阅读说明：本技术 用于引起针对hbv的免疫应答的病毒样粒子 (Virus-like particles for eliciting an immune response against HBV ) 是由 乡保正 织田康则 大桥千夏 矶谷健太郎 于 2018-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明的目的在于提供针对各种基因型的HBV引发免疫反应的抗原,并提供含有数种以上HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子或将它们组合而成的病毒样粒子组合物。(The purpose of the present invention is to provide an antigen that elicits an immune response against HBV of various genotypes, and to provide a virus-like particle that contains several or more HBs-L antigen proteins, or a virus-like particle composition that combines these.)

用于引起针对HBV的免疫应答的病毒样粒子

技术领域

本发明涉及用于引起针对HBV的免疫应答的病毒样粒子。另外，本发明涉及用于引起针对HBV的免疫应答的病毒样粒子组合物。另外，本发明涉及含有上述物质作为有效成分的、HBV的治疗用及/或预防用疫苗。

背景技术

B型肝炎是由B型肝炎病毒(本说明书中，有时将其称为“HBV”)导致的感染症。该疾病作为以急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌等为代表的各种肝脏疾病的主要原因而为人所知。HBV的感染者据说在全世界有3亿人，B型肝炎是世界性的健康问题之一。

HBV是由位于中心的DNA、和围绕其的衣壳构成的粒子，还具有在其表面的脂质膜中包含多种蛋白质的包膜结构(envelope structure)。该包膜是位于病毒最外部的结构，可用于HBV的免疫学检测，因此有时也将其称为表面抗原(图1)。

将形成HBV的表面抗原的全长蛋白称为L蛋白，自呈递至粒子最外部N末端起依次存在Pre-S1区、Pre-S2区及S区这三个区(图1)。Pre-S1区起到作为在HBV对人肝细胞进行感染时来识别细胞、与细胞结合的感受器的作用。人肝细胞具有NTCP受体作为针对HBV的受体(非专利文献1)。需要说明的是，在来源于未感染HBV的人肝细胞的细胞系中使该NTCP受体高水平表达后得以感染HBV(非专利文献2)，因此，最近，使用这样的细胞来确认HBV的感染防御效果的技术得到了广泛利用。

将自全长的被称为L蛋白的HBs-L抗原蛋白缺失Pre-S1区、由Pre-S2区及S区组成的蛋白称为M蛋白，并将自HBs-L抗原蛋白缺失Pre-S1及Pre-S2区、仅由S区组成的蛋白称为S蛋白。需要说明的是，本领域中，存在以HBV的表面抗原(Hepatitis B Surface Antigen，HBsAg)表示仅由S蛋白组成的S抗原粒子等用语的定义暧昧的情况。但在本说明书中，只要无特殊说明，则就HBV表面抗原蛋白而言，将仅由S蛋白组成的抗原粒子定义为S抗原或HBs-S抗原，将仅由M蛋白组成的抗原粒子定义为M抗原或HBs-M抗原，并将仅由L蛋白组成的抗原粒子定义为L抗原或HBs-L抗原(图1)。

上述各种HBV的抗原蛋白可在以导入了编码其的基因的酵母或动物细胞等真核细胞作为宿主细胞的表达系中制备，如此进行了基因重组的表面抗原作为针对HBV的预防用疫苗而得到广泛利用。其中，使用酵母中产生的S抗原是当前市场中的主流。例外地，利用了含有使用CHO细胞制备的M蛋白及L蛋白的抗原的预防用疫苗(Genhevac B Pasteur及Sci-B-Vac)也已市售(非专利文献3及4)。Genhevac B Pasteur的原料为将作为HBV表面抗原蛋白的M蛋白及S蛋白混合而得到的抗原，Sci-B-Vac的原料为包含L蛋白、M蛋白及S蛋白的抗原。

就利用了S抗原的预防疫苗而言，存在针对疫苗的非应答者、及防御效果起效(onset)慢是较大的课题。据报道，根据利用了仅由使用酵母制备的M蛋白组成的M抗原的预防用疫苗的临床成绩，Pre-S2区具有比S抗原更高的免疫原性，不仅产生针对S区的抗体，也产生针对Pre-S2区的抗体，因此对于减少不应答者或加快起效等而言是有效的(非专利文献5)。L抗原不仅具有M抗原所含有的S区及Pre-S2区，还具有作为HBV的感受器部的Pre-S1区。因此，将L抗原制成预防用疫苗的情况下，还可进一步产生针对呈递至最外部的Pre-S1区的抗体，因此，认为其是在减少非应答者及/或加快起效方面较之S抗原疫苗或M抗原疫苗而言更优异的预防用疫苗。

作为现有预防用疫苗的另一较大课题，存在针对逃逸突变体的HBV无效的问题。逃逸突变体是在S抗原的抗原性强的抗原决定簇“a”区中发生突变的HBV，就针对通常利用的S抗原疫苗产生的抗体而言，无法针对该突变体得到防御效果。可以设想，伴随着用于B型肝炎治疗的抗病毒药的普及，逃逸突变体会愈发增多，这一情况今后会成为更大的问题。

与此相对，M抗原疫苗不仅产生针对S区的抗体，也产生针对Pre-S2区的抗体，因此，较之S抗原疫苗而言，能针对HBV突变体得到更强韧的防御效果。并且，L抗原的情况下，还能够得到针对Pre-S1区的抗体，因此，可认为产生在上述3个区中存在突变的HBV的频率进一步减少，从而较之M抗原疫苗而言成为针对HBV突变更强韧的预防用疫苗。根据以上情况，可期待L抗原疫苗成为较之现有的利用了S抗原或M抗原的预防用疫苗而言更优异的疫苗。

作为HBV的基因型，A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型、及H型是已知的。最近，在此基础上添加了I型及J型(非专利文献6)，而A型、B型、C型及D型为HBV的主要基因型。关于S区及Pre-S2区，已阐明了前述的各基因型与表型的关系。例如，S区中，通常124～147位的氨基酸序列作为免疫原性高的抗原决定簇“a”而为人所知。Pre-S2区中，抗原决定簇“b”在各基因型中共通地存在是已知的(非专利文献7)。因此，关于这些区，即使基因型不同，仍然可认为能针对至少一部分的基因型产生共通的抗体。

关于Pre-S1区，未充分进行各基因型和表型的分析，HBV的各基因型间的氨基酸序列的同源性低。因此，可认为即使制备以含有来源于某一种基因型的Pre-S1区的L抗原作为有效成分的疫苗，也未必能够针对具有其他种类基因型的HBV引发介由Pre-S1区的免疫反应。更不用说，无法预见能用作预防用疫苗的程度的感染防御。

就抗Pre-S1抗体而言，通过使用了黑猩猩的HBV感染实验，已知有HBV的感染防御效果(非专利文献8)。然而，报道了非专利文献8中利用的抗Pre-S1抗体针对黑猩猩可防御表型adw的HBV的感染、但不防御表型ayw的HBV的感染。此外，非专利文献8中，基于抗Pre-S1抗体的表位分析和与Pre-S1区的氨基酸序列的关系，推测该抗体对于HBV的基因型A、B、C、F及H有效，但对于基因型D、E及G没有效果。另外，还报道了针对黑猩猩具有防止感染效果的其他抗Pre-S1抗体虽然可与由当时的GenBank的数据库中存在的12种HBV的基因序列合成的Pre-S1区的肽结合，但通过对该抗体所结合的Pre-S1区的表位的1个氨基酸进行取代，无法再进行结合(非专利文献9)。

如上所述，L抗原虽然作为预防用疫苗是优异的，但需要对基因型的差异作出应对。需要说明的是，含有上述的L蛋白的疫苗(Sci-B-Vac)对L蛋白所含的Pre-S1区的基因型的差异没有作出任何应对，不能说是发挥针对多数(2种以上)基因型的HBV的防止感染效果的预防用疫苗。

施予抗病毒剂及干扰素等对于B型肝炎的治疗有效是已知的。然而，抗病毒剂有其效果不持续、针对HBV的逃逸突变体增加的问题。另外，干扰素还有治疗效果较弱、副作用非常多的问题。并且，上述任一种治疗药均几乎没有将HBV从患者中清除的效果，无法期待HBV感染的治愈。鉴于上述情况，对针对B型肝炎的各种治疗用疫苗进行了开发(非专利文献10～14)。

治疗用疫苗的基本成分为HBV的表面抗原及形成衣壳的核心抗原(C抗原)，主要通过引发基于体液免疫的感染防御作用及引发细胞免疫作用来试图从感染细胞中清除HBV。需要说明的是，报道了在施予了S抗原及C抗原的混合物的临床试验中，安全性没有问题，包括细胞免疫在内的免疫反应上升(非专利文献13)。此外，在使用相同的2种抗原的混合物的比较临床试验中，显示出S抗原及C抗原的混合物较之聚乙二醇(PEG)化干扰素而言更加有效(非专利文献10)。另外，非专利文献14中还报道了NK细胞参与了HBV清除。

如上所述，通过各种方法进行了针对慢性B型肝炎的治疗用疫苗的开发。治疗疫苗的作用机理之一是利用抗体防止HBV的感染，因此，在治疗用疫苗中也要求上述的针对预防用疫苗所要求的特征。即，作为治疗用疫苗，较之S抗原而言也更期望使用包含Pre-S1区的L抗原。实际上，作为效果更高的预防用疫苗，公开了利用了包含Pre-S1区的表面抗原的方法(专利文献1、非专利文献15)。然而，在该方法中也未对上述各种基因型的HBV作出应对，不能说是能够提供合适的治疗用疫苗。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2010-516807

非专利文献

非专利文献1：Yan等，(2012)elife，2012Nov 13；1：e00049

非专利文献2：Iwamoto等，(2014)BBRC，443，808-813

非专利文献3：Shouval D等，(2015)Med Microbiol Immunol，204：57-68

非专利文献4：Soulie JC等，(1991)Vaccine，9：545-548

非专利文献5：Suzuki H等，(1994)Vaccine，12，1090-1096

非专利文献6：Sunbul M(2014)World J Gastroenterol 20(18)，5427-5434

非专利文献7：Usuda S等，(1999)J Virol方法s.80(1)，97-112非专利文献8：Zhang P等，(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103，9214-9219

非专利文献9：Hong HJ等，(2004)Virology 318，134-141

非专利文献10：Akbar SM等，(2016)Ann Transl Med，4(18)，335

非专利文献11：Li J等，(2015)Vaccine 33，4247-4254

非专利文献12：Kosinska AD等，(2015).Med Microbiol Immunol，204，103-104

非专利文献13：Al-Mahtab M等，(2013)Hepatol Int，7，981-989非专利文献14：Tong S等，(2017)Sci.Rep.7：314

非专利文献15：Yum JS等，(2012)Clin.Vaccine Immuno1.19，120-127

非专利文献16：Diminsky等，(2000)Vaccine 18，3-17

发明内容

发明所要解决的课题

鉴于上述的现有技术，本发明的课题为提供针对各种(数种以上)基因型的HBV引发免疫反应的抗原。此外，本发明的课题还在于提供用于预防或治疗因感染各种(数种以上)基因型的HBV而发病的B型肝炎的疫苗。

用于解决课题的手段

本申请发明人进行了深入研究，结果发现，通过使用含有来源于特定基因型的HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子，从而能够针对各种(数种以上)的基因型引起免疫反应。另外，通过使用含有病毒样粒子(其含有来源于特定基因型的HBs-L抗原蛋白)的组合的病毒样粒子组合物，也能够引起针对各种(数种以上)基因型的HBV的免疫反应。并且，还阐明了上述病毒样粒子及病毒样粒子组合物具有针对各种(数种以上)基因型的HBV的中和活性。本发明是基于上述见解完成的，并广泛包含如下所示的形式的发明。

项1病毒样粒子，其是含有单一种类的HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子，所述HBs-L抗原蛋白的基因型为A、B、D、E、F、G、H、或所述各基因型的突变体中的任一种，所述病毒样粒子用于引起针对数种基因型的HBV的免疫反应。

项2病毒样粒子，其是含有2种以上HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子，所述HBs-L抗原蛋白的基因型选自由A、B、C、D、E、F、G、H及所述各基因型的突变体组成的组，所述病毒样粒子用于引起针对数种基因型的HBV的免疫反应。

项3如项1或2所述的病毒样粒子，其中，免疫反应为体液免疫或细胞免疫。

项4病毒样粒子组合物，其含有：仅含有基因型C的HBs-L抗原蛋白或其突变体作为HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子；和，项1所述的病毒样粒子。

项5病毒样粒子组合物，其含有项1～3所述的病毒样粒子中的至少2种以上。

项6病毒样粒子组合物，其含有：仅含有基因型C的HBs-L抗原蛋白或其突变体作为HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子；和，项5所述的病毒样粒子组合物。

项7如项1～6中任一项所述的病毒样粒子或病毒样粒子组合物，其中，基因型A的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列为序列号1～9中任一者所示的序列，基因型B的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列为序列号10～18中任一者所示的序列，基因型C的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列为序列号19～28中任一者所示的序列，基因型D的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列为序列号29～38中任一者所示的序列，基因型E的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列为序列号39～42中任一者所示的序列，基因型F的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列为序列号43～47中任一者所示的序列，基因型G的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列为序列号48～53中任一者所示的序列，基因型H的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列为序列号54～57中任一者所示的序列。

项8病毒样粒子组合物，其含有：项1～7中任一项所述的病毒样粒子或病毒样粒子组合物；和，含有HBV的核心抗原的病毒样粒子。

项9B型肝炎的治疗用及/或预防用疫苗，其含有项1～8中任一项所述的病毒样粒子或病毒样粒子组合物。

发明效果

本发明的病毒样粒子或病毒样粒子组合物能够针对数种基因型的HBV引发免疫反应。本发明的病毒样粒子或病毒样粒子组合物可作为用于预防B型肝炎感染的疫苗或用于治疗B型肝炎感染的疫苗使用。

附图说明

[图1]图1示出了HBV的结构和L型的HBV表面抗原的示意图。

[图2]图2示出了实施例1中构建的、pET32a-3C-Pre-S1-A、pET32a-3C-Pre-S1-B、pET32a-3C-Pre-S1-C及pET32a-3C-Pre-S1-D。图中的Pre-S1为Pre-S1区，Trx为硫氧还蛋白，lacl为Lac阻遏蛋白基因，ori为大肠杆菌复制起点，Amp R为氨苄青霉素抗性基因。

[图3]图3示出了实施例1中制备的各基因型的Pre-S1-Trx及Pre-S1肽的分析结果。

[图4]图4示出了实施例2中构建的pGLD-MC。图中的GLDp为GLD启动子，MC为M抗原基因(基因型C)、PGKt为PGK终止子，Leu2为Lue2基因，ori及Amp R各自与上述相同。

[图5]图5示出了实施例2中制备的Lc抗原及Mc抗原的分析结果。

[图6]图6示出了实施例2中制备的Lc抗原及Sci-B-Vac抗原的分析结果。

[图7]图7示出了实施例3中构建的pGLD-His4。图中的Sac I为Sac I位点，His4为His4基因，Leu2为Lue2基因，2micron为酵母2micron序列，GLDp、PGKt、ori及Amp R各自与上述相同。

[图8]图8示出了实施例4中构建的pGLD-His4-LA、pGLD-His4-LB及pGLD-His4-LD。图中的LA、LB及LD各自为L抗原基因(基因型A、B及D)，GLDp、PGKt、ori、Amp R、Leu2及2micron各自与上述相同。

[图9]图9示出了实施例4中制备的La、Lb及Ld抗原的分析结果。

[图10]图10示出了实施例5中构建的pRS-Ura3-LC3。图中的pr为启动子，LC为L抗原基因(基因型C)，Term为终止子，URA3为Ura3基因，ori及Amp R各自与上述相同。

[图11]图11示出了实施例5中构建的pRS-Leu2-LC2。图中的pr、LC、Term、ori、AmpR及Lue2各自与上述相同。

[图12]图12示出了实施例6中制备的Lc抗原的分析结果。

[图13]图13示出了实施例7的实验结果。图中的各图的纵轴表示针对L抗原、M抗原及S抗原的各抗体(抗S抗体、抗Pre-S2抗体及抗Pre-S1抗体)的产生量。

[图14]图14示出了实施例8的实验结果。图中的各图的A、B、C及D各自表示通过免疫的基因型A、B、C及D的Pre-S1肽免疫而得到的抗血清的结果。图中的各图的横轴表示使用的各抗血清的稀释比例。

[图15]图15示出了实施例9的实验结果。图中的各图的横轴表示免疫的各种基因型的L抗原(左起为La抗原、Lb抗原、Lc抗原及Ld抗原)，各图的纵轴为抗S抗体、抗Pre-S2抗体及抗Pre-S1抗体的产生量。

[图16]图16示出了实施例9的实验结果。图中的各图的纵轴表示各抗血清与各Pre-S1的结合的程度(相对值)，图中的各图的横轴与图14相同。

[图17]图17示出了实施例9的实验结果。图中的各图的纵轴及横轴与图16相同。

[图18]图18示出了实施例10的实验结果。图中的各图的纵轴及横轴与图16相同。

[图19]图19示出了实施例11(2)中构建的pRS-His4-LD2。图中的pr、LD、Term、ori、Amp R及His4各自与上述相同。

[图20]图20示出了实施例11(3)中构建的pRS-Ura3-LD2。图中的pr、LD、Term、ori、Amp R及Ura3各自与上述相同。

[图21]图21示出了实施例12中制备的Lh1抗原的分析结果。

[图22]图22示出了实施例12中制备的Lh1抗原的示意图。

[图23]图23示出了实施例13中构建的pGLD-His4-LD2。图中的LD2为LD2抗原基因(基因型D PreS-1+基因型C PreS-2及S)，GLDp、PGKt、His4、ori、Amp R、Leu2及2micron各自与上述相同。

[图24]图24示出了实施例13中制备的Ld2抗原及Lh1b抗原的分析结果。

[图25]图25示出了实施例14中构建的pRS-Leu2-LA2。图中的pr、LA、Term、ori、AmpR及Lue2各自与上述相同。

[图26]图26示出了实施例14中制备的Lh2抗原的分析结果。

[图27]图27示出了实施例15中构建的pRS-Leu2-LB2。图中的pr、LB、Term、ori、AmpR及Lue2各自与上述相同。

[图28]图28示出了实施例15中制备的Lh3抗原的分析结果。

[图29]图29示出了实施例16中制备的Lh4抗原的分析结果。

[图30]图30示出了实施例17的实验结果。图中的Lh为利用Lh1抗原的免疫。

[图31]图31示出了实施例17的实验结果。图中的图的纵轴及横轴与图14相同。

[图32]图32示出了实施例18的实验结果。图中的图的左侧的纵轴表示抗S抗体及抗Pre-S2抗体的产生量，右侧的纵轴表示Pre-S1的产生量。图中的图的横轴表示利用Lh1抗原的免疫后的天数。嵌入图为以相同纵轴刻度示出了3种抗体的图。

[图33]图33示出了实施例19的实验结果。左图为抗S抗体与各种抗原的结合，右图为抗Lh1抗体与各种抗原的结合。

[图34]图34示出了实施例22中构建的pET19b-HBcAg。图中的HBcAg为C抗原基因，lacl、ori及Amp R各自与上述相同。

[图35]图35示出了实施例22中制备的C抗原的分析结果。

[图36]图36示出了实施例23的实验结果。图中的各图的横轴的媒介物(vehicle)为阴性对照，Lh 10表示Lh1抗原，C 10表示C抗原，Lh+C 10表示Lh1及C抗原，ConA 10表示利用伴刀豆球蛋白A的、针对脾细胞的刺激。

具体实施方式

本说明书中使用的“包含”的含义包括“本质上由......组成”的含义及“由......组成”的含义。

病毒样粒子

本发明的病毒样粒子可用于针对数种基因型的HBV引发免疫反应。所谓HBV的基因型，是根据HBV的突变体进行划分的群，HBV基因序列的差异大于8％时被定义为不同的基因型。今后，也存在的基因型的分类进一步增加的情况，只要是已确认的HBV的基因型则没有特别限定。如此划分的各基因型的HBV所具有的氨基酸序列间的同一性为约92％以上。作为具体的HBV的基因型，可举出例如A、B、C、D、E、F、G、H、I及J。本说明书中“基因型A的HBs-L抗原蛋白”的表述的含义为“来源于基因型A的HBV的HBs-L抗原蛋白”。其他基因型B～J的HBs-L抗原蛋白的记载也同样。

本发明的病毒样粒子所引发的免疫反应只要是将其施予至生物体内时引发的免疫反应则没有特别限定。可举出例如体液免疫反应或细胞免疫反应等。

本发明的病毒样粒子含有HBs-L抗原蛋白。本发明的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白的种类根据单一或是多种可分为2个方式。

第一方式的病毒样粒子是含有单一种类的HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子。关于这样的第一方式的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白，除了后述的突变体之外，是指单一种类的HBs-L抗原蛋白。第一方式的病毒样粒子能够针对数种基因型的HBV引发免疫反应。第一方式的病毒样粒子能引起免疫反应的HBV的基因型的种类越多则越理想，没有特别限定。作为其例子，优选二种以上基因型，更优选三种以上或四种以上。

第二方式的病毒样粒子是含有2种以上基因型的HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子。第二方式的病毒样粒子也能够针对数种基因型的HBV引发免疫反应。第二方式的病毒样粒子能引起免疫反应的HBV的基因型的种数也越多则越理想，没有特别限定。例如，第二方式病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白的基因型为2种时，该病毒样粒子引起免疫反应的HBV的基因型为3种以上，优选为4种以上。如此，第二病毒样粒子能够针对其中所含有的HBs-L抗原蛋白的基因的种数以上的基因型的HBV引起免疫反应。

如后述的实施例中所说明的，含有基因型C的HBs-L抗原及基因型D的HBs-L抗原的第二方式的病毒样粒子不仅针对基因型C或D、针对其他的基因型A或B的HBV也能够引发免疫反应。以下，对上述2个方式的病毒样粒子进行详细说明。

(1)第一方式的病毒样粒子

第一方式的病毒样粒子是其中含有的HBs-L抗原蛋白为单一种类的基因型的病毒样粒子。第一方式的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白的个数为1个或2个以上。所谓第一方式的病毒样粒子，是以作为具有1个或2个以上跨膜结构域的蛋白质的HBs-L抗原蛋白及脂质双层膜作为主要成分的粒子，并且是在该粒子内部不具有掌管遗传信息的DNA或RNA等核酸的粒子。

本发明的第一方式的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白的基因型为A、B、D、E、F、G、H、及J中的任一种。另外，这些基因型的突变体也包含于第一方式的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白中。需要说明的是，本说明书中定义的突变体不限于来自自发突变的突变体，也包含人工地导入突变而得到的突变体。

具体的各基因型的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列没有特别限定。例如，作为基因型A可举出序列号1～9中任一者所示的氨基酸序列，作为基因型B可举出序列号10～18中任一者所示的氨基酸序列，作为基因型D可举出序列号29～38中任一者所示的氨基酸序列，作为基因型E可举出序列号39～42中任一者所示的氨基酸序列，作为基因型F可举出序列号43～47中任一者所示的氨基酸序列，作为基因型G可举出序列号48～53中任一者所示的氨基酸序列，以及，作为基因型H可举出序列号54～57中任一者所示的氨基酸序列。

对于确定上述各基因型的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列而言，在不显著损害本发明的效果的范围内，也可以是确定各基因型的HBs-L抗原蛋白的序列号1～57所示的氨基酸序列的突变体。这样的突变没有特别限定，可举出例如取代、***或缺失等突变。

针对上述各基因型的氨基酸序列的突变的程度没有特别限定。例如，可举出针对序列号1～9中任一者所示的氨基酸序列(基因型A)导入33个左右氨基酸的突变、针对序列号10～18中任一者所示的氨基酸序列(基因型B)导入26个左右氨基酸的突变、针对序列号29～38中任一者所示的氨基酸序列(基因型D)导入38个左右氨基酸的突变、针对序列号39～42中任一者所示的氨基酸序列(基因型E)导入21个左右氨基酸的突变、针对序列号43～47中任一者所示的氨基酸序列(基因型F)导入16个左右氨基酸的突变、针对序列号48～53中任一者所示的氨基酸序列(基因型G)导入9个左右氨基酸的突变、及针对序列号54～57中任一者所示的氨基酸序列(基因型H)导入27个左右氨基酸的突变。

本发明中定义的针对各基因型的氨基酸序列导入突变的程度可通过利用基因分析软件对自NCBI(国家生物信息中心，National Center for BiotechnologyInformation)等数据库获得的各氨基酸序列进行分析来确定。基因型A～D使用各20个、E使用10个、F使用8个、G及H使用各7个不同的氨基酸序列进行了分析。

作为上述突变体的具体例，序列号1～57中氨基酸数由400个组成的情况下，可举出缺失了自其N末端起11个氨基酸的区域及/或第163位～168位的6个氨基酸的区域的突变体。另外，序列号1～57中，氨基酸数不是400的情况下，可举出相当于上述的区域的氨基酸序列缺失的突变体。

作为人工导入突变而得到的突变体，可举出例如将HBs-L抗原蛋白所具有的3个区即Pre-S1区、Pre-S2区及S区各自取代为来源于不同的基因型的区而得到的突变体、或者Pre-S1区、Pre-S2区及S区各自缺失的突变体。具体而言，可举出将某一基因型的Pre-S1区取代为来源于其他基因型的Pre-S1区、将某一基因型的Pre-S1区及Pre-S2区取代为来源于其他基因型的Pre-S1区及Pre-S2区、以及将某一基因型的Pre-S2区取代为来源于其他基因型的Pre-S2的突变体。另外，还可将Pre-S2区取代为来源于其他基因型的Pre-S1区，此外，可举出Pre-S2区缺失的突变体。需要说明的是，上述人工取代时，可导入大于针对上述各基因型的氨基酸序列的突变导入数的突变。

(2)第二方式的病毒样粒子

第二方式的病毒样粒子是含有2种以上基因型的HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子。第二方式的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白的个数为1个或2个以上。第二方式的病毒粒子也是以作为具有1个或2个以上跨膜结构域的蛋白质的HBs-L抗原蛋白及脂质双层膜作为主要成分的粒子，并且是在该粒子内部不具有掌管遗传信息的DNA或RNA等核酸的粒子。

第二方式的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白的基因型为选自由A、B、C、D、E、F、G、H、I及J组成的组中的2种以上。另外，这些基因型的突变体也包含于第二方式的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白。具体的各基因型的HBs-L抗原蛋白的氨基酸序列及它们的突变体没有特别限定。例如，与上述的第一方式的病毒样粒子同样地操作。需要说明的是，作为基因型C的HBs-L抗原蛋白，可举出序列号19～28中任一者所示的氨基酸序列。另外，可针对序列号19～28中任一者所示的氨基酸序列导入28个左右氨基酸的突变。

第二方式的病毒样粒子中含有的、2种以上的基因型的HBs-L抗原蛋白的优选方式可根据针对各基因型的HBV的Pre-S1区的各种推定表位(presumptive epitope)的氨基酸序列的同一性来确定。Pre-S1区在HBV的基因型间也是氨基酸序列同一性低的区域，因此，发现该区域的推定表位的氨基酸序列大致相同的组合，可成为确定能用于针对数种基因型的HBV引发免疫反应的病毒样粒子的优选方式的重要信息。

下述的表1中示出了将各基因型A、B、C、D、E及F的代表性氨基酸序列中、根据基因型而不同的氨基酸序列区域(单字母标记)假设为推定表位的结果。表中以粗体字示出的氨基酸表示在二种以上基因型的推定表位中连续2个以上共通的氨基酸残基。

[表1]

例如，可知基因型A、B及C的推定表位的氨基酸序列彼此共通的部分较多。另外，可知基因型D的推定表位的氨基酸序列与基因型A、B及C有较大差异，与基因型E及F的氨基酸共通的部分较多。由此，可推定第二方式的病毒样粒子优选含有基因型A、基因型B及基因型C的HBs-L抗原蛋白中的任一种作为HBs-L抗原蛋白，并且含有基因型D及/或E的HBs-L抗原蛋白作为其他HBs-L抗原蛋白。

从本发明的病毒样粒子中明确排除下述病毒样粒子：含有单一种类的HBs-L抗原蛋白病毒样粒子，其中，前述HBs-L抗原蛋白是包含序列号19～28中任一者所示的氨基酸序列的HBs-L抗原蛋白或包含作为其突变体的氨基酸序列的HBs-L。此处，所谓序列号19～28中任一者所示的氨基酸序列的突变体，是包含针对序列号19～28中任一者所示的氨基酸序列导入28个左右氨基酸的突变而得到的氨基酸序列的突变体。

在不显著损害本发明的效果的范围内，上述本发明的病毒样粒子可除了上述HBs-L抗原蛋白以外还含有其他成分。这样的其他成分没有特别限定。具体而言，可举出来源于HBV的HBs-L抗原蛋白以外的其他抗原蛋白。所谓其他抗原蛋白，没有特别限定。可举出例如来源于HBV的S抗原蛋白、M抗原蛋白或核心抗原蛋白等。其中，优选S抗原蛋白或核心抗原蛋白或者它们的突变体。核心抗原具有引发免疫反应的多个表位的是已知的，因此，作为它们的突变体，可举出包含上述表位中的一个以上的突变体。这些来源于HBV的HBs-L抗原蛋白以外的、其他抗原蛋白的基因型没有特别限定。例如，可与上述的本发明的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白同样地为来源于基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I及J的其他抗原蛋白。此处，上述本发明的病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白的基因型与病毒样粒子中含有的HBs-L抗原蛋白以外的抗原蛋白的基因型可以相同也可以不同。

上述本发明的病毒样粒子的制备方法没有特别限定。具体而言，可通过下述生物工程手段容易地得到：使用含有编码病毒样粒子所含的HBs-L抗原蛋白的碱基序列的核酸对宿主细胞进行转化，在合适的培养基中对该转化体进行育种。前述宿主细胞，没有特别限定。可举出例如真核细胞，其中优选酵母细胞或CHO细胞。特别优选酵母细胞。需要说明的是，上述含有编码HBs-L抗原蛋白的碱基序列的核酸也可以以质粒的状态用于宿主细胞的转化，也可使上述的核酸成为直链的状态并组入宿主细胞的基因组DNA内。

病毒样粒子组合物

本发明中也包含病毒样粒子组合物，其含有可用于针对上述的二种以上基因型的HBV引发免疫反应的病毒样粒子的组合。这样的病毒样粒子组合物也可用于针对数种基因型的HBV引发免疫反应。作为这样的病毒样粒子组合物，可举出以下所示的4个方式。

(1)第一方式的病毒样粒子组合物

本发明的第一方式的病毒样粒子组合物为含有第一方式的病毒样粒子中的任一种、及仅含有基因型C的HBs-L抗原蛋白或其突变体作为HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子(本说明书中，有时将其称为“C粒子”)的病毒样粒子组合物。

作为第一方式的病毒样粒子组合物的具体例，可举出例如含有仅含有基因型D的HBs-L抗原蛋白作为HBs-L抗原蛋白的第一方式的病毒样粒子、以及C粒子的病毒样粒子组合物。如基于本发明的第二方式的病毒样粒子所说明的那样，基因型C的HBs-L抗原蛋白或其突变体优选与基因型D的HBs-L抗原蛋白组合使用。

C粒子中含有的、基因型C的HBs-L抗原蛋白的具体的氨基酸序列没有特别限定。可举出例如序列号19～28中任一者所示的氨基酸序列。所谓上述基因型C的HBs-L抗原蛋白的突变体没有特别限定。具体而言，可以是作为基因型C的HBs-L抗原蛋白的序列号19～28中任一者所示的氨基酸序列的突变体。这样的突变导入没有特别限定。可举出例如取代、***或缺失等突变。针对基因型C的HBs-L抗原蛋白的突变的程度在不显著损害本发明的效果的范围内没有特别限定。具体而言，可示例针对序列号19～28中任一者所示的氨基酸序列导入28个左右氨基酸的突变。

第一方式的病毒样粒子组合物中的C粒子的含有比例没有特别限定。通常可在不显著损害本发明的效果的范围内适当决定。

(2)第二方式的病毒样粒子组合物

本发明的第二方式的病毒样粒子组合物是含有第一方式的病毒样粒子的多种混合物的病毒样粒子组合物。第二方式的病毒样粒子组合物中含有的、第一方式的各病毒样粒子所具有的HBs-L抗原蛋白的基因型可以是不同的种类。

例如，可举出含有仅含有基因型A的HBs-L抗原蛋白作为HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子及仅含有基因型B的HBs-L抗原蛋白作为HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子的混合物的病毒样粒子组合物。

第二方式的病毒样粒子组合物中含有的、HBs-L抗原蛋白的基因型的种数没有特别限定。可举出例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种。第二方式的病毒样粒子组合物中的、第一方式的病毒样粒子的含有比例没有特别限定。通常可在不显著损害本发明的效果的范围内适当决定。

第二方式的病毒样粒子组合物中可含有C粒子。这样的第二方式的病毒样粒子组合物中的C粒子的含有比例没有特别限定。通常可在不显著损害本发明的效果的范围内适当决定。C粒子中含有的基因型C的HBs-L抗原蛋白的、具体的氨基酸序列及其突变体可与第一方式的病毒样粒子组合物同样。

(限)第三方式的病毒样粒子组合物

本发明的第三方式的病毒样粒子组合物是含有第二方式的病毒样粒子的多种混合物的病毒样粒子组合物。第二方式的病毒样粒子组合物中含有的、各病毒样粒子所具有的HBs-L抗原蛋白的基因型也可以是不同种类的基因型。

例如，可举出下述病毒样粒子组合物，所述病毒样粒子组合物含有：仅含有基因型A的HBs-L抗原蛋白以及基因型B的HBs-L抗原蛋白作为HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子；和，仅含有基因型C的HBs-L抗原蛋白以及基因型D的HBs-L抗原蛋白作为HBs-L抗原蛋白的病毒样粒子。

第三方式的病毒样粒子组合物中含有的、HBs-L抗原蛋白的基因型的种数没有特别限定。可举出例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种。第三方式的病毒样粒子组合物中的各种第二方式的病毒样粒子的含有比例没有特别限定。通常可在不显著损害发明的效果的范围内适当决定。

第三方式的病毒样粒子组合物可含有C粒子。这样的第三方式的病毒样粒子组合物中的C粒子的含有比例与第二方式的病毒样粒子组合物同样。C粒子中含有的基因型C的HBs-L抗原蛋白的、具体的氨基酸序列或其突变体与第一方式的病毒样粒子组合物同样。

(4)第四方式的病毒样粒子组合物

本发明的病毒样粒子组合物的第四方式是含有第一方式的病毒样粒子及上述第二方式的病毒样粒子的病毒样粒子组合物。第四方式的病毒样粒子组合物中含有的、各病毒样粒子所具有的HBs-L抗原蛋白的基因型可包含相同的基因型。

例如，可举出下述病毒样粒子组合物，所述病毒样粒子组合物含有：仅含有基因型A的HBs-L抗原蛋白作为HBs-L抗原蛋白的第一方式的病毒样粒子；和，仅含有基因型A的HBs-L抗原蛋白以及基因型C的HBs-L抗原蛋白作为HBs-L抗原蛋白的第二方式的病毒样粒子。

第四方式的病毒样粒子组合物中含有的、HBs-L抗原蛋白的基因型的种数没有特别限定。可举出例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种。第四方式的病毒样粒子组合物中的、第一方式的病毒样粒子及第二方式的病毒样粒子的含有比例没有特别限定。通常可在不显著损害本发明的效果的范围内适当决定。

第四方式的病毒样粒子组合物可含有C粒子。这样的第四方式的病毒样粒子组合物中的C粒子的含有比例与第二方式的病毒样粒子组合物同样。C粒子中含有的基因型C的HBs-L抗原蛋白的、具体的氨基酸序列或其突变体与第一方式的病毒样粒子组合物同样。

可使上述本发明的病毒样粒子或病毒样粒子组合物中含有含有HBV的核心抗原及其突变体的病毒样粒子。已知含有HBV的核心抗原的病毒样粒子容易针对HBV引发细胞免疫，因此通过含有该病毒样粒子而得到的病毒样粒子组合物尤其可良好地期待针对数种基因型的HBV引发免疫反应。相对于这样的本发明的病毒样粒子或病毒样粒子组合物而言的、含有HBV的核心抗原的病毒样粒子的混合量没有特别限定。通常可在可用于针对数种以上基因型的HBV引发免疫反应的范围内适当决定。

本发明的病毒样粒子或病毒样粒子组合物可期待用于针对数种基因型的HBV引发免疫反应，因此，可将它们用作针对HBV的疫苗(用于预防及/或治疗)。

HBV的预防用及/或治疗用疫苗

本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗含有上述病毒样粒子或病毒样粒子组合物。本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗中含有的病毒样粒子或病毒样粒子组合物的量没有特别限定。例如，每份的HBV的预防用及/或治疗用疫苗通常可以为0.0001～100质量％左右。

在本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗中可配合制备药学领域的组合物时使用的药学上可允许的已知的担载体或添加物。这样的担载体或添加物没有特别限定。可举出例如任意的担载体、稀释剂、赋形剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂(adjuvants)、介质、递送系统、乳化剂、片剂分解物质、吸收剂、保存剂、表面活性剂、着色剂、香料或甜味剂等。特别优选配合佐剂。

本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗可与上述担载体或配合物适当组合而制成任何剂型。具体而言，可举出输液剂、埋入注射剂、微针或持续性注射剂等注射剂；腹膜透析用剂或血液透析用剂等透析用剂；口腔内崩解片、咀嚼片、泡腾片、分散片或溶解片等片剂；硬胶囊或软胶囊等胶囊剂；包括泡腾颗粒剂、缓释性颗粒剂或肠溶性颗粒剂等颗粒剂；散剂、酏剂、悬浮剂、乳剂或柠檬水剂等口服液剂；糖浆剂、口服凝胶剂、锭剂、舌下片、***片、粘附片或胶剂(gum)等口腔用片剂；口腔用喷雾剂、口腔用半固态剂、含漱剂、吸入粉末剂、吸入液剂或吸入气溶胶剂等吸入剂；眼软膏剂等滴眼剂；滴耳剂；滴鼻粉末剂：鼻腔喷雾或滴鼻液剂等滴鼻剂；栓剂、直肠用半固态剂、注肠剂、***片、***用栓剂、或外用散剂等外用固态剂；搽剂或洗剂等外用液剂；外用气溶胶剂或泵喷雾剂等喷雾剂；软膏剂、霜剂、凝胶剂、胶带剂或巴布膏剂等贴剂等。这些剂型可基于第十六版日本药典说明书(日文：第16改正日本薬局方解說書)等已知的文献制备。

本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗的施予对象可举出罹患这些疾病的患者、可能患病的人或被判断为需要预防的人等。

本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗的施予方法没有特别限定。例如，可适当考虑上述施予对象或剂型等，采用已知的施予方法。具体而言，可举出经口施予、肌肉内施予、静脉内施予、动脉内施予、蛛网膜下腔内施予、皮内施予、腹腔内施予、鼻腔内施予、肺内施予、眼内施予、***内施予、颈部内施予、直肠内施予或皮下施予等。

本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗的施予量没有特别限定。例如，若施予对象为人，则通常为0.001～20μg/kg左右即可。本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗的治疗剂的施予次数没有特别限定。例如，可在能发挥针对HBV的预防用及/或治疗用疫苗的治疗效果的范围内，每日一次地施予上述的量，也可分成数次进行。本发明的HBV的预防用及/或治疗用疫苗的治疗剂的施予频率没有特别限定。例如，每天、隔天、每周、隔周、每2～3周、每月、隔月或每2～6个月等。

实施例

以下，为了更详细地说明本发明而示出实施例。需要说明的是，本发明当然不限于以下所示的实施例。

<实施例1>

基因型A、B、C及D的Pre-S1的融合蛋白及它们的肽的制作

(1)载体的构建

编码各基因型的Pre-S1肽的DNA序列基于以下的表2所示的模板使用PCR法进行制备。

[表2]

基因型	模板	来源序列号
			A	HPV全长基因组克隆Ae_US	登录号AB2463379
B	HPV全长基因组克隆Bj_JPN35	登录号AB24634112
			C	pGLD LIIP39-RcT	参考编号123
D	pCEP-ayw	登录号U9555137

※表中的Acc为NBCI的登录号，参考编号1为Kuroda等，J BiolChem，1992，267：1953-1961；PMID：137048及日本专利第4085231号中记载的载体(pGLD LIIP39-RcT)。

将得到的4种DNA片段***pET-32a载体(Novagen)。然后，在这些载体的编码Pre-S1肽的碱基序列的紧邻前方***可被人鼻病毒3C蛋白酶特异性切割的、编码序列号58的氨基酸序列的序列号59所示的碱基序列，将得到的各载体分别命名为pET-32a-3C-Pre-S1-A、pET-32a-3C-Pre-S1-B、pET-32a-3C-Pre-S1-C及pET-32a-3C-Pre-S1-D(图2)。

(2)使用了大肠杆菌的Pre-S1-TRX融合蛋白及Pre-S1肽的制备

使用上述(1)中制作的载体，对大肠杆菌株BL21(DE3)pLysS进行转化，得到它们的表达株。在IPTG诱导下培养各表达株，使用Chelating Sepharose Fast Flow(GEHealthcare)柱从其破碎液中得到各基因型的Pre-S1-TRX融合蛋白。向其中添加人鼻病毒3C蛋白酶，将各基因型的Pre-S1肽与TRX蛋白分离后，添加至上述柱中，将其洗脱液作为纯化Pre-S1肽。

(3)各基因型的Pre-S1-TRX融合蛋白及Pre-S1肽的确认

将得到的各基因型的Pre-S1-TRX融合蛋白供于SDS-PAGE，然后实施CBB染色，结果于分子量为约31kDa的位置处观察到条带(图3A)。将Pre-S1-TRX融合蛋白供于使用了抗Pre-S1抗体(小鼠单克隆抗体，Beacle，Inc.；BCL-AB-001)和作为二抗的抗小鼠IgG-HRP(Rockland，210-4302)的Western印迹(本说明书中有时将其称为“WB”)分析，结果于分子量约31kDa的位置处检测到条带(图3B)。由这些结果成功确认了各基因型的Pre-S1-TRX融合蛋白的纯化。另外，将上述纯化后的Pre-S1肽供于SDS电泳，结果于分子量为约11kDa的位置处观察到条带(图3C)。由该结果成功确认了作为目标的各基因型的Pre-S1-肽的纯化。

<实施例2>

(1)使用了质粒型表达载体的、基因型C的L抗原及M抗原粒子的制作

包含基因型C的HBsAg-L抗原蛋白(本说明书中有时将其称为“Lc蛋白”)的抗原粒子使用日本专利第4085231号中示出的载体、利用日本专利第4936272号示出的纯化方法进行制备。如此得到的粒子中含有的抗原蛋白仅由Lc蛋白构成，本说明书中有时将该粒子称为“Lc抗原”。另外，制作缺失LC基因的Pre-S1区的、图4所示的表达载体pGLD-MC，使用与Lc抗原相同方法来制备表达株，由对其进行培养的菌体纯化由Mc抗原蛋白构成的Mc抗原(M抗原粒子)。

(2)基于质粒表达确认Lc抗原及Mc抗原

将(1)中得到的Lc抗原供于SDS-PAGE，然后实施银染色，结果示于图5A。Lc蛋白(分子量为约42kDa)受到糖链修饰的影响而于略大于45kDa的位置处观察到相当于单体的条带，于97kDa附近处观察到相当于二聚体的条带。对Mc抗原同样地进行分析，结果如图5C所示，Mc抗原于分子量为约32kDa附近处观察到相当于单体的条带。

将Lc抗原供于使用了抗S抗体(兔多克隆抗体，Abcam公司，ab32916)、抗Pre-S1抗体(Beacle，Inc.；BCL-AB-001)或抗Pre-S2抗体(特殊免疫研究所，2APS42)的WB后，均于单体及二聚体的位置处检测到条带(图5B)。另外，对Mc抗原同样地进行分析，虽然抗S抗体及抗Pre-S2抗体于单体的位置处检测到条带，但抗Pre-S1抗体未检测到条带(图5D)。需要说明的是，WB中使用的二抗为抗兔IgG-HRP抗体(Santacruz，sc-2004)及抗小鼠IgG-HRP抗体(Rockland，210-4302)。

另外，自Scigen公司获得作为现有制品的Sci-B-Vac疫苗中利用的抗原，以Lc抗原作为对照供于SDS-PAGE后，实施银染色及WB，结果示于图6。根据银染色的结果，Sci-B-Vac抗原是由被认为由于糖链修饰而存在差异的各种蛋白构成的(主要的条带为按分子量计24、27、33、36、39及42kDa附近)，上述各条带的位置与使用与Sci-B-Vac抗原相同的方法使蛋白表达的非专利文献15所公开的结果良好地一致。供于WB的结果是，虽然针对抗S抗体检测到了全部上述条带，但针对抗Pre-S1抗体完全没有检测到条带。以上的结果显示，Sci-B-Vac抗原基本不具有Pre-S1，或者即使具有也极少。

以上的结果显示，制备的Lc抗原是由具有S区、Pre-S2区及Pre-S1区这三个区的L蛋白构成的粒子，并且由单体及二聚体组成。另外，阐明了Mc抗原由S区及Pre-S2区组成。需要说明的是，使用粒径分析仪(Zetasizer)(Malvern Panalytical)利用动态光散射法测定粒径，结果，Lc抗原的粒径为59.7nm左右，Mc抗原的粒径为62.5nm左右。

<实施例3>

质粒型表达载体pGLD-His4的制作

基于Lc抗原表达用质粒pGLD-LIIP39-RcT(日本专利第4085231号)制作了图7所示的pGLD-His4载体。His4基因片段是由出芽酵母的NA87-11A株的基因组DNA制得的。

<实施例4>

(1)使用了质粒型表达载体的基因型A、B及D的L抗原粒子的制作

使用上述表2中记载的模板针对编码基因型A、B及D的L蛋白(本说明书中，有时将它们分别称为“La蛋白”、“Lb蛋白”及“Ld蛋白”)的基因(本说明书中，有时将它们分别称为“LA基因”、“LB基因”及“LD基因”)实施PCR，使它们扩增。

自扩增后的LA、LB及LD各基因中使相当于被酵母内的蛋白酶分解的可能性高的Pre-S2区的6个氨基酸残基(LA：SISART；序列号60、LB：SILSKT；序列号61及LD：SIFSRI；序列号62)的基因序列缺失，另外，在各基因的5’侧***相当于日本专利第4085231号中示出的信号肽序列的序列，制作了图8所示的pGLD-His4-LA、pGLD-His4-LB及pGLD-His4-LD。

需要说明的是，本说明书中有时将利用pGLD-His4-LA而得到的、仅含有La蛋白作为抗原蛋白的粒子称为“La抗原”，同样地，本说明书中有时将仅含有Lb蛋白的粒子称为“Lb抗原”，并且，本说明书中有时将仅含有Ld蛋白的粒子称为“Ld抗原”

使用上述各载体转化酵母(AH22R-，Lue2及His4突变株)，通过规定的方法对其进行筛选，获得La、Lb及Ld抗原表达株。与实施例2同样地由对它们进行培养而得到的表达菌体来纯化La、Lb及Ld抗原粒子。

(2)基于质粒表达确认La、Lb及Ld抗原粒子

将(1)中制备的抗原粒子供于SDS-PAGE后，实施银染色，结果示于图9A。La、Lb及Ld蛋白的分子量分别为约42kDa，但由于糖链修饰，于分子量更大的位置处观察到单体条带，并于两倍分子量的位置观察到少量二聚体条带。

另外，将各抗原粒子供于使用了抗S抗体、抗Pre-S2抗体及抗Pre-S1抗体的WB，结果，于单体及二聚体的位置检测到条带(图9B)。需要说明的是，由于所有抗原均以较多的蛋白量供于电泳，因此检测到的条带呈宽幅(broad)形状，尤其La抗原于二聚***置处检测到2根条带。可以认为这反映了糖链修饰的差异。

需要说明的是，WB中使用的S区及Pre-S1区的检测用抗体与实施例2相同。并且，Pre-S2区的检测用抗体为抗Pre-S2抗体(Beacle，Inc.，BCL-ABP2-01)，二抗为抗兔IgG-HRP(Santacruz，sc-2004)。

以上的结果显示，(1)中制备的各基因型的L抗原是由具有S区、Pre-S2区及Pre-S1区的全长L蛋白构成的，并且由单体及少量二聚体组成。需要说明的是，使用粒径分析仪(Malvern Panalytical)利用动态光散射法测定(1)中制备的各基因型的L抗原的粒径，结果为55～65nm左右。

<实施例5>

Lc抗原表达用基因组组入型载体pRS-Ura3-LC3及pRS-Leu2-LC2的制作

将由实施例2中使用的Lc抗原表达用载体制备的LC基因、包含启动子及终止子的Lc蛋白表达盒阶段性地***pRS406(Stratagene)，制作了图10所示的包含3个LC基因的pRS-Ura3-LC3。

另一方面，制作了将pRS406的Ura3置换为Leu2而得到的载体pRS-Leu2。然后，将上述Lc抗原表达盒阶段性地***pRS-Leu2，制作了图11所示的包含2个LC基因的pRS-Leu2-LC2。

<实施例6>

(1)使用了基因组组入型载体pRS-Ura3-LC3及pRS-Leu2-LC2的Lc抗原表达株的制 作及Lc抗原粒子的纯化

使用直链化的pRS-Ura3-LC3，对酵母株AH22R-U(Ura3、Leu2、及His4突变株)进行转化。按照常规方法对其进行筛选，得到Lc抗原表达株(AH22R-U/Ura3株)。然后，使用直链化的pRS-Leu2-LC2对AH22R-U/Ura3株进行转化，按照常规方法对其进行筛选，得到Lc抗原表达株(AH22R-U/Ura3/Leu2株)。使用与实施例2同样的方法，由对该表达株进行液体培养而得到的表达菌体来纯化Lc抗原粒子。

(2)使用基因组组入型载体制作的Lc抗原粒子的确认

将(1)中得到的抗原粒子供于SDS-PAGE后，实施银染色，结果示于图12A。基因组组入型的Lc抗原也于与图5所示的质粒表达型的Lc抗原相同的位置处观察到单体，在为其两倍的位置处观察到二聚体条带。需要说明的是，与上述实施例2及4同样地在(1)中得到的Lc抗原粒子的粒径为60.1nm左右。

另外，将该抗原供于使用了抗S抗体、抗Pre-S1抗体及抗Pre-S2抗体的WB，如图12B所示，均于单体及二聚体的位置处出现了条带。需要说明的是，WB中使用的抗体与实施例2相同。

以上的结果显示，关于使用基因组组入型的载体制作的Lc抗原，从蛋白的分子量及其粒子大小方面来看，与使用质粒进行表达而得到的Lc抗原大致同等。

<实施例7>

施予L抗原时的抗体产生

将实施例2中制作的Lc抗原粒子及Mc抗原粒子与铝佐剂(alum adjuvant)混合而制备施予制剂。作为基因型C的S抗原粒子，利用了使用铝佐剂制备的市售的Bimmugen(化血研)。将其以每1只为5μg各抗原、2周间隔的方式3次施予至ICR品系小鼠(以3个个体作为一组)，于自最终施予起4周后采血，制备抗血清。

向将实施例1中制备的Pre-S1-TRX固相化的ELISA板(Pre-S1抗体测定用)、将Pre-S2-TRX(Beacle，Inc.制，BCL-AGS2-21)固相化的ELISA板(Pre-S2抗体测定用)及将S抗原(Fitzgerald公司，自美国购买)固相化的ELISA板(S抗体测定用)分别添加上述中制备的抗血清，利用经HRP标记的抗小鼠IgG作为二抗，测定与固相化的各抗原结合的抗体的量，结果示于图13。需要说明的是，利用了小鼠单克隆抗Pre-S1抗体(Beacle，Inc.制，BCL-AB-001)、小鼠单克隆抗Pre-S2抗体(Beacle，Inc.制，BCL-ABM2-01)及小鼠单克隆抗S抗体(HB5EXBIO社)作为用于制作标准曲线的标准抗体。

用S抗原粒子进行免疫后，仅产生了抗S抗体，用M抗原粒子进行免疫后，产生了抗S抗体及抗Pre-S2抗体。用Lc抗原粒子进行免疫后，不仅产生了抗S抗体及抗Pre-S2抗体，还产生了抗Pre-S1抗体。此时，发现产生了相对于抗Pre-S2抗体或抗S抗体而言为约5倍至10倍左右的抗Pre-S1抗体。以上的结果显示，仅由Lc蛋白组成的Lc抗原粒子适合制备大量的抗Pre-S1抗体，Pre-S1区的免疫原性远远高于其他区域。

<实施例8>

使用各种基因型的Pre-S1肽制备的抗血清及各基因型的Pre-S1的识别

将实施例1中得到的4种基因型的Pre-S1肽与弗氏佐剂混合而制备施予制剂。使用它们与实施例7同样地制备抗血清。向将实施例1中制备的4种Pre-S1-TRX融合蛋白进行了固相化的ELISA板添加稀释的各抗血清，使用HRP标记抗小鼠抗体作为检测抗体(基质为TMB)，测定各抗血清与各Pre-S1的结合的程度，结果示于图14。

用基因型A及C的Pre-S1肽进行免疫得到的抗血清与基因型A、B及C的Pre-S1均良好地结合，但针对基因型D的Pre-S1的结合弱(图14A及C)。另一方面，用基因型D的Pre-S1肽进行免疫得到的抗血清针对基因型D的Pre-S1的结合的程度较高，但针对基因型A、B及C的Pre-S1的结合的程度低(图14D)。以上的结果显示，基因型A及C的Pre-S1区引发类似的抗体产生，表明二者具有共通的表位。另一方面，显示基因型D的Pre-S1区具有与基因型A或C明显不同的表位。并且，表明基因型B具有与基因型A及C较为类似的表位。

<实施例9>

施予各种基因型L抗原导致的抗体产生

将实施例2及4中制备的各基因型(A～D型)的L抗原(各5μg)与弗氏佐剂混合而制备施予制剂。通过实施例7的方法，使用这些制剂对ICR品系的小鼠进行免疫而制备抗血清。与实施例7同样地测定抗S抗体、抗Pre-S2抗体及抗Pre-S1抗体的产生量，结果示于图15。通过各基因型的L抗原粒子的免疫，产生了抗S抗体、抗Pre-S2抗体及抗Pre-S1抗体。任一基因型中，抗Pre-S1抗体的产生量均为最高，是抗S抗体或抗Pre-S2抗体的4倍～数100倍。

另外，通过与实施例8同样的方法，观察上述各抗血清针对各基因型(A～D型)的Pre-S1的结合。对于结合的强度而言，将进行免疫的L抗原与作为测定对象的Pre-S1的基因型一致的情况的值作为100％、将针对其他基因型的Pre-S1的结合以相对值表示的结果示于图16及17。

根据图16所示的、针对各基因型的Pre-S1的各抗血清的3个个体的平均值的结合的结果，用Lb抗原进行免疫得到的抗血清与其他基因型的Pre-S1也良好地结合，另一方面，例如用Ld抗原进行免疫得到的抗血清可见针对基因型A的Pre-S1的结合差的趋势。

另外，根据图17所示的各个体的结果，对于用La抗原进行免疫得到的抗血清而言，存在针对基因型B的Pre-S1结合极差的情况，用Lb、Lc及Ld抗原进行免疫得到的抗血清也存在针对与免疫抗原不同的基因型的Pre-S1的结合极差的情况。

以上的结果显示，与基因型的差异无关，通过施予L抗原粒子可产生抗S抗体、抗Pre-S2抗体及抗Pre-S1抗体，对于其产生量而言，抗Pre-S1抗体最高。另外，还清楚了通过施予某一基因型的L抗原粒子产生的抗Pre-S1抗体存在针对其他基因型的Pre-S1区的结合极弱的情况。由此显示，对于用单独基因型的L抗原进行免疫而产生的抗Pre-S1抗体而言，若基因型不同，则未必可识别其他基因型的Pre-S1区。本发明的目的为创造能识别多个基因型的Pre-S1区的病毒样粒子，因此，进行了以下的研究。

<实施例10>

利用混合施予不同的基因型的L抗原而得到的抗血清的各种基因型Pre-S1的识别

如下述的表3(混合施予各种基因型的L抗原时的针对各基因型的Pre-S1的结合)所示，将实施例2及实施例4中制备的2种或3种基因型的L抗原等量混合，使L抗原的总量为5μg，使用与实施例9同样的方法对3个个体的ICR品系小鼠进行免疫，得到抗血清。

使用实施例8所示的方法测定得到的各抗血清的、针对基因型A、B、C及D的Pre-S1的结合的程度。需要说明的是，关于结合的程度的测定值，用La与Lb的混合物及La与Lb的混合物进行免疫的情况下，以针对基因型A的Pre-S1的结合的程度作为100％，将针对其他基因型的Pre-S1的结合的程度的相对值示于表3。同样地，用Lb与Lc的混合物及Lb与Ld的混合物进行免疫的情况下，以针对基因型B的Pre-S1的结合的程度作为100％，并且，用Lc与Ld的混合物及Lc、Lb及Ld的混合物进行免疫的情况下，以针对基因型C的Pre-S1的结合的程度作为100％，将针对其他基因型的Pre-S1的结合的程度的相对值示于表3。需要说明的是，全部值为由3个个体得到的抗血清的平均值。另外，作为一例，将用Lc与Ld的混合物进行免疫而得到的抗血清的测定结果示于图18。

由图18可见，用Lc与Ld的混合物进行免疫而得到的抗血清以大致同等的方式与基因型C及D的Pre-S1结合。另外，针对基因型A及B的Pre-S1的结合的程度为85％左右，将2种基因型的L抗原混合后，较之实施例9(图17)所示的将各基因型的L抗原单独施予的情况而言，针对不同的基因型的Pre-S1的结合提高。另外，即使对各个体进行观察，显示最低的结合程度的个体仍然为73％，不存在极低的结合的情况。另外，如表3所示，以其他的基因型的L抗原的组合进行混合的情况下，也确认了同样的现象，尤其将3种基因型的L抗原混合进行免疫而得到的抗血清的、针对各种基因型的Pre-S1的结合的程度最为良好。

[表3]

<实施例11>

包含Lc及Ld蛋白作为抗原的杂合型L抗原表达株(Lh1抗原)

(1)基于质粒型的Lh1表达株的制备

使用实施例4中制备的Ld抗原表达用质粒pGLD-His4-LD，对实施例6中制备的基因组组入型Lc抗原表达株(AH22R-U/Ura3/Leu2株)进行转化，按照常规方法对其进行筛选，得到在1个粒子内包含Lc蛋白及Ld蛋白的杂合L抗原(本说明书中，有时将其称为“Lh1抗原”)的表达株。

(2)基于基因组组入型的Lh1抗原表达株的制作-1

制备将pRS406的URA3置换为HIS4的pRS-His4，向其中***由实施例4中制备的Ld抗原表达用载体制备的LD基因、包含启动子及终止子的Ld抗原表达盒，制作了图19所示的包含2个LD基因的pRS-His4-LD2。

用直链化的pRS-His4-LD2对实施例6中制备的Lc抗原表达株(AH22R-U/Ura3/Leu2株)进行转化，按照常规方法对其进行筛选，获得Lh1表达株。

(3)基于基因组组入型的Lh1抗原表达株的制作-2

用实施例5中制备的Lc抗原表达载体pRS-Leu2-LC2对酵母株(AH22R-U)进行转化，按照常规方法对其进行筛选，得到Lc表达株。用通过与实施例5同样的方法制备的、图20所示的Ld抗原表达载体pRS-Ura3-LD2对该Lc表达株进行转化，按照常规方法对其进行筛选，获得Lh1表达株。

<实施例12>

Lh1抗原的制造和确认

(1)Lh1抗原的培养和纯化

与实施例2同样地，由在液体培养基中对通过实施例11的(1)至(3)得到的Lh1表达株进行培养而得到的菌体来纯化Lh1抗原粒子。

(2)识别基因型C及D的Pre-S1区的抗体的制作

由用基因型C的Pre-S1-TRX抗原对兔进行免疫而得到的抗血清纯化IgG。使该IgG通过基因型D型的Pre-S1-TRX固定柱2次，除去与基因型D的Pre-S1结合的IgG，制成特异性检测基因型C的Pre-S1的抗Pre-S1c抗体。另外，由用基因型D的Pre-S1-TRX抗原对兔进行免疫而得到的抗血清纯化IgG，使其通过基因型C的Pre-S1-TRX固定柱2次，制成特异性检测基因型D的Pre-S1的抗Pre-S1d抗体。

(3)包含Lc蛋白及Ld蛋白的Lh1抗原粒子的确认

将由实施例11(2)的表达株纯化的Lh1抗原供于SDS-PAGE后，实施银染色，结果示于图21A。L蛋白由于糖链修饰而于略大于分子量42kDa的位置处得到确认。

另外，实施使用了特异性识别上述(2)中制备的基因型C型及D型的Pre-S1区的抗Pre-S1c抗体和抗Pre-S1d抗体的WB，结果发现，任一种抗Pre-S1抗体均可检测到Lh1抗原。另一方面，作为对照的Lc抗原及Ld抗原仅检测到针对各自基因型的抗体。以上的结果显示，Lh1抗原是具有Lc蛋白及Ld蛋白这两者的抗原。需要说明的是，关于由实施例11的(1)至(3)的表达株得到的Lh1抗原，使用粒径分析仪测定粒径，结果为58～63nm左右，可知这些抗原同样地形成了粒子。

然后，使用针对基因型D特异性结合的、抗Pre-S2u表位抗体(特殊免疫研究所，非专利文献7)、(2)中制备的抗Pre-S1c抗体及实施例7中使用的抗S抗体，研究(1)中得到的Lh1抗原是否具有将基因型D的L蛋白及基因型C的L蛋白呈递至一个粒子上的、图22所示的结构。

在ELISA板上固相化抗Pre-S2u抗体或抗Pre-S1c抗体，利用这些抗体，捕捉实施例6的Lc抗原、实施例4的Ld抗原及上述Lh1抗原，对被捕捉的抗原用这3种抗体进行检测，结果示于表4(利用Lh1抗原的抗Pre-S2u抗体、抗Pre-S1c抗体及抗S抗体的分析结果)示于。需要说明的是，本测定体系中的临界值(cutoff value)为0.4。

[表4]

将抗Pre-S2u抗体固相化、使用抗Pre-S1c抗体或抗S抗体作为检测抗体的情况下，完全检测不到Lc抗原。由上述的WB的结果、实施例2及实施例12的结果可知，Lc抗原与抗Pre-S1c抗体或抗S抗体结合，因此，该结果显示，Lc抗原未与对于基因型D具有特异性的抗Pre-S2u抗体结合，未被捕捉至ELISA板。另一方面，Ld抗原的情况下，由于被抗Pre-S2u抗体捕捉，因此可被抗S抗体检测，但无法被对于基因型C具有特异性的抗Pre-S1c抗体检测。Lh1抗原的情况下，由于被抗Pre-S2u抗体捕捉，因此可被抗Pre-S1c抗体及抗S抗体中的任一者检测。

另外，固相化抗体为抗Pre-S1c抗体、使用抗Pre-S2u抗体或抗S抗体作为检测抗体的情况下，Lc抗原仅可被抗S抗体检测，Ld抗原由于未被抗Pre-S1c抗体捕捉，因此任一种检测抗体均无法对其进行检测。另一方面，Lh1抗原被抗Pre-S1c抗体捕捉，通过任一种抗体均可对其进行检测。

以上的结果显示，基因型D的Pre-S2和基因型C的Pre-S1被呈递至制成的Lh1抗原粒子上，即，显示了Lh1抗原是基因型D的L蛋白和基因型C的L蛋白被呈递至一个粒子上的图22所示的结构的抗原。

<实施例13>

包含Lc及Ld2抗原作为抗原的杂合型L抗原粒子(Lh1b抗原)

(1)质粒型Ld2抗原表达载体的制备

如下制作包含基因型D的Pre-S1区和基因型C的Pre-S2及S区的Ld2蛋白的表达载体。以实施例4中制备的Ld表达载体pGLD-His4-LD作为模板，通过反向PCR(inverse PCR)法扩增Pre-S2及S区以外的区域(Pre-S1及载体部分)。另行以表2中记载的基因型C作为模板，制作了基因型C的Pre-S2区及S区的片段。将其组入具有上述Pre-S1区的载体片段，制作了图23所示的pGLD-His4-LD2。需要说明的是，本说明书中有时将仅含有Ld2蛋白的粒子称为“Ld2抗原”

(2)Ld2抗原粒子表达株和杂合型L抗原粒子(Lh1b抗原)表达株的各抗原的制备

与实施例4同样地用pGLD-His4-LD2对酵母(AH22R-株)进行转化，获得Ld2抗原表达株。另外，用pGLD-His4-LD2对实施例6中制备的Lc抗原表达株进行转化，按照常规方法对其进行筛选，获得Lh1b抗原表达株。通过与实施例2同样的方法，由对其进行培养而得到的菌体纯化Ld2抗原和Lh1b抗原。将纯化的Ld2抗原和纯化Lh1b抗原供于SDS-PAGE，然后实施银染色，结果如图24所示，于接近于单体及二聚体的位置处观察到条带。另外，将两者供于WB，结果，就抗Pre-S1d抗体而言，于规定的位置处检测到两种抗原，抗Pre-S1c抗体虽然未检测到Ld抗原，但检测到Lh1d抗原。需要说明的是，WB中利用的抗体与实施例12中使用的抗体相同。

(3)Ld2抗原的免疫学的特性的研究

通过与实施例7同样的方法，用实施例2中制备的Lc抗原和纯化的Ld2抗原各5μg对各3个个体的小鼠进行免疫，得到抗血清。使用得到的抗血清，通过与实施例8同样的方法，观察针对4种基因型的Pre-S1的结合。各群中得到的结果的平均值示于表5。

[表5]

对于用Ld2抗原制备的抗血清而言，针对基因型D的Pre-S1的结合最强，针对基因型A及基因型B的Pre-S1的结合弱等，与实施例9中示出的用图16的Ld抗原制备的抗血清针对各基因型Pre-S1的结合的模式类似。以上的结果显示，通过仅将Lc抗原的Pre-S1区取代为基因型D的Pre-S1，能够产生具有与基因型D的L抗原所产生的针对Pre-S1的抗体同样性质的抗体。

<实施例14>

包含La及Ld抗原作为抗原的杂合型L抗原(Lh2抗原)

通过与实施例5同样的方法，制作了图25所示的基因组组入型La表达载体pRS-Leu2-LA2。使用其对酵母株AH22R-U株进行转化，按照常规方法对其进行筛选，得到La抗原表达株。然后，用实施例11中制备的Ld表达载体pRS-His4-LD2对得到的La抗原表达株进行转化，按照常规方法对其进行筛选，获得表达La蛋白及Ld蛋白的酵母株。通过与实施例2同样的方法，由对该株进行培养而得到的菌体来纯化Lh2抗原。将得到的纯化Lh2抗原供于SDS-PAGE，然后实施银染色，结果如图26所示，于接近于单体及二聚体的分子量的位置处观察到条带。

<实施例15>

包含Lb及Lc抗原作为抗原的杂合型L抗原(Lh3抗原)

通过与实施例5同样的方法，制作了图27所示的基因组组入型Lb表达载体pRS-Leu2-LB2。使用其对实施例6中制作的Lc抗原表达株(AH22R-U/Ura3株)进行转化，按照常规方法对其进行筛选，获得表达Lb蛋白及Lc蛋白的酵母株。通过与实施例2同样的方法，由对该株进行培养而得到的菌体来纯化Lh3抗原。将得到的纯化Lh3抗原供于SDS-PAGE，然后实施银染色，结果如图28所示，于接近于单体及二聚体的位置处观察到条带。

<实施例16>

包含Lb、Lc及Ld蛋白作为抗原的杂合型L抗原(Lh4抗原)

使用实施例11(2)中制备的基因组组入型Ld表达载体pRS-His4-LD2，对实施例15中制备的Lh3抗原(Lb及Lc蛋白)表达株进行转化，按照常规方法对其进行筛选，获得表达Lb、Lc及Ld蛋白的酵母株(方法1)。另外，用实施例4中制备的pGLD-His4-LB对实施例11(3)中制备的Lh1表达株(Lc及Ld蛋白)进行转化，按照常规方法对其进行筛选，获得表达Lb、Lc及Ld蛋白的酵母株(方法2)。通过与实施例2同样的方法，由对得到的2种Lh4抗原表达株进行培养而得到的菌体来纯化Lh4抗原。将得到的纯化Lh4抗原供于SDS-PAGE，然后实施银染色，结果如图29所示，由任何表达株得到的Lh4抗原均于接近于单体及二聚体的位置处观察到条带。

<实施例17>

施予Lh1抗原时的抗体产生及针对La、Lb、Lc及Ld抗原的结合

利用与实施例9相同的方法，用实施例12中制造的Lh1抗原及S抗原粒子(Fitzgerald公司)对各组4个个体的小鼠进行免疫而制备抗血清，使用与实施例7同样的方法测定抗Pre-S1抗体、抗Pre-S2抗体及抗S抗体的产生量。该结果示于图30。利用作为对照的S抗原的免疫中，仅产生了抗S抗体，但利用Lh1抗原的免疫中，产生了抗S抗体、抗Pre-S2抗体及抗Pre-S1抗体。这种情况下的抗S抗体的产生量与基于S抗原的免疫的产生量大致同等，抗Pre-S2抗体的产生量略微低于抗S抗体的产生量。另外，以显著多于其他2种抗体的量产生了抗Pre-S1抗体，其产生量为抗S抗体的4倍以上，并且为抗Pre-S2抗体的10倍左右。

另外，使用与实施例8相同的方法对这些抗血清针对基因型A、B、C、D的Pre-S1的结合的程度进行了调查，结果示于图31。用Lh1抗原进行免疫而得到的抗血清针对任何基因型的Pre-S1均以大致同等的强度结合。如上所述，针对Pre-S1区的抗体被认为对于HBV的感染防御是有效的，而Lh1抗原不仅产生极多的抗Pre-S1抗体，还与各种基因型的Pre-S1结合，因此，可得出结论，其是作为用于抑制HBV感染的疫苗而言理想的抗原。

<实施例18>

施予Lh1抗原时的抗体产生的时间曲线(time course)

将20μg Lh1抗原及铝佐剂的混合物皮下施予至ICR品系小鼠一次而进行免疫，对由经免疫的小鼠得到的抗血清中的抗Pre-S1抗体、抗Pre-S2抗体及抗S抗体产生的时间曲线进行了研究。与实施例7同样地对各抗体进行测定。该结果示于图32。

由图32可知，抗Pre-S1抗体的产生量最早上升，自免疫起第7天以后可确认到抗Pre-S1抗体的上升。自免疫起第11天以后可确认到抗Pre-S2抗体的产生。另一方面，抗S抗体的产生较慢，在自免疫起第14天仅确认到少量的产生。需要说明的是，在自免疫起第14天，抗Pre-S1抗体的产生量为抗Pre-S2抗体的4.4倍左右，并且为抗S抗体的40倍左右。

以上的结果表明在用Lh1抗原进行免疫的情况下，在体内迅速产生抗Pre-S1抗体，可在早期期待Lh1抗原的施予针对由HBV导致的感染的防御效果。

<实施例19>

利用抗Lh1抗体的逃逸突变抗原的检测

将向Lc抗原的S区的第129及145位导入精氨酸而制成的逃逸突变体抗原即HBs-L-ST抗原(Beacle，Inc.制：BCL-AGS-02)固相化，观察实施例7中使用的抗S抗体的结合，结果示于图33。几乎无法检测到HBs-L-ST抗原，但检测到作为对照的S抗原及Lh1抗原。即，显示了HBs-L-ST抗原具有通常的抗S抗体中无法检测的逃逸突变体的性质。

然后，将HBs-L-ST抗原和Lh抗原固相化，用抗Lh1抗体(所述抗Lh1抗体是使用蛋白A/G树脂对实施例17中得到的针对Lh1抗原的抗血清进行IgG纯化而得到的)进行检测，结果均以同等强度检测到抗原。以上的结果显示，用Lh1抗原进行免疫而得到的抗体也与逃逸突变体结合，针对逃逸突变体也可期待感染防御效果。

<实施例20>

利用Lh1b、Lh2、Lh3及Lh4的抗体产生

通过与实施例9相同的方法，用实施例13～16中制备的Lh1b、Lh2、Lh3及Lh4抗原对ICR品系小鼠进行免疫而得到抗血清。使用实施例8所示的方法，对得到的各抗血清的、针对基因型A、B、C及D的Pre-S1的结合的程度进行测定。需要说明的是，关于结果，Lh1b抗血清以与基因型C的Pre-S1的结合程度作为100％，Lh2抗血清以与基因型A的Pre-S1的结合程度作为100％，Lh3抗血清以与基因型B的Pre-S1的结合程度作为100％，及Lh4抗血清以与基因型C的Pre-S1的结合程度作为100％，示出了针对其他基因型的Pre-S1的结合的程度的相对值。需要说明的是，全部值为由3个个体得到的抗血清的测定值的平均。结果示于表6(通过利用各种杂合型L抗原的免疫得到的抗血清针对各种基因型Pre-S1的结合)。

使用Lh1b、Lh2、Lh3及Lh4抗原制备的抗血清针对任何基因型的Pre-S1均良好地结合，因此，这些杂合型的L抗原是产生与各种基因型的Pre-S1良好地结合的抗体的抗原，即，表明其能够针对数种以上基因型的HBV引起免疫反应。

[表6]

<实施例21>

使用Lh1及Lh4抗原中得到的抗血清的HBV感染中和活性

观察了实施例9中制备的针对La、Lb、Lc及Ld抗原的抗血清、实施例17中制备的针对Lh1抗原的抗血清、实施例20中制备的针对Lh4抗原的抗血清及由正常小鼠制备的血清(阴性对照)的、使用了HepG2-hNTCP-C4细胞(非专利文献2)的HBV感染中和活性。

将上述各抗血清用规定的培养基稀释为500倍(但对照血清为50倍)，向其中添加基因型A或基因型C的HBV(1.8×10⁴基因组当量)，制备试样。将这些试样添加至HepG2-hNTCP-C4细胞，培养16小时后，除去培养液进行洗涤，然后用正常培养基继续培养12天。

在培养结束后从细胞中提取DNA，通过RT-PCR对HBV-DNA进行定量。需要说明的是，RT-PCR中，使用了序列号63及序列号64所示的引物，利用了序列号65所示的探针。测得的HBV-DNA量以相对于阴性对照血清中得到的HBV-DNA量而言的相对值示出。该结果示于表7(施予各种L抗原而得到的抗血清的HBV感染中和实验的结果)。

[表7]

对于用La、Lb、Lc及Ld抗原进行免疫而得到的抗血清而言，HBV-DNA量均减少，显示出针对HBV感染的中和活性，但对于其强度而言，针对基因型A的HBV，La抗血清最强，Lb抗血清最弱。另一方面，针对基因型C的HBV，Lc抗血清最强，Ld抗血清最弱。

针对作为杂合型抗原的Lh1抗原(Lc及Ld蛋白)及Lh4抗原(Lb、Lc及Ld蛋白)的抗血清针对任何基因型的HBV均显示出强的中和活性。以上的结果显示，用杂合型抗原进行免疫后，可产生针对数种基因型的HBV感染显示同等的强烈的感染防御效果的抗体。由以上的结果确认到，杂合型抗原可用作针对数种基因型的HBV的疫苗。

<实施例22>

核心抗原的制备

基于登录号LC090200的氨基酸序列(序列号66)人工合成B型肝炎病毒的核心抗原(C抗原)基因，将其***pET19b(Novagen)，制作了图34所示的C抗原表达载体pET19b-HBcAg。用该载体对大肠杆菌株BL21(DE3)pLysS进行转化，得到C抗原表达株。通过与Palenzuela等的报道(Palenzuela PO等，Biotecnologia Aplicada，2002，19：138-142)同样的方法，由对C抗原表达株进行培养而得到的菌体来纯化C抗原。

将上述的纯化C抗原供于电泳，然后实施CBB染色，结果如图35所示，于分子量为约22kDa的被认为是单体的位置、和被认为是二聚体的两倍分子量的位置处观察到条带。使用粒径分析仪利用动态光散射法测定粒径，结果为38.2nm左右，可知制作的C抗原形成了粒子。

<实施例23>

施予Lh抗原及C抗原时的细胞免疫

将实施例12中制备的Lh1抗原及实施例22中制备的C抗原各自单独以各5μg、或这两者的等量的混合物(各5μg)与弗氏佐剂混合，用制得的施予制剂向ICR品系小鼠以10天间隔皮下施予3次从而进行免疫。在最终施予的1周后，采集其脾细胞，按照常规方法对其进行培养。在采集的翌日以最终浓度为10μg/mL用Lh1抗原、C抗原或其混合物刺激培养细胞，通过ELISA(Murine INFγ ELISA kit，Diaclone公司)测定刺激后第4天的培养上清液中的干扰素γ(INFγ)量，研究细胞免疫的活化。为了确认脾细胞的INFγ的释放能力，作为阳性对照刺激，实施伴刀豆球蛋白A(10μg/mL)的刺激。其结果示于图36。

由用Lh1抗原或C抗原进行免疫后的小鼠得到的脾细胞中，即使用Lh1抗原进行刺激也未确认INFγ的释放，但用C抗原进行刺激的情况、和用Lh1抗原及C抗原的混合物进行刺激的情况下，确认了INFγ的释放。较之用Lh1抗原进行免疫的情况而言，用C抗原进行免疫的情况下，该INFγ的释放量更多，确认了C抗原免疫带来的促进效果。对于由用Lh1抗原及C抗原的混合物进行免疫后的小鼠得到的脾细胞而言，INFγ的释放量远远多于单独用Lh1抗原或C抗原进行免疫的情况，用这2种抗原进行免疫时，确认了细胞免疫活化的协同效果。需要说明的是，由进行混合免疫后的小鼠得到的脾细胞中，在单独用Lh1抗原进行刺激的情况下，也确认了INFγ的释放。这些结果显示，Lh1抗原的单独免疫带来的细胞免疫活化能力低，而即使是C抗原的单独免疫也能够活化细胞免疫，使C抗原与Lh1抗原共存后，可协同性地活化细胞免疫。

<实施例24>

用Lh1抗原及C抗原的混合物或者S抗原及C抗原的混合物进行免疫的情况下的细 胞免疫的活化

与实施例23同样地用Lh1抗原及C抗原的混合物或者S抗原及C抗原的混合物(各5μg)对小鼠进行免疫，采集脾细胞进行培养。在采集的翌日用各种抗原刺激培养细胞(最终浓度为10μg/ml)，测定INFγ的释放量，结果示于表8(用Lh1抗原及C抗原的混合物或者S抗原及C抗原的混合物进行免疫的情况下的细胞免疫的活化)。表8的各数值表示INFγ的释放量(pg/ml)。

[表8]

对于由用Lh1抗原及C抗原进行免疫的小鼠得到的脾细胞而言，在来自全部抗原的刺激中，与进行刺激的抗原的基因型无关，INFγ的释放量均高于由用S抗原及C抗原进行免疫的小鼠得到的脾细胞。以上的结果显示，与基因型无关，用L1抗原和C抗原进行混合免疫后，较之用S抗原和C抗原进行混合免疫的情况而言，更强地刺激细胞免疫，另外，作为进行刺激的抗原，L抗原比S抗原更强，L抗原中，Lh1抗原最强。