foot-and-mouth disease inactivated vaccine to ISA 206 gel, and adjusting the pH value to prepare the final hepatitis E-foot-and-mouth disease combined vaccine. Compared with the prior art, the invention has the advantages of convenience, multiple effects, low cost and capability of effectively preventing hepatitis E and foot-and-mouth disease.)

一种戊型肝炎-***联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种联合疫苗及其制备方法，尤其是涉及一种戊型肝炎-***联合疫苗及其制备方法。

背景技术

随着我国经济的快速发展，社会环境发生巨大变化，人员流动日益增加，传染病的发生也日益频繁，严重影响了公众健康和社会安定，给国家造成了巨大的经济负担。为了有效控制传染病的流行，研究和开发预防性疫苗具有重要的现实意义。

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)引起的肝脏疾病，一般在发达国家以散发病例为主，在发展中国家偶尔会引起大爆发或流行，严重者会引发急性肝衰竭，最终导致患者死亡。据估计，全世界每年有约2010万人感染HEV，其中约330万急性患者，并有约7万人死亡。哺乳动物HEV有4个基因型(1-4型)，4种型别的HEV基因组相似性较高，但是宿主范围不同，1型和2型HEV感染宿主是人，而3型和4型HEV感染宿主包括人和猪，其中猪是其主要感染宿主。近30年来的研究发现，HEV基因1型感染显著下降，而HEV基因4型感染显著升高。猪被认为是HEV基因4型的主要宿主，在中国东北地区，80％被检测的猪显示携带抗HEV抗体，频繁接触感染HEV家猪的人感染HEV的几率显著增加。目前，消除传染源、阻断传播途径和免疫易感人群是控制HEV的三种有效途径。因此，猪戊型肝炎病毒疫苗的开发和使用可以有效减少4型HEV的传染源，减少甚至消除4型HEV人类感染。但是猪感染HEV后有一定的自愈性，很大程度上不会对猪造成伤害，考虑到经济效益，大部分养猪者不会对猪进行疫苗接种。为了有效地解决这一问题，开发一种针对HEV和另一种严重疾病的联合疫苗十分重要。

***是由***病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的，发生于偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。***易感动物达到70多种，包括猪、牛、羊等主要家畜，通过易感动物种群迅速传播将导致大规模的流行病，导致生产力严重低下，造成严重的经济损失。例如1997年台湾爆发***，6000多个农场受到感染，400万头猪感染***病毒并死亡。为控制***传播，使用了2100万支疫苗，费用约为378.6百万美元，在出口贸易中损失约16亿美元，造成约6.5万个岗位失业。由此可见，***疾病在养猪业中传染性高，死亡率高，危害极深。

猪***疫苗已经上市多年，包括有灭活疫苗、合成肽疫苗、基因重组腺病毒、活载体疫苗、杆状病毒空衣壳颗粒疫苗、DNA疫苗和转基因植物疫苗。目前，灭活疫苗和合成肽疫苗可用于政府批准疾病控制方案，两种疫苗的生产技术都已经非常成熟。2012年，首支戊型肝炎疫苗——重组戊型肝炎疫苗益可宁上市。HEV基因组包含三个开放阅读框(ORF)，ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF2表达的蛋白具有决定HEV对宿主细胞亲嗜性的关键作用。益可宁利用大肠杆菌表达1型HEV基因组的ORF2基因。由于戊型肝炎病毒在体外细胞中培养困难，难以研制灭活疫苗或减毒活疫苗。目前，国内外研究大都集中于通过基因重组技术来研制基因工程亚单位疫苗。

联合疫苗是指含有两种或多种抗原，用于预防两种或多种疾病的疫苗。联合疫苗具有方便、多效、低成本的优势，受到广大学者的关注，是新一代疫苗研究的热点。与单一疫苗相比，联合疫苗显著降低了预防接种次数，提高疫苗覆盖率和接种率，避免因漏种而不能得到全程免疫。此外，由于大多数疫苗不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至使用过程均需在较低温度下保存，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下。联合疫苗减少了疫苗管理上的困难，降低了接种和管理费用。例如，百日咳-白喉-破伤风三联疫苗在计划免疫中已使用多年，是成功的联合疫苗案例。近年来一些新的联合疫苗，如甲肝和乙肝联合疫苗也已经获得专利(欧洲专利0339 667)。迄今为止，宿主同为猪的***和4型戊型肝炎联合疫苗的研制在国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种戊型肝炎-***联合疫苗及其制备方法。本发明提供的联合疫苗具有比单价疫苗同样甚至更好的免疫原性。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种戊型肝炎-***联合疫苗，包括戊型肝炎病毒重组蛋白以及***灭活疫苗。其中***灭活疫苗，其病毒抗原含量为0.5-5ug/ml，戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-100μg/ml。

在本发明的一个实施方式中，所述联合疫苗中，戊型肝炎病毒重组蛋白的剂量为25μg/ml-100μg/ml，***灭活疫苗病毒抗原含量为0.5-1μg/ml。

当戊型肝炎-***联合疫苗中戊型肝炎病毒重组蛋白的剂量≥25μg/ml，***灭活疫苗病毒抗原含量≥0.5μg/ml时具有较好的免疫效果。所以，该联合疫苗的优选实施方案是以25μg/ml戊型肝炎病毒重组蛋白和病毒抗原含量为0.5μg/ml***灭活疫苗的联合疫苗成本最低；以100μg/ml戊型肝炎病毒重组蛋白和病毒抗原含量为1μg/ml***灭活疫苗的联合疫苗产生戊型肝炎病毒抗体和***病毒抗体水平最高。

在本发明的一个实施方式中，所述***灭活疫苗病毒来源是O/Mya98/XJ/2010+O/GX/09-7疫苗株。

在本发明的一个实施方式中，戊型肝炎病毒重组蛋白为含有222个氨基酸的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。表达戊型肝炎病毒重组蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一个实施方式中，该联合疫苗还包括免疫佐剂，该免疫佐剂为ISA 206凝胶溶液，ISA 206凝胶与疫苗质量比为1:1。

在本发明的一个实施方式中，该联合疫苗还包括明胶，所述明胶的浓度为50w/w％，将明胶加入戊型肝炎-***联合疫苗用于疫苗贮藏。

本发明还提供所述戊型肝炎-***联合疫苗的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)将***灭活疫苗的病毒原液和ISA 206凝胶搅拌混合；

(2)将戊型肝炎重组蛋白和ISA 206凝胶搅拌混合；

(3)将(1)和(2)所得的溶液混合，调整pH为5.5-9.6，调整联合疫苗中戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-100μg/ml，***灭活疫苗的病毒抗原含量为0.5-5ug/ml，ISA 206凝胶浓度为50w/w％。

所述ISA206凝胶可以购买或采用已知方法进行制备。

本发明还提供联合疫苗的贮藏方法，包括以下步骤：

(1)将明胶加入口所述戊型肝炎-***联合疫苗，明胶的浓度为50w/w％；(2)

使用棕色玻璃瓶作为联合疫苗的贮藏瓶。

本发明的联合疫苗优选作为猪的疫苗使用。

本发明的联合疫苗可以有效的用于预防戊型肝炎和***。

本发明设计思路如下：单一戊肝疫苗和单一***疫苗的接种次数较多，可能因漏种而不能得到全程免疫，戊肝-***联合疫苗则能够克服上述困难；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，使用联合疫苗则可以大大降低成本。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1.根据本发明联合疫苗的优选实施方案制备的戊型肝炎-***联合疫苗能够诱导机体产生针对戊型肝炎和***的高滴度和特异性抗体，不同剂量配比的戊型肝炎-***联合疫苗的免疫效果都优于单价疫苗，本发明提供的联合疫苗具有比单价疫苗更好的免疫原性。

2.本发明的联合疫苗中使用了经充分证明具有良好安全性及免疫原性的***疫苗，能够大大降低联合疫苗的生产成本和市场价格。

3.本发明的戊型肝炎-***联合疫苗中，使用的ISA206凝胶可以购买。该类佐剂为本领域技术人员所熟知，易于获得和制备。

4.本发明的联合疫苗避免了单一戊型肝炎疫苗和单一***疫苗的接种次数较多，可能因漏种而不能得到全程免疫的问题，所述的联合疫苗降低了疫苗管理成本。

附图说明

图1为灭活HEV-FMDV联合疫苗的HEV体外中和试验电泳图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例中戊型肝炎-***联合疫苗以HEV-FMDV或FMDV-HEV联合疫苗表示。

实施例1

一种戊型肝炎-***(HEV-FMDV)联合疫苗的组分，包括***灭活疫苗和戊型肝炎病毒重组蛋白。其中，猪***灭活疫苗，其病毒抗原含量为0.5-5μg/ml，戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-100μg/ml。本实例中所用的猪***灭活疫苗中病毒来源于O/Mya98/XJ/2010+O/GX/09-7疫苗株或其他可用疫苗株。戊型肝炎病毒重组蛋白的氨基末端位于其ORF2编码蛋白的380位至480位氨基酸之间，其羧基末端位于580位至660位氨基酸之间或由此蛋白片段产生的衍生物，其所述的序列为(295个)。优先选用氨基酸序列SEQ IDNO.1。

本实施例中HEV-FMDV联合疫苗中还包含免疫佐剂，该免疫佐剂为ISA206凝胶溶液，ISA206凝胶与疫苗质量比为1:1。

本实施例还提供所述戊型肝炎-***联合疫苗的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)将***灭活疫苗的病毒原液和ISA206凝胶搅拌混合；

(2)将戊型肝炎重组蛋白和ISA206凝胶搅拌混合；

(3)将(1)和(2)所得的溶液混合，调整pH为5.5-9.6，调整联合疫苗中戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-100μg/ml，***灭活疫苗的病毒抗原含量为0.5-5ug/ml，ISA 206凝胶浓度为50w/w％。

本实施例还提供联合疫苗的贮藏方法，包括以下步骤：

(1)将明胶加入口所述戊型肝炎-***联合疫苗，明胶的浓度为50w/w％；

(2)使用棕色玻璃瓶作为联合疫苗的贮藏瓶。

实施例2

戊型肝炎病毒重组蛋白的表达和纯化

1.以4型HEV中国株基因序列为模板，用引物1(5'-CCCCCATGGTTATCCAGGACTATGATAATC-3')和引物2(5'-CCCCTCGAGATACTCCCGGGTTTTACCCC-3')扩增ORF2中SEQ ID NO.2基因片段。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，克隆入质粒载体Pet28(a)+中。

2.将携带目标片段的质粒转化大肠杆菌菌株EL-21(DE3)，挑取单菌落，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基培养至OD₅₅₀达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2-1.0mM的IPTG进行诱导，诱导温度为37℃，摇床摇速为200rpm，3-4小时后离心收集菌体，用细胞裂解液(50mM Tris-HCL，pH7.2，300mM NaCl)悬浮菌体，冻融6次后超声破碎菌体，离心收集上清液，再用离子交换和葡聚糖层析方法进行纯化，最后使用UV280和SDS-PAGE方法进行检测，用透射电镜观察形成戊型肝炎VLP形态。

实施例3

猪***灭活疫苗和戊型肝炎病毒重组蛋白ISA 206凝胶吸附溶液的制备方法

为了增加免疫原性，分别将猪***灭活疫苗的病毒原液和戊型肝炎重组蛋白吸附于ISA 206凝胶：

1.将猪***灭活疫苗的病毒原液和ISA 206凝胶搅拌混合；

2.将2种戊型肝炎重组蛋白分别和ISA 206凝胶搅拌混合。

3.将上述所得的两种混合溶液按一定比例混合，调整猪***灭活疫苗的病毒抗原含量为2μg/ml，戊型肝炎重组蛋白浓度为50μg/ml，ISA 206凝胶的浓度为50w/w％；所得的混合溶液即为猪***灭活疫苗和戊型肝炎病毒重组蛋白ISA 206凝胶吸附溶液。

实施例4

灭活HEV-FMDV联合疫苗的免疫原性实验方法

1.实验动物分组和免疫方案

选用6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠160只(扬州大学比较医学实验中心提供)，随机分为16组，每组10只。

A组：空白对照组，注射ISA 206凝胶(浓度为50w/w％)，0.2ml/只。

B组：FMDV单剂量组，注射猪***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)，0.2ml/只。

C组：FMDV单剂量组，注射猪***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml)，0.2ml/只。

D组：FMDV单剂量组，注射猪***灭活疫苗(病毒抗原含量为2μg/ml)，0.2ml/只。

E组：HEV单剂量组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(25μg/ml)，0.2ml/只。

F组：HEV单剂量组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(50μg/ml)，0.2ml/只。

G组：HEV单剂量组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(100μg/ml)，0.2ml/只。

H组：灭活HEV-FMDV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(25μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)，0.2ml/只。

I组：灭活HEV-FMDV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(50μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)，0.2ml/只。

J组：灭活HEV-FMDV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(100μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)，0.2ml/只。

K组：灭活FMDV-HEV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(25μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml)，0.2ml/只。

L组：灭活HEV-FMDV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(50μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml)，0.2ml/只。

M组：灭活HEV-FMDV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(100μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml)，0.2ml/只。

N组：灭活HEV-FMDV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(25μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为2μg/ml)，0.2ml/只。

O组：灭活HEV-FMDV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(50μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为2μg/ml)，0.2ml/只。

P组：灭活HEV-FMDV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(100μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为2μg/ml)，0.2ml/只。

分组情况如下表1所示：

表1HEV和FMDV的单独组以及HEV-FMDV联合疫苗组的不同配比

各组实验动物分别于第0周注射一次相应疫苗，于小鼠后腿大腿内侧肌肉注射0.2ml/只。

2.检测方法：

2.1血清采集

所有小鼠均于免疫前和免疫后的第2、4、6、8、10、12周经眼眶静脉采血，-20℃冻存，于实验结束后统一检测。

2.1戊型肝炎和***抗体检测

采用酶联免疫吸附剂测定(Enzyme linked Immunosorbent assay，ELISA)方法检测各组动物血清(1:100稀释)，检测各组别动物的抗体产生情况，以1:10的免疫前血清作为阴性对照，P/N比值大于2.1为抗体阳性血清。

将不同组别、不同时间的免疫血清分别系列稀释，以1:100为起点，采用ELISA法检测戊型肝炎和***抗体滴度。最后结果以抗体几何平均滴度(Geometric mean titer,GMT)表示。

3.实验结果

FMDV单剂量组：如表2-1所示，注射不同剂量的***灭活疫苗免疫小鼠的检测结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随***灭活疫苗免疫剂量的提高而升高。C组和D组之间无明显差异，表明当剂量提高到一定水平后，产生阳性血清小鼠的百分数维持在100％。

表2-1不同剂量的***灭活疫苗诱生小鼠FMDV抗体的产生情况

如表2-2所示，免疫血清中***GMT随***疫苗免疫剂量的增加而升高，但是当达到抗体水平的上限以后，小鼠免疫血清中***GMT不再提高。C组和D组小鼠中，第10周时GMT达到最高水平为12800。并且免疫血清中***GMT随着注射时间不断提高，达到GMT峰值以后，随着注射时间延长，GMT有所降低。第12周时，C组和D组小鼠中GMT仍可维持9051和10159。

表2-2不同剂量的***灭活疫苗诱生小鼠FMDV抗体的产生水平

HEV单剂量组：

如表3-1所示，当戊型肝炎重组蛋白免疫剂量≥25μg/ml时，全部的小鼠均能产生阳性血清。

表3-1不同剂量的戊型肝炎重组蛋白诱生小鼠HEV抗体的产生情况

如表3-2所示，免疫血清中戊型肝炎GMT与戊型肝炎疫苗免疫剂量无相关性。E组免疫血清GMT高于F组和G组，血清GMT于第10周时达到最高水平为102400，并且在第12周时免疫血清GMT仍可维持在60887；第12周时，F组和G组免疫血清GMT可维持在21527和25600。

表3-2不同剂量的戊型肝炎重组蛋白诱生小鼠HEV抗体的产生水平

FMDV(0.5μg/ml)+HEV联合疫苗组：

如表4-1所示，***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，B组和H组分别有80％和90％的小鼠能诱导出抗FMDV的阳性血清，I组和J组中100％的小鼠能诱导出抗FMDV的阳性血清。

表4-1***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠***抗体的产生情况

如表4-2所示，***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白联合免疫小鼠后，小鼠***抗体产生水平明显高于***疫苗单剂量组(病毒抗原含量为0.5μg/ml)，且J组优于H和I组，第12周时，J组血清GMT仍可维持在204800。

表4-2***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠***抗体的产生水平

FMDV(1μg/ml)+HEV联合疫苗组：

如表5-1所示，***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，C组、K组、L组和M组的小鼠均能诱导出抗FMDV的阳性抗体血清。

表5-1***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠抗FMDV阳性血清的结果

表5-2表明，***灭活苗(病毒抗原含量为1μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫小鼠后，小鼠***抗体产生水平明显高于***疫苗单剂量组(病毒抗原含量为1μg/ml)，且M组优于K组和L组，第12周时，M组的血清GMT仍可维持在243549。

表5-2***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠***抗体的产生水平

FMDV(2μg/ml)+HEV联合疫苗组：

如表6-1所示，***灭活疫苗(病毒抗原含量为2μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，D组、N组、O组和P组的小鼠均能诱导出抗FMDV的阳性血清。

表6-1***灭活疫苗(病毒抗原含量为2μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠抗FMDV阳性血清的结果

表6-2表明，***灭活疫苗(病毒抗原含量为2μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫小鼠后，小鼠***抗体产生水平明显高于***疫苗单剂量组(病毒抗原含量为2μg/ml)，且O组和P组优于N组，第12周时，O组和P组的血清GMT仍维持在204800。

表6-2***灭活疫苗(病毒抗原含量为2μg/ml)与不同剂量的戊型肝炎重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠***抗体的产生水平

HEV(25μg/ml)+FMDV联合疫苗组：

如表7-1所示，戊型肝炎重组蛋白(25μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，E组、H组、K组和N组的小鼠均能诱导出抗HEV的阳性血清。

表7-1戊型肝炎重组蛋白(25μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊型肝炎抗体的产生情况

表7-2表明，戊型肝炎重组蛋白(25μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫小鼠后，小鼠戊型肝炎抗体产生水平明显高于戊型肝炎疫苗单剂量组(25μg/ml)，且H组优于N组，N组优于K组，第12周时，H组、K组和N组的血清GMT仍分别可维持在113650、60887和102400。

表7-2戊型肝炎重组蛋白(25μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊型肝炎抗体的产生水平

HEV(50μg/ml)+FMDV联合疫苗组：

如表8-1所示，戊型肝炎重组蛋白(50μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，F组、I组、L组和O组的小鼠均能诱导出抗HEV的阳性血清。

表8-1戊型肝炎重组蛋白(50μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果

表8-2表明，戊型肝炎重组蛋白(50μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫小鼠后，小鼠戊型肝炎抗体产生水平明显高于戊型肝炎疫苗单剂量组(50μg/ml)，且I组优于L组和O组，第12周时，I组、L组和O组的血清GMT仍分别可维持在72408，72408和51200。

表8-2戊型肝炎重组蛋白(50μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊型肝炎抗体的产生水平

HEV(100μg/ml)+FMDV联合疫苗组：

如表9-1所示，戊型肝炎重组蛋白(100μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，G组、J组、M组和P组的小鼠均能诱导出抗HEV的阳性血清。

表9-1戊型肝炎重组蛋白(100μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果

表9-2表明，戊型肝炎重组蛋白(100μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫小鼠后，小鼠戊型肝炎抗体产生水平明显高于戊型肝炎疫苗单剂量组(100μg/ml)，M组优于J组和P组，第12周时，J组、M组和P组的血清GMT仍分别可维持在60887，144815和86107。

表9-2戊型肝炎重组蛋白(100μg/ml)与不同剂量***灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊型肝炎抗体的产生水平

以上结果表明，不同剂量配比的戊型肝炎-***联合疫苗的免疫效果均优于单价疫苗；其中以H组(戊型肝炎病毒重组蛋白(25μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml))；J组(戊型肝炎病毒重组蛋白(100μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml))；M组(戊型肝炎病毒重组蛋白(100μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml))效果最好，比较这几组疫苗之间的免疫效果，发现不存在明显差异。因此，我们认为戊型肝炎-***联合疫苗中HEV重组蛋白的剂量≥25μg/ml，***灭活疫苗病毒抗原含量≥0.5μg/ml时可以取得很好的免疫效果，且其中以戊型肝炎病毒重组蛋白(25μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml)的成本最低；以戊型肝炎病毒重组蛋白(100μg/ml)和***灭活疫苗(病毒抗原含量为1μg/ml)组中的HEV抗体和FMDV抗体均为最高。

实施例5

灭活HEV-FMDV联合疫苗的HEV体外中和实验

由于缺乏HEV细胞培养系统，体外中和试验反映了蛋白的保护效果。本实施例采用一步法RT-PCR体外中和试验检测HEV-FMDV联合疫苗诱导小鼠免疫血清的中和HEV的能力。将HEV单剂量组E组(戊型肝炎病毒重组蛋白(25μg/ml))和HEV-FMDV联合疫苗配比实验组中H组(戊型肝炎病毒重组蛋白(25μg/ml)+***灭活疫苗(病毒抗原含量为0.5μg/ml))的免疫小鼠第10周的血清进行60℃，30min处理。灭活后做1:40、1:60、1:80、1:100、1:120和1:140系列稀释，与等体积的4型HEV NJ703(GenBank:AY789228)病毒液混合，37℃条件下孵育1h。将混合物接种于A549细胞单层上，37℃吸附2h，用Hanks溶液洗涤细胞3次，用Trizol试剂提取RNA。用QIAGEN的一步法RT-PCR试剂盒进行RT-PCR，引物为HEV通用引物JM-2(5′-CCGACAGAATTGATTTCGTCGGC-3′)和JM-4(5′-TCGGCG GCGGTGAGAGAGAGCCA-3′)。反应程序为：TR：94℃45min，95℃15min；PCR：变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃，45s，55个循环。PCR产物取5μl经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，有条带的表示为不能中和HEV，无条带的表示能中和HEV(图1)。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海健康医学院

<120> 一种戊型肝炎-***联合疫苗及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 222

<212> PRT

<213> O/Mya98/XJ/2010+O/GX/09-7

<400> 1

Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val

20 25 30

Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Thr Thr Tyr Gly

35 40 45

Ser Ser Thr Asn Pro Met Tyr Val Ser Asp Thr Val Thr Phe Val Asn

50 55 60

Val Ala Thr Cys Ala Gln Gly Val Ser Arg Ser Leu Asp Trp Ser Lys

65 70 75 80

Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Thr Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys

85 90 95

Thr Phe Tyr Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser

115 120 125

Asp Gln Ile Leu Ile Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Cys Ile Ser

130 135 140

Thr Tyr Thr Thr Asn Leu Gly Ser Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val

145 150 155 160

Gly Val Leu Ala Pro His Ser Ala Leu Ala Val Leu Glu Asp Thr Val

165 170 175

Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp Asp Phe Cys Pro Glu Cys

180 185 190

Arg Ala Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe Gln Ser Thr Val Ala Glu

195 200 205

Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Gly Gly Lys Thr Arg Glu Tyr

210 215 220

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<212> DNA

<213> O/Mya98/XJ/2010+O/GX/09-7

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gttatccagg actatgataa tcaacatgag caagaccgcc ctaccccctc ccctgctcct 60

tctcgccctt tttctgtgct tcgtgctaat gatgtgcttt ggctctcact tacagctgct 120

gagtatgatc agactactta cggctcttct actaacccta tgtatgtttc tgatactgta 180

acgtttgtca atgtggccac ttgcgcccag ggggtttcgc gctctctgga ctggtctaag 240

gttacccttg atgggcgtcc actaactact atccagcagt attccaagac tttctatgtt 300

ctgcctcttc gtggtaagct ttctttttgg gaggctggta ctactaaagc cggctaccca 360

tacaattata atactactgc tagtgatcag atcctgattg agaatgcagc tggccatcgg 420

gtttgtattt ctacttatac tactaatttg ggctccgggc ctgtttctat ctctgctgtc 480

ggtgtcctcg caccccattc tgcattggcc gttttggagg acactgtcga ttaccctgcc 540

cgcgctcata cttttgatga cttttgccct gagtgccgcg cgctcggcct tcagggctgt 600

gcttttcagt caactgtcgc tgagctgcag cgtcttaaaa tgaagggggg taaaacccgg 660

gagtat 666