阅读说明：本技术 用于诱导针对乙型肝炎病毒(hbv)的免疫应答的方法和组合物 (Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV) ) 是由 D·博登 H·霍顿 J-M·E·F·M·尼芙斯 S·罗伊 J·H·H·V·屈斯泰 R·C· 于 2018-12-18 设计创作，主要内容包括：本文提供编码HBV抗原的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体和腺病毒载体。本文还提供在人受试者中增强免疫应答的方法,其通过在初免/加强方案中使用编码HBV抗原的MVA和腺病毒载体以在人受试者中增强免疫应答。(Modified Vaccinia Ankara (MVA) vectors and adenoviral vectors encoding HBV antigens are provided herein. Also provided herein are methods of enhancing an immune response in a human subject by using MVA encoding HBV antigens and an adenoviral vector in a prime/boost regimen to enhance an immune response in a human subject.)

用于诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答的方法和组 合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年12月19日提交的国际专利申请号PCT/IB2017/058148以及2017年12月19日提交的美国临时专利申请号62/607,439的优先权，其公开整体援引加入本文。

电子提交的序列表的引用

本申请包含序列表，其为通过EFS-Web电子提交的ASCII格式的序列表，文件名为“688097-413序列表”，生成日期为2018年12月14日，大小为49.6KB。通过EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分，并且整体援引加入本文。

技术领域

本发明涉及生物技术。更具体地，本发明涉及用于在有需要的受试者中增强对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答的方法和组合物。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种3.2-kb的小嗜肝DNA病毒，其编码4个开放阅读框以及7种蛋白。约20亿人感染有HBV，并且约2.4亿人患有慢性乙型肝炎感染(慢性HBV)，其特征是血液中持续出现病毒和亚病毒颗粒达6个月以上(1)。持续的HBV感染通过病毒肽和循环抗原长期刺激HBV特异性T细胞受体，导致循环的和肝内HBV特异性CD4+和CD8+ T细胞的T细胞耗竭。结果，降低T细胞多能性(即IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IFN-γ的水平降低以及增殖的缺乏)。

自从20世纪80年代以来已经有了安全且有效的针对HBV感染的预防性疫苗，并且是乙型肝炎预防的主要手段(3)。世界卫生组织推荐对所有的婴儿进行疫苗接种，以及在低或中等乙型肝炎流行的国家，对所有的儿童和少年(小于18岁)以及某些处于风险群体中的人进行疫苗接种。由于进行了疫苗接种，世界范围的感染率明显下降。但是预防性疫苗无法治愈已有的HBV感染。

慢性HBV目前用IFN-α和核苷或核苷酸类似物进行治疗，但是由于感染的肝细胞的称为共价闭环DNA(cccDNA)的细胞内病毒复制中间体的持续出现而无法最终治愈，这种共价闭环DNA充当病毒RNA以及由此导致的新病毒体的模板而起到重要作用。据信，诱导的病毒特异性T细胞和B细胞应答可以有效地消除带有cccDNA的肝细胞。目前靶向HBV聚合酶的疗法抑制病毒血症，但是对于位于核中的cccDNA和循环抗原的相关产生则效果有限。治愈的最严格的形式可以是从有机体中消除HBV cccDNA，这未作为自然发生的结果而被观察到，也并非任何治疗介入的结果。然而，HBV表面抗原(HBsAg)的丧失临床上可信地等效于治愈，因为疾病复发仅在严重免疫抑制的情况下才发生，这又可以通过预防性治疗而加以防止。因此，至少从临床观点出发，HBsAg的丧失与针对HBV最严格形式的免疫重建有关。

例如，就有限治疗过程的持久非治疗(off-treatment)应答而言，已证实用聚乙二醇化的干扰素(pegIFN)-α进行免疫调节比核苷或核苷酸疗法更好。除了直接的抗病毒效果，据报道IFN-α在细胞培养和人源化小鼠中表现出对cccDNA的表观遗传抑制，这导致病毒体繁殖力和转录物的减少(4)。然而，这种疗法仍然具有副作用并且整体应答很低，部分地是因为IFN-α对HBV特异性T细胞仅具有较差的调节影响。具体地，治愈率低(<10％)并且毒性高。类似地，直接起作用的HBV抗病毒剂，即HBV聚合酶抑制剂恩替卡韦(entecavir)和替诺福韦(tenofovir)，在诱导病毒抑制中作为单一疗法是有效的，对于抗药性突变体的出现和肝病进程的连续预防具有高遗传屏障。然而，通过这类HBV聚合酶抑制剂实现由HBsAg丧失或血清学转换(seroconversion)所定义的慢性乙型肝炎的治愈是罕见的。因此，这些抗病毒剂在理论上需要无限期地给药以防止肝病的复发，这类似于人免疫缺陷病毒(HIV)的抗逆转录病毒疗法。

治疗性疫苗接种具有从长期感染的患者消除HBV的潜力(5)。已经研究了许多策略，但是目前尚未证实治疗性疫苗接种的成功。

发明内容

因此，对于具有较高治愈率的有限的良好耐受的治疗，治疗乙型肝炎病毒(HBV)(特别是慢性HBV)的医疗需求尚未满足。本申请满足这一需求。本申请提供改良型痘苗病毒安卡拉(Modified Vaccinia Ankara，MVA)载体。本申请的MVA载体包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列。所述MVA载体的HBV聚合酶抗原可以，例如，能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。在本申请的一实施方案中，HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的一实施方案中，第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:3至少90％相同。在本申请的一实施方案中，第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列。

在本申请的一实施方案中，MVA载体还可以包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至HBV聚合酶抗原的信号序列。所述信号序列可以例如包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

在本申请的一实施方案中，MVA载体还包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在本申请的一实施方案中，第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少90％相同。在本申请的一实施方案中，第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。

本申请还提供包含组合物，其包含本申请的MVA载体以及药学上可接受的载剂。

本申请还提供在有需要的人受试者中增强免疫应答的方法。所述方法包括(a)向所述人受试者给药第一组合物，其包含免疫学有效量的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列；以及(b)向所述人受试者给药第二组合物，其包含免疫学有效量的本申请的MVA载体；以在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。在本申请的一实施方案中，所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。在本申请的一实施方案中，所述第一组合物用于在有需要的受试者中引发免疫应答，而所述第二组合物用于在有需要的受试者中加强免疫应答。在本申请的一实施方案中，在步骤(a)后1-12周进行步骤(b)。在本申请的一实施方案中，在步骤(a)后2-12周进行步骤(b)。在本申请的一实施方案中，在步骤(a)后至少1周进行步骤(b)。在本申请的一实施方案中，在步骤(a)后至少2周进行步骤(b)。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。所述第一组合物的第一多核苷酸序列可以例如与SEQ ID NO:19至少90％相同。在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物中腺病毒载体的核酸分子还包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。所述第一组合物的第二多核苷酸序列可以例如与SEQID NO:17至少90％相同。在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白包含可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。所述第一组合物的融合蛋白可以例如包含通过接头可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。所述第一组合物的接头可以例如包含(AlaGly)_n的氨基酸序列，其中n为2-5的整数。优选地，接头由包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列编码。在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的融合蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在本申请的一实施方案中，增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的增强的抗体应答。增强的免疫应答可以例如包括人受试者中针对HBV抗原的增强的CD8+ T细胞应答。增强的免疫应答可以例如包括人受试者中针对HBV抗原的CD4+ T细胞应答。

在本申请的一实施方案中，腺病毒载体为rAd26或rAd35载体。

在本申请的一实施方案中，提供一种在人受试者中增强免疫应答的方法，所述方法包括：(a)向所述人受试者给药第一组合物，所述第一组合物包含免疫学有效量的第一质粒和第二质粒，所述第一质粒包含第一非天然存在的核酸分子，所述第一非天然存在的核酸分子包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，所述第二质粒包含第二非天然存在的核酸分子，所述第二非天然存在的核酸分子包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；以及(b)向所述人受试者给药第二组合物，所述第二组合物包含免疫学有效量的本申请的MVA载体；以在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。在本申请的一实施方案中，所述第一组合物用于引发免疫应答，而所述第二组合物用于加强免疫应答。在本申请的一实施方案中，在步骤(a)后1-12周进行步骤(b)。在本申请的一实施方案中，在步骤(a)后2-12周进行步骤(b)。在本申请的一实施方案中，在步骤(a)后至少1周进行步骤(b)。在本申请的一实施方案中，在步骤(a)后至少2周进行步骤(b)。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；并且更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。所述第一组合物的第一多核苷酸序列可以例如与SEQ ID NO:19至少90％相同。在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的第一多核苷酸序列与SEQ IDNO:20至少90％相同。所述第一组合物的第一多核苷酸序列可以例如包含SEQ ID NO:20。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的第一质粒的核酸分子还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至所述第一组合物的HBV聚合酶抗原的信号序列。所述信号序列可以例如包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:18至少90％相同。所述第一组合物的第二多核苷酸序列可以例如包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列。

在本申请的一实施方案中，所述第一组合物的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列还包含启动子序列、任选存在的一个或多个额外的调节序列；优选地，所述启动子序列包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列，并且所述额外的调节序列选自SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:15的增强子序列和SEQ ID NO:16的多腺苷酸化信号序列。

在本申请的一实施方案中，增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的增强的抗体应答。增强的免疫应答可以例如包括人受试者中针对HBV抗原的增强的CD8+ T细胞应答。增强的免疫应答可以例如包括人受试者中针对HBV抗原的增强的CD4+ T细胞应答。

本发明的其他方面、特征和优势参考以下公开，包括发明详述及其优选实施方案和所附权利要求，会更清楚。

附图说明

参考附图会更好地理解前述发明内容以及下文的发明详述。应当理解本发明并不限于附图中所示的具体实施方案。在附图中：

图1A-1B示出乙型肝炎病毒的基因组和病毒生命周期；图1A为乙型肝炎病毒(HBV)基因组的图示；在天然(native)病毒中，聚合酶蛋白(Pol)包含不同开放阅读框中的包膜蛋白的编码序列；包膜蛋白(pre-S1、pre-S2和S)在相同的开放阅读框中；图1B示出HBV的病毒生命周期。

图2A-2C示出本申请的实施方案的腺病毒和MVA载体的表达盒的示意图；图2A示出截短的HBV核心抗原的表达盒，其包含CMV启动子、内含子(衍生自人ApoAI基因的片段-GenBank登录号X01038的295–523碱基对，带有ApoAI第二内含子)、人免疫球蛋白分泌信号，然后是截短的HBV核心抗原的编码序列和SV40多腺苷酸化信号；图2B示出可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原的融合蛋白的表达盒，除了HBV抗原，其与截短的HBV核心抗原的表达盒相同；图2C示出包含可操作地连接至Pr13.5长启动子的HBV核心抗原的表达盒以及包含可操作地连接至PrHyb启动子的HBV聚合酶抗原的表达盒。

图3示出用HBV腺病毒载体和HBV MVA的不同组合免疫的F1小鼠的ELISPOT应答的图表；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的脾细胞的HBV核心或聚合酶肽池(pool)表示为黑色(核心)和灰色(pol)。将Pol1和pol2应答合计。X轴示出存在或不存在MVA加强下的腺病毒载体剂量；应答的T细胞的数目标识于y轴，表示为斑点形成细胞(SFC)/10⁶个脾细胞。

图4示出用HBV腺病毒载体和HBV MVA的不同组合免疫的F1小鼠的细胞内细胞因子染色(ICS)应答的图表；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的脾细胞的HBV核心或聚合酶肽池表示为黑色(核心)和灰色(pol)；将Pol1和pol2应答合计；X轴示出存在或不存在MVA加强下的腺病毒载体剂量。对于IFNγ阳性的CD8(+)T细胞的百分比示于y轴。

图5示出用HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的不同组合免疫的F1小鼠的ICS应答的图表；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的脾细胞的HBV核心或聚合酶肽池表示为黑色(核心)和灰色(pol)；将Pol1和pol2应答合计；X轴示出存在或不存在MVA加强下的腺病毒载体剂量；对于IFNγ阳性的CD4(+)T细胞的百分比示于y轴。

图6示出用HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的不同组合免疫的NHP的ELISPOT应答的图表；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的PBMC的HBV核心或聚合酶肽池表示为方框(核心)、圆形(pol1)和三角形(pol2)；X轴示出不同的实验组和时间点。应答的T细胞的数目标识于y轴，表示为斑点形成细胞(SFC)/10⁶个脾细胞；示出扣除背景(培养基+DMSO刺激)的数据。

图7A、图7B和图7C示出用HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的不同组合免疫的NHP的ICS应答的图表；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的PBMC的HBV核心或聚合酶肽池表示为方框(核心)、圆形(pol1)和三角形(pol2)；X轴示出不同的实验组和时间点；对IFNγ阳性的CD4(+)和CD8(+)T细胞的百分比标识于y轴，示出扣除背景(培养基+DMSO刺激)的数据。

具体实施方式

背景技术和整个说明书中引用或描述各种公开、文章和专利，其整体援引加入本文。本说明书中包括的文档、法规、材料、装置、物品等的讨论用于提供本发明的上下文。这样的讨论并不是承认这些事物的任何或全部构成公开或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。

除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文所用的某些术语具有说明书所列的含义。本文所引用的全部专利、公开的专利申请和出版物援引加入本文，如同全部列入本文一样。

应当注意，如本文以及所附的权利要求所用，除非上下文明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“这个”包括复数指代。

除非另外指明，任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL-1.1mg/mL。类似地，1mg/mL-10mg/mL的浓度范围包括0.9mg/mL-11mg/mL。如本文所用，除非上下文明确指出，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，以及落入该范围内的所有单个数值，包括这样范围内的整数以及值的分数。

除非另外指明，一系列元素前的术语“至少”应当理解为指代该系列中的每个元素。使用不超过常规的试验，本领域技术人员会认识到或者能够确定本文描述的具体实施方案的许多等同物。这类等同物也涵盖在本发明的范围内。

在整个说明书以及所附的权利要求中，除非上下文明显要求，词语“包含(comprise)”以及变体如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当理解为暗指涵盖指定的整数或步骤或者整数或步骤的集合，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的集合。当用于本文时，术语“包含”可以替换为术语“含有”或“包括”，或者当用于本文时有时替换为术语“具有”。

本文使用的“由…组成”排除未在指明的任何元素、步骤或成分。本文使用的“基本上由…组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新特性的材料或步骤。当任何时候在本申请的方面或实施方案的上下文中使用时，任何前述的术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”可以替换为术语“由…组成”或“基本上由…组成”以变化本发明的范围。

如本文所用，多个所列元素之间的连接术词“和/或”应当理解为涵盖单独和组合的选项。例如，当两个元素由“和/或”相连时，第一选项指在没有第二元素的情况下第一元素的适用性。第二选项指在没有第一元素的情况下第二元素的适用性。第三选项指第一元素和第二元素一起适用。这些选项中的任意一个都应理解为落入其含义内，并因此满足本文所用的术语“和/或”的要求。多个选项种的一个以上的并存适用性也应理解为落入其含义内，并因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，“受试者”表示任何动物，优选哺乳动物，最优选人，其要进行或已经进行根据本申请的实施方案的方法的治疗。本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、非人灵长类(NHP)如猴或猿、人等，更优选人。

术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且定义为一种或多种引起免疫系统刺激的物质。在本文上下文中，佐剂用于增强对本申请的腺病毒和/或MVA载体的免疫应答。

还应当理解，当提及优选发明的组分的尺寸或特征时，本文使用的术语“约”、“大约”、“通常”、“基本上”以及类似术语表示所述的尺寸/特征并非严格的边界或参数，也不排除功能上相同或相似的源于此的微小变化，如本文领域普通技术人员所理解的那样。至少，包括数值参数的这类引用将包括利用本领域公认的数学和工业原则(如，舍入、测量或其他系统误差、制造公允等)，不会改变最低有效位数。

在两个或更多个核酸或多肽序列(如，HBV抗原多肽和编码它们的多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或百分比“相同性”指，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测得的，比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列相同性。

用于序列比较的最优比对可以例如通过以下进行，Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索方法；这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或者通过目视检查(一般参见，Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubelet al.,eds.,Current Protocols,a joint venture between Greene PublishingAssociates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1995Supplement)(Ausubel))。

适合于确定百分比序列相同性和序列相似性的算法的实例有BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)是公众可得的。这种算法涉及首先通过识别查询序列(query sequence)中长度为W的短字来鉴定高分序列对(HSP)，这些短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阈值分数T。T称为邻近字分数阈值(Altschul et al，同上)。这些最初的邻近字命中(hit)充当启动搜索以查找包含它们的较长HSP的种子。然后将字命中沿着各序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对得分。

对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。停止字命中在各方向上的延伸，当：累积比对分数比其最大实现值减少数量X；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积得分变为零或以下；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认值：字长(W)为11、期望(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认值：字长(W)为3、期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。

除了计算百分比序列相同性外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供偶然发生两个核苷酸或氨基酸序列匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。

如下所述，两个核酸序列或多肽基本上相同的进一步指示是，由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽免疫学交叉反应。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅由于保守取代而不同。如下所述，两个核酸序列基本上相同的另一指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交。

如本文所用，术语“增强”当对于免疫应答使用时，例如CD4+ T细胞应答、抗体应答或CD8+ T细胞应答，指相对于从单独给药本申请的MVA载体或腺病毒的受试者观察到的相应免疫应答，给药本发明的MVA和腺病毒载体的初免-加强组合的受试者中增强的免疫应答。

如本文所用，术语“CD4+或CD8+T细胞应答”指T细胞免疫应答，其特征在于在疫苗接种后观察到总应答T细胞群体中高比例的免疫原特异性CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。总免疫原特异性T细胞应答可以通过IFN-γELISPOT测定来确定。免疫原特异性CD4+或CD8+ T细胞免疫应答可以通过ICS测定来确定。

如本文所用，术语“增强的抗体应答”指相对于从单独给药本发明的MVA载体或腺病毒的受试者观察到的相应免疫应答，给药本申请的MVA和腺病毒载体的初免-加强组合物的受试者中增强的抗体应答。

术语“佐剂”定义为一种或多种引起免疫系统刺激的物质。在本文上下文中，佐剂用于增强对本申请的质粒、腺病毒和/或MVA载体的免疫应答。

如本文所用，术语“抗原性基因产物或其片段”或“抗原蛋白”可以包括细菌、病毒、寄生虫或真菌蛋白或其片段。抗原蛋白或抗原性基因产物能够在宿主中引起保护性免疫应答，例如诱导针对疾病或感染(例如，细菌、病毒、寄生虫或真菌疾病或感染)的免疫应答，和/或在受试者中产生针对疾病或感染的免疫力(即，接种疫苗)，其保护受试者免于疾病或感染。

为了帮助阅读本申请的读者，说明书分为若干段落或节，或者涉及本申请的各个实施方案。这些区分并不理解为将段落、节或实施方案的内容与其他段落、节或实施方案分开。相反地，本领域技术人员应当理解，说明书有宽泛的应用，并涵盖可以考虑的各个节、段落和语句的所有组合。任何实施方案的讨论仅是示例性的，并不意图将包括权利要求在内的本公开的范围限制为这些实例。例如，虽然本文所述的本申请的HBV载体(如质粒DNA或病毒载体)的实施方案可以包含特定的组分，包括但不限于以特定次序排列的某些启动子序列、增强子或调节序列、信号肽、HBV抗原的编码序列、多腺苷酸化信号序列等，但是本领域技术人员应当理解本文公开的概念可以等同地应用于可以用于本申请的HBV载体的以其他次序排列的其他组分。本申请涵盖以任何组合使用具有任何序列的任何可用的组分，所述序列可以用于本申请的HBV载体，无论是否明确描述特定的组合。

乙型肝炎病毒(HBV)

如本文所用，“乙型肝炎病毒”或“HBV”指肝病毒科的病毒。HBV为小(如3.2kb)嗜肝DNA病毒，其编码4个开放阅读框和7种蛋白。参见图1A。HBV编码的7种蛋白包括小(S)、中(M)和大(L)表面抗原(HBsAg)或包膜(Env)蛋白、pre-Core蛋白、核心蛋白、病毒聚合酶(Pol)和HBx蛋白。HBV表达三种表面抗原或包膜蛋白L、M和S，其中S为最小的而L为最大的。M和L蛋白中的额外(extra)结构域分别命名为Pre-S2和Pre-S1。核心蛋白是病毒核壳体的亚基。Pol是合成病毒DNA(逆转录酶、RNaseH和引物)所需的，这发生在定位于感染的肝细胞的胞质的核壳体。PreCore是具有N末端信号肽的核心蛋白，并且从感染细胞分泌之前在其N和C末端经蛋白水解加工，即所谓的乙型肝炎e-抗原(HBeAg)。HBx蛋白是共价闭环DNA(cccDNA)的有效转录所需的。HBx并非病毒结构蛋白。除了共享mRNA的核心和聚合酶，HBV的所有病毒蛋白都具有其自身的mRNA。除了蛋白pre-Core之外，HBV病毒蛋白没有经受翻译后蛋白水解加工。

HBV病毒体含有病毒包膜、核壳体以及部分双链DNA基因组的单个拷贝。核壳体包含核心蛋白的120二聚体，并且被嵌入S、M和L病毒包膜或表面抗原蛋白的衣壳膜所覆盖。进入细胞后，病毒脱壳，并且包含衣壳的松弛环状DNA(rcDNA)与共价结合的病毒聚合酶迁移入细胞核。在那个过程中，核心蛋白的磷酸化引起结构变化，暴露核定位信号，使得衣壳与所谓的输入蛋白(importin)发生相互作用。这些输入蛋白介导核心蛋白与核孔复合物的结合，其后衣壳解体并且聚合酶/rcDNA复合物被释放到核中。在核中，rcDNA变为脱蛋白的(除去聚合酶)，并通过宿主DNA修复机制转化为共价闭环DNA(cccDNA)基因组，重叠转录物由其编码HBeAg、HBsAg、核心蛋白、病毒聚合酶和HBx蛋白。核心蛋白、病毒聚合酶和前基因组RNA(pgRNA)在胞质中关联并自组装为包含未成熟pgRNA的衣壳颗粒，其又转化为成熟rcDNA-衣壳并且作为共有中间体起作用，其被包膜并作为感染性病毒颗粒而被分泌，或者运送回核中以补充并维持稳定的cccDNA池(pool)。参见图1B。

迄今为止，基于存在于包膜蛋白上的抗原表位，HBV分为4种血清型(adr、adw、ayr、ayw)，并且基于病毒基因组的序列分为8种基因型(A、B、C、D、E、F、G和H)。HBV基因型分布于不同的地理区域。例如，亚洲最流行的基因型是因型B和C。基因型D在非洲、中东和印度占优势，而基因型A广泛分布于北欧、撒哈拉以南非洲和西非。

HBV抗原

如本文所用，术语“HBV抗原”、“HBV的抗原多肽”、“HBV抗原多肽”、“HBV抗原蛋白”、“HBV免疫原性多肽”和“HBV免疫原”全部都指这样的多肽，其能够在受试者中诱导针对HBV的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答。HBV抗原可以是HBV的多肽、其片段或表位，或者多种HBV多肽的组合、其部分或衍生物。HBV抗原能够在宿主中引发保护性免疫应答，例如诱导针对病毒疾病或感染的免疫应答，和/或在受试者中产生针对病毒疾病或感染的免疫力(即，接种疫苗)，其保护受试者免于病毒疾病或感染。例如，HBV抗原可以包含来自任何HBV蛋白的多肽或其免疫原性片段，例如源自任何HBV基因型(如基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H，或其组合)的HBeAg、pre-core蛋白、HBsAg(S、M或L蛋白)、核心蛋白、病毒聚合酶或HBx蛋白。

(1)HBV核心抗原

如本文所用，术语“HBV核心抗原”、“HBcAg”和“核心抗原”的每一个指HBV抗原，其能够在受试者中诱导针对HBV核心蛋白的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答。术语“核心”、“核心多肽”和“核心蛋白”的每一个指HBV病毒核心蛋白。全长核心抗原的长度通常为183个氨基酸，并且包括组装结构域(第1-149位氨基酸)和核酸结合结构域(第150-183位氨基酸)。34-残基的核酸结合结构域对于前基因组RNA衣壳化是必需的。这个结构域还充当核输入信号。其包含17个精氨酸残基，并且是高度碱性的，与其功能一致。HBV核心蛋白在溶液中是二聚的，二聚体自组装为二十面体衣壳。核心蛋白的每个二聚体具有4个α螺旋束，在两端的侧面是α螺旋结构域。缺少核酸结合结构域的截短的HBV核心蛋白也能形成衣壳。

在本申请的一实施方案中，HBV抗原是截短的HBV核心抗原。如本文所用，“截短的HBV核心抗原”指HBV抗原，其不包含HBV核心蛋白的全长，但是能够在受试者中诱导针对HBV核心蛋白的免疫应答。例如，HBV核心抗原可以进行修饰以缺失核心抗原的高度带正电(富含精氨酸)的C末端核酸结合结构域的一个或多个氨基酸，所述结构域通常包含17个精氨酸(R)残基。在本申请的一些实施方案中，HBV核心抗原为截短的HBV核心蛋白。本申请的截短的HBV核心抗原优选为C末端截短的HBV核心蛋白(其不包含HBV核心核输入信号)和/或截短的HBV核心蛋白(C末端HBV核心核输入信号已经从其缺失)。在本申请的一实施方案中，截短的HBV核心抗原包含C末端核酸结合结构域中的缺失，例如C末端核酸结合结构域1-34个氨基酸残基的缺失，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸残基，优选缺失所有34个氨基酸残基。在一优选实施方案中，截短的HBV核心抗原包含C末端核酸结合结构域中的缺失，优选缺失所有34个氨基酸残基。

根据本申请的实施方案，HBV核心抗原可以是共有序列，其源自多种HBV基因型(如基因型A、B、C、D、E、F、G和H)。如本文所用，“共有序列”表示基于同源蛋白的氨基酸序列比对的人工氨基酸序列，例如通过同源蛋白的氨基酸序列的比对(例如，使用Clustal Omega)确定的。其可以是基于至少100种天然HBV分离物的HBV抗原(如核心、pol等)的序列，在序列比对的每个位置所发现的频率最高的氨基酸残基的计算排序(order)。共有序列可以是非天然存在的，并且可以与天然的病毒序列不同。共有序列可以这样设计，通过利用多序列比对工具比对不同来源的多种HBV抗原序列，并且在可变的比对位置，选择频率最高的氨基酸。优选地，HBV抗原的共有序列源自HBV基因型B、C和D。术语“共有抗原”指具有共有序列的抗原。

本申请一实施方案的截短的HBV核心抗原缺少核酸结合功能，并且能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，截短的HBV核心抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，截短的HBV核心抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

在本申请的一优选实施方案中，HBV核心抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，更优选源自HBV基因型B、C和D的截短的共有抗原。本申请的示例性截短的HBV核心共有抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:2为源自HBV基因型B、C和D的核心共有抗原。SEQID NO:2含有天然核心抗原的高度带正电(富含精氨酸)的核酸结合结构域的34-氨基酸C末端缺失。

在本申请的一具体实施方案中，HBV核心抗原为截短的HBV抗原，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

(2)HBV聚合酶抗原

如本文所用，术语“HBV聚合酶抗原”、“HBV Pol抗原”或“HBV pol抗原”指HBV抗原，其能够在受试者中诱导针对HBV聚合酶的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答。术语“聚合酶”、“聚合酶多肽”、“Pol”和“pol”的每一个指HBV病毒DNA聚合酶。HBV病毒DNA聚合酶具有4个结构域，从N末端到C末端包括，末端蛋白(TP)结构域，其充当负链DNA合成的引物；间隔子，其对聚合酶功能不关键；逆转录酶(RT)结构域，其用于转录；以及RNase H结构域。

在本申请的一实施方案中，HBV抗原包括HBV Pol抗原，或其任何免疫原性片段或组合。HBV Pol抗原可以含有进一步的修饰以改进抗原的免疫原性，例如通过向聚合酶和/或RNase结构域的活性位点引入突变以降低或基本上消除某些酶促活性。

优选地，本申请的HBV Pol抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性，并且可以能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，HBV Pol抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，HBV Pol抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

因此，在本申请的一些实施方案中，HBV Pol抗原为灭活的Pol抗原。在本申请的一实施方案中，灭活的HBV Pol抗原包含聚合酶结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。在另一实施方案中，灭活的HBV Pol抗原包含RNaseH结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。在一优选实施方案中，灭活的HBV pol抗原包含聚合酶结构域和RNaseH结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。例如，核苷酸/金属离子结合所必需的HBV pol抗原的聚合酶结构域中的“YXDD”基序可以进行突变，例如用天冬酰胺残基(N)代替一个或多个天冬氨酸残基(D)，消除或降低金属配位功能，从而降低或基本上消除逆转录酶功能。替代“YXDD”基序的突变，或除“YXDD”基序的突变之外，Mg²⁺配位所需的HBV pol抗原的RNaseH结构域中的“DEDD”也可以进行突变，例如用天冬酰胺残基(N)代替一个或多个天冬氨酸残基(D)，和/或用谷氨酰胺(Q)代替谷氨酸残基(E)，从而降低或基本上消除RNaseH功能。在一具体实施方案中，HBV pol抗原通过以下进行修饰：(1)将聚合酶结构域的“YXDD”基序中的天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)；和(2)将RNaseH结构域的“DEDD”基序中的第一个天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)，并将第一个谷氨酸残基(E)突变为谷氨酰胺残基(N)，从而降低或基本上消除pol抗原的逆转录酶和RNaseH功能。

在本申请的一优选实施方案中，HBV pol抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，更优选源自HBV基因型B、C和D的灭活的共有抗原。本申请的示例性HBV pol共有抗原包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:4至少98％相同，例如与SEQ ID NO:4至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:4为源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，其包含位于聚合酶和RNaseH结构域的活性位点中的4个突变。具体地，所述4个突变包括聚合酶结构域的“YXDD”基序中天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)，和RNaseH结构域的“DEDD”基序中的第一个天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)和谷氨酸残基(E)突变为谷氨酰胺残基(Q)。

在本申请的一具体实施方案中，HBV pol抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的其他实施方案中，HBV pol抗原由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。

(3)HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原的融合

如本文所用，术语“融合蛋白”或“融合”指单一多肽链，其具有至少两个多肽结构域，所述至少两个多肽结构域通常不存在于单一的天然多肽中。

在本申请的一实施方案中，HBV抗原包含融合蛋白，其包含可操作地连接至HBVpol抗原的截短的HBV核心抗原，或者可操作地连接至截短的HBV核心抗原的HBV pol抗原，优选通过接头连接。

如本文所用，术语“接头”指化合物或部分，其充当分子桥以可操作地连接两个不同的分子，其中接头的一部分可操作地连接至第一分子，并且其中接头的另一部分可操作地连接至第二分子。例如，在包含第一多肽和第二异源多肽的融合蛋白中，接头主要充当第一和第二多肽之间的间隔子。在一实施方案中，接头由通过肽键连接的氨基酸构成，优选由1-20个通过肽键连接的氨基酸构成，其中所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在一实施方案中，所述1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。优选地，接头由大多数空间上不受妨碍的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头有聚甘氨酸，特别是(Gly)₅、(Gly)₈；聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。下文的实施例中所示的一种示例的合适接头为(AlaGly)_n，其中n为2-5的整数。

优选地，本申请的融合蛋白能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的HBV核心和HBV Pol的免疫应答。优选地，融合蛋白能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，融合蛋白能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

在本申请的一实施方案中，融合蛋白包含截短的HBV核心抗原、接头和HBV pol抗原，所述截短的HBV核心抗原具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，所述HBV pol抗原具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。

在本申请的一优选实施方案中，融合蛋白包含截短的HBV核心抗原、接头和HBVPol抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，所述接头包含(AlaGly)_n，其中n为2-5的整数，所述HBV Pol抗原具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。更优选地，本申请的一实施方案的融合蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在本申请的一实施方案中，融合蛋白还包含信号序列。优选地，信号序列具有SEQID NO:6或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。更优选地，融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

多核苷酸和载体

在另一总的方面，本申请提供一种非天然存在的核酸分子，其编码本申请一实施方案的HBV抗原，以及包含所述非天然存在的核酸的载体。非天然存在的核酸分子可以包含编码本申请的HBV抗原的任何多核苷酸序列，其可以利用本领域已知的方法根据本公开来制备。优选地，多核苷酸编码本申请的HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的至少一种。多核苷酸可以为RNA的形式或者DNA的形式，其可以通过重组技术(如克隆)获得或合成(如化学合成)制备。DNA可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列的部分。DNA可以例如包含基因组DNA、cDNA或其组合。多核苷酸还可以为DNA/RNA杂合体。本申请的多核苷酸和载体可以用于重组蛋白制备，在宿主细胞中表达蛋白，或者制备病毒颗粒。优选地，多核苷酸为DNA。

在本申请的一实施方案中，非天然存在的核酸分子包含多核苷酸，其编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:2至少98％、99％或100％相同。在本申请一具体的实施方案中，非天然存在的核酸分子编码截短的HBV核心抗原，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

本申请的编码截短的HBV抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于这样的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1至少98％、99％或100％相同，所述截短的HBV核心抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在本申请一具体的实施方案中，编码截短的HBV核心抗原的非天然存在的核酸分子包含SEQID NO:1、17或18的多核苷酸序列。

在本申请的一实施方案中，非天然存在的核酸分子编码HBV聚合酶抗原，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。在本申请的一具体实施方案中，非天然存在的核酸分子编码HBV聚合酶抗原，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

本申请的编码HBV Pol抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于这样的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:3至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3至少98％、99％或100％相同，所述HBV Pol抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的一具体实施方案中，编码HBV pol抗原的非天然存在的核酸分子包含SEQ ID NO:3、19或20的多核苷酸序列。

在本申请的另一实施方案中，非天然存在的核酸分子编码融合蛋白，其包含可操作地连接至HBV Pol抗原的截短的HBV核心抗原，或者可操作地连接至截短的HBV核心抗原的HBV Pol抗原。在一具体的实施方案中，本申请的非天然存在的核酸分子编码截短的HBV核心抗原、接头和HBV聚合酶抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同；所述HBV聚合酶抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:4至少98％、99％或100％相同。在本申请的一具体实施方案中，非天然存在的核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白包含截短的HBV核心抗原、接头和HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；所述接头包含(AlaGly)n，其中n为2-5的整数；所述HBV Pol抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的一具体实施方案中，非天然存在的核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

本申请的编码融合蛋白的多核苷酸序列的实例包括但不限于多核苷酸序列，其可操作地连接至接头编码序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少90％相同，例如与SEQID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1至少98％、99％或100％相同，所述接头编码序列与SEQ IDNO:14至少90％相同，例如与SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:14至少98％、99％或100％相同，所述接头编码序列进一步可操作地连接至多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQID NO:3至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3至少98％、99％或100％相同。在本申请的一具体实施方案中，非天然存在的核酸分子编码融合蛋白，其包含SEQ ID NO:1，可操作地连接至SEQ ID NO:14，其进一步可操作地连接至SEQ ID NO:3。

在另一总的方面，本申请涉及一种载体，其包含编码HBV抗原的分离的多核苷酸。如本文所用，“载体”为核酸分子，用于将遗传物质带入其他细胞，在那里其可以进行复制和/或表达。根据本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体(噬菌体、动物病毒和植物病毒)、粘粒和人工染色体(如YAC)。优选地，载体为DNA质粒。载体可以是DNA载体或RNA载体。本领域技术人员根据本公开可以通过标准重组技术可以构建本申请的载体。

根据本申请的实施方案，载体可以是表达载体。如本文所用，术语“表达载体”指任何类型的遗传构建体，其包含编码能被转录的RNA的核酸。表达载体包括但不限于用于重组蛋白表达的载体，如DNA质粒或病毒载体，以及用于将核酸递送入受试者以在受试者的组织中表达的载体，如DNA质粒或病毒载体。本领域技术人员应当理解表达载体的设计可以取决于这样的因素：要转化的宿主细胞的选择，期望的蛋白的表达水平等。

本申请实施方案的载体可以含有各种调节序列。如本文所用，术语“调节序列”指任何序列，其允许、有助于或调整核酸分子的功能性调节，包括核酸或其衍生物之一(即，mRNA)的复制、倍增、转录、剪接、翻译、稳定性和/或向宿主细胞或有机体的转运。在本公开的上下文中，该术语涵盖启动子、增强子以及其他表达控制元件(如多腺苷酸化信号和影响mRNA稳定性的元件)。

在本申请的一些实施方案中，载体为非病毒载体。非病毒载体的实例包括但不限于DNA质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体等。优选地，非病毒载体为DNA质粒。“DNA质粒”与“DNA质粒载体”、“质粒DNA”或“质粒DNA载体”互换使用，表示双链的，并且通常是环状的DNA序列，其能够在合适的宿主细胞中自主复制。用于表达编码的多核苷酸的DNA质粒通常包含复制起点、多克隆位点和选择标记，其可以例如是抗生素抗性基因。适合用于本申请的DNA质粒的实例包括但不限于用于公知的表达系统(包括原核和真核系统)的可商购表达载体，例如pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中制备和/或表达蛋白；pYES2(Invitrogen,Thermo FisherScientific)，其可以用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中制备和/或表达；

完全杆状病毒表达系统(Thermo Fisher Scientific)，其可以用于在昆虫细胞中制备和/或表达；pcDNA^TM或pcDNA3^TM(Life Technologies,Thermo FisherScientific)，其可以用于在哺乳动物细胞中进行高水平组成型蛋白表达；和pVAX或pVAX-1(Life Technologies,Thermo Fisher Scientific)，其可以用于在大部分哺乳动物细胞中高水平瞬时表达所关注的蛋白。通过使用常规的技术和容易获得的起始原料，任何可商购的DNA质粒的骨架可以进行修饰以优化在宿主细胞中的蛋白表达，例如逆转某些元件的方向(如复制起点和/或抗生素抗性盒)，替换质粒内源的启动子(如抗生素抗性盒中的启动子)，和/或替换编码转录的蛋白的多核苷酸序列(如抗生素抗性基因的编码序列)。(参见，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning a Laboratory Manual,Second Ed.ColdSpring Harbor Press(1989))。

在本申请的优选实施方案中，DNA质粒为适合于在哺乳动物宿主细胞中进行蛋白表达的表达载体。适合于在哺乳动物宿主细胞中进行蛋白表达的表达载体包括但不限于pcDNA^TM、pcDNA3^TM、pVAX、pVAX-1、ADVAX、NTC8454等。优选地，表达载体基于pVAX-1，其可以进一步修饰以优化哺乳动物细胞中的蛋白表达。pVAX-1是DNA疫苗中常用的质粒，并且包含强的人巨细胞病毒立即早期(CMV-IE)启动子，随后是牛生长激素(bGH)衍生的多腺苷酸化序列(pA)。pVAX-1还含有pUC复制起点和由小原核启动子驱动的卡那霉素抗性基因，其允许细菌质粒增殖。

在本申请的一实施方案中，载体为病毒载体。通常，病毒载体为遗传工程改造的病毒，其带有修饰的病毒DNA或RNA，其已经不具备感染性，但仍然包含病毒启动子和转基因，从而允许通过病毒启动子翻译转基因。因为病毒载体经常缺少感染性序列，所以它们要求辅助病毒或包装线以进行大规模转染。适合用于本申请的病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、肠病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)载体、烟草花叶病毒载体、慢病毒(lentiviral)载体等。

根据本申请的实施方案，载体如DNA质粒或病毒载体可以包含任何调节元件以建立载体的常规功能，包括但不限于载体的多核苷酸序列编码的HBV抗原的复制和表达。调节元件包括但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化信号、翻译终止密码子、核糖体结合元件、转录终止子、选择标记、复制起点等。载体可以包含一个或多个表达盒。“表达盒”是载体的一部分，其指导细胞机器来产生RNA和蛋白。表达盒通常包含3个组分：启动子序列、开放阅读框和任选地包含多腺苷酸化信号的3’-未翻译区域(UTR)。开放阅读框(ORF)是阅读框，其含有所关注的蛋白的编码序列(如HBV抗原)，从起始密码子到终止密码子。表达盒的调节元件可以可操作地连接至编码所关注的HBV抗原的多核苷酸序列。如本文所用，术语“可操作地连接”以其最宽泛的合理语境使用，并且指多核苷酸元件以功能性关系连接。多核苷酸当其置于与另一多核苷酸的功能性关系中时，“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则其可操作地连接至所述编码序列。

在一些实施方案中，载体包含启动子序列，优选在表达盒中，以控制所关注的HBV抗原的表达。术语“启动子”以其常规的含义使用，并且指核苷酸序列，其起始可操作地连接的核苷酸序列的转录。启动子位于其转录的核苷酸序列的相同链的附近。启动子可以是组成型、诱导型或抑制型的。启动子可以是天然存在的或者合成的。启动子可以源自的来源包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物。启动子可以是同源启动子(即，源自与载体相同的遗传来源)或异源启动子(即，源自不同的载体或遗传来源)。例如，如果要使用的载体是DNA质粒，启动子可以是质粒内源的(同源)，或源自其他来源(异源)。优选地，启动子位于表达盒中编码HBV抗原的多核苷酸的上游。

适用于本申请的启动子的实例包括但不限于来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子，如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV立即早期启动子(CMV-IE)、Epstein Barr病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。适合用于本申请的其他启动子包括但不限于RSV启动子，逆转录病毒LTR、腺病毒主要晚期启动子和各种痘病毒启动子，其包括但不限于以下痘苗病毒或MVA衍生的和FPV衍生的启动子：30K启动子、I3启动子、PrS启动子、PrHyb、PrS5E启动子、Pr7.5K、Pr13.5长启动子、40K启动子、MVA-40K启动子、FPV 40K启动子、30k启动子、PrSynIIm启动子、PrLE1启动子和PR1238启动子。额外的启动子还描述于WO 2010/060632、WO 2010/102822、WO 2013/189611、WO 2014/063832和WO2017/021776，其整体援引加入本文。

启动子还可以是来自人基因的启动子，例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然或合成的。

在本申请的优选实施方案中，启动子为强的真核启动子，优选巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)启动子。示例性的CMV-IE启动子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:7。

在本申请的另一优选实施方案中，启动子为痘病毒启动子，优选选自PrMVA 13.5长和/或PrHyb的启动子。示例性Pr13.5长启动子和PrHyb启动子的核苷酸序列分别示于SEQID NO:25和26。

在一些实施方案中，载体包含额外的多核苷序列，其稳定表达的转录物、增强RNA转录物的核输出，和/或改善转录-翻译偶联。这类序列的实例包括多腺苷酸化信号和增强子序列。多腺苷酸化信号通常位于载体的表达盒中所关注蛋白(如HBV抗原)的编码序列的下游。增强子序列为调节DNA序列，当由转录因子结合时，其增强相关基因的转录。增强子序列优选位于载体的表达盒中编码HBV抗原的多核苷酸序列的上游，但位于启动子序列的下游。

根据本公开可以使用本领域技术人员已知的任何多腺苷酸化信号。例如，多腺苷酸化信号可以是SV40多腺苷酸化信号(如SEQ ID NO:16)、LTR多腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多腺苷酸化信号或人β-球蛋白多腺苷酸化信号。在本申请的一优选实施方案中，多腺苷酸化信号为牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号。示例性的bGH多腺苷酸化信号的核苷酸序列示于SEQ ID NO:9。

根据本公开可以使用本领域技术人员已知的任何增强子序列。例如，增强子序列可以为人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子(如来自CMV、HA、RSV或EBV的病毒增强子)。具体增强子的实例包括但不限于土拨鼠(Woodchuck)HBV转录后调节元件(WPRE)、源自人载脂蛋白A1前体的内含子/外显子序列、人T细胞1型白血病病毒(HTLV-1)长末端重复(LTR)的未翻译R-U5结构域、剪接增强子、合成兔β-球蛋白内含子，或其任意组合。在本申请的一优选实施方案中，增强子序列为HTLV-1LTR的未翻译R-U5结构域、兔β-球蛋白内含子和剪接增强子的三种组成型元件的复合序列，其在本文中称为“三重增强子序列”。示例性的三重增强子序列的核苷酸序列示于SEQ ID NO:8。另一示例性增强子序列为SEQ ID NO:15所示的ApoAI基因片段。

在一些实施方案中，载体包含编码信号肽序列的多核苷酸序列。优选地，编码信号肽序列的多核苷酸序列位于编码HBV抗原的多核苷酸序列的上游。信号肽通常指导蛋白的定位，促进蛋白从其产生的细胞分泌，和/或改善抗原表达和交叉提呈至抗原提呈细胞。信号肽，当从载体表达时，可以存在于HBV抗原的N末端，但被信号肽酶切割，例如当从细胞分泌时。切割了信号肽的表达的蛋白通常称为“成熟蛋白”。根据本公开，可以使用本领域已知的任何信号肽。例如，信号肽可以是cystatin S信号肽；免疫球蛋白(Ig)分泌信号，如Ig重链γ信号肽SPIgG或Ig重链ε信号肽SPIgE。

在本申请的优选实施方案中，信号肽序列为cystatin S信号肽。cystatin S信号肽的示例性核酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:5和6。免疫球蛋白分泌信号的示例性核酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:10和27以及SEQ ID NO:11。

诸如DNA质粒的载体还可以包含细菌复制起点和抗生素抗性表达盒以用于在诸如大肠杆菌(E.coli.)的细菌细胞中选择和维持质粒。细菌复制起点和抗生素抗性盒可以在载体中位于编码HBV抗原的表达盒的相同方向或相反(逆向)方向。复制起点(ORI)是起始复制的序列，其使得质粒在细胞中复制和幸存。适合用于本申请的ORI的实例包括但不限于ColE1、pMB1、pUC、pSC101、R6K和15A，优选pUC。pUC ORI的示例性核苷酸序列示于SEQ IDNO:21。

用于在细菌细胞中选择和维持的表达盒通常包含可操作地连接至抗生素抗性基因的启动子序列。优选地，可操作地连接至抗生素抗性基因的启动子序列不同于可操作地连接至编码所关注蛋白(如HBV抗原)的多核苷酸序列的启动子序列。抗生素抗性基因可以是密码子优化的，并且抗生素抗性基因的序列组成通常调整为诸如大肠杆菌的细菌密码子使用。根据本公开可以使用本领域技术人员已知的任何抗生素抗性基因，包括但不限于卡那霉素抗性基因(Kan^r)、氨苄青霉素抗性基因(Amp^r)和四环素抗性基因(Tet^r)，以及赋予对氯霉素、博来霉素(bleomycin)、壮观霉素(spectinomycin)、羧苄青霉素等的抗性的基因。

在本申请的另一具体实施方案中，载体为病毒载体，优选腺病毒载体，其包含表达盒，所述表达盒包含多核苷酸，其编码选自HBV pol抗原和截短的HBV核心抗原的至少一种HBV抗原，所述HBV pol抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ IDNO:4至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；上游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，从5’端至3’端包含，启动子序列(优选SEQ ID NO:7的CMV-IE启动子序列)、增强子序列(优选SEQ ID NO:8的三重增强子序列或SEQ ID NO:15的ApoA1增强子序列)和编码信号肽序列(优选具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的cystatin S信号或具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的免疫球蛋白分泌信号)的多核苷酸序列；以及下游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，包含多腺苷酸化信号(优选SEQ ID NO:16的SV40多腺苷酸化信号或SEQ ID NO:9的bGH多腺苷酸化信号)。

在本申请的另一具体实施方案中，载体为病毒载体，优选MVA载体，其包含表达盒，所述表达盒包含多核苷酸，其编码选自HBV pol抗原和截短的HBV核心抗原的至少一种HBV抗原，所述HBV pol抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ IDNO:4至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；上游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，从5’端至3’端包含，启动子序列(优选SEQ ID NO:25的PrMVA13.5长启动子序列或SEQ ID NO:26的PrHyb启动子序列)和编码信号肽序列(优选具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的cystatin S信号或具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的免疫球蛋白分泌信号)的多核苷酸序列；以及下游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，包含多腺苷酸化信号或早期终止信号，其中所述早期终止信号具有SEQ ID NO:28的核苷酸序列或者其中所述多腺苷酸化信号选自具有SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的SV40多腺苷酸化信号或具有SEQ ID NO:9的多核苷酸序列的bGH多腺苷酸化信号，优选地，可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸的下游序列为具有SEQ ID NO:28的核苷酸序列的早期终止信号。

在本申请的一实施方案中，诸如病毒载体的载体编码HBV Pol抗原，其具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列。优选地，载体包含HBV Pol抗原的编码序列，其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3 100％相同。

在本申请的一实施方案中，诸如病毒载体的载体编码截短的HBV核心抗原，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。优选地，载体包含截短的HBV核心抗原的编码序列，其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1100％相同。

在本申请更另外的一实施方案中，诸如病毒载体的载体编码融合蛋白，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HBV Pol抗原和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的截短的HBV核心抗原。优选地，载体包含融合蛋白的编码序列，其包含截短的HBV核心抗原的编码序列，其可操作地连接至HBV Pol抗原的编码序列，所述截短的HBV核心抗原的编码序列与SEQID NO:1至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1 98％、99％或100％相同，所述HBV Pol抗原的编码序列与SEQ ID NO:3至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3 98％、99％或100％相同。优选地，截短的HBV核心抗原的编码序列通过接头的编码序列可操作地连接至HBV Pol抗原的编码序列，所述接头的编码序列与SEQ IDNO:14至少90％相同，例如与SEQ ID NO:14 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:14 98％、99％或100％相同。在本申请的具体实施方案中，载体包含融合蛋白的编码序列，其具有SEQ ID NO:1，其可操作地连接至SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:14进一步可操作地连接至SEQ ID NO:3。

本申请的编码HBV抗原的多核苷酸和表达载体可以根据本公开由本领域任何已知的方法制备。例如，利用标准分子生物学技术，可以将编码HBV抗原的多核苷酸导入或“克隆”入表达载体，所述标准分子生物学技术例如聚合酶链式反应(PCR)等，这是本领域技术人员熟知的。

腺病毒

在一方面，本申请提供一种重组腺病毒，其包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码抗原性HBV核心抗原。在另一方面，本申请提供一种腺病毒，其包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码抗原性HBV pol抗原。在另一方面，本申请提供一种重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包含第一异源核苷酸序列，其编码抗原性HBV核心抗原；以及第二异源核苷酸序列，其编码抗原性HBV pol抗原。在另一方面，本申请提供一种重组腺病毒，其包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码抗原性HBV核心-HBV pol融合蛋白。

本申请的腺病毒属于腺病毒(Adenoviridae)科，并且优选为属于哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)属的腺病毒。其可以是人腺病毒，但是也可以是感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(如，牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(如，CAdV2)、猪腺病毒(如，PAdV3或5)、猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，腺病毒为人腺病毒(HAdV或AdHu；在本申请中，如果提及Ad而不指定物种，则表示人腺病毒，例如简写“Ad5”表示与HAdV5相同，其为人腺病毒血清型5)，或猿猴腺病毒，如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)。

利用人腺病毒已经进行了大多数先进的研究，并且根据本申请的某些方面，人腺病毒是优选的。在某些优选实施方案中，本申请的重组腺病毒基于人腺病毒。在优选的实施方案中，重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。根据本申请特别优选的实施方案，腺病毒为血清型26或35之一的人腺病毒。

这些血清型的优势是在人群中较低的血清阳性率和/或较低的预存中和抗体效价。rAd26载体的制备描述于，例如WO 2007/104792和Abbink et al.,(2007)Virol 81(9):4654-63，这两者都整体援引加入本文。Ad26的示例性基因组序列可见GenBank登录号EF153474和WO2007/104792(参见，例如SEQ ID NO:1)。rAd35载体的制备描述于，例如美国专利号7,270,811、WO00/70071以及Vogels et al.,(2003)J Virol 77(15):8263-71，其整体援引加入本文。Ad35的示例性基因组序列可见GenBank登录号AC_000019和WO00/70071(参见，例如图6)。

猿猴腺病毒通常具有人群中较低的血清阳性率和/或较低的预存中和抗体效价，并且已经报道使用黑猩猩腺病毒载体的大量工作(例如，US6083716；WO2005/071093；WO2010/086189；WO 2010085984；Farina et al,2001,J Virol 75:11603-13；Cohen et al,2002,J Gen Virol 83:151-55；Kobinger et al,2006,Virology 346:394-401；Tatsis etal.,2007,Molecular Therapy 15:608-17；还参见Bangari和Mittal的综述,2006,Vaccine24:849-62；以及Lasaro和Ertl的综述,2009,Mol Ther 17:1333-39)。因此，在其他的优选实施方案中，本申请的重组腺病毒基于猿猴腺病毒，例如，黑猩猩腺病毒。在本申请的一实施方案中，重组腺病毒基于：1、3、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50型或SA7P猿猴腺病毒。

腺病毒载体rAd26和rAd35

在本申请的一优选实施方案中，腺病毒载体包含来自两种罕见血清型Ad26和Ad35的衣壳蛋白。在典型的实施方案中，载体为rAd26或rAd35病毒。

因此，可以用于本申请的载体包含Ad26或Ad35衣壳蛋白(例如，纤维蛋白、五邻体蛋白或六邻体蛋白)。本领域技术人员会了解，不需要在本申请的载体中使用完整的Ad26或Ad35衣壳蛋白。因此，包含Ad26或Ad35衣壳蛋白的至少一部分的嵌合衣壳蛋白可以用于本申请的载体中。本申请的载体还可以包含衣壳蛋白，其中纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白各自源自不同的血清型，只要至少一种衣壳蛋白源自Ad26或Ad35。在优选的实施方案中，纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白各自源自Ad26或各自源自Ad35。

本领域技术人员应当了解，源自多种血清型的元件可以组合在单一的重组腺病毒载体中。因此，可以制备嵌合腺病毒，其组合来自不同血清型的期望性质。因此，在一些实施方案中，本申请的嵌合腺病毒可以组合Ad26和Ad35血清型的无预存免疫性与诸如以下的特征：温度稳定性、组装、锚定、产量、重定向或改善的感染、DNA在靶细胞中的稳定性等。

在本申请的一实施方案中，用于本申请的重组腺病毒载体主要或完全源自Ad35或Ad26(即，载体为rAd35或rAd26)。在一些实施方案中，腺病毒为复制缺陷型的，例如，由于其在基因组的E1区中包含缺失。对于本申请的源自Ad26或Ad35的腺病毒，通常将腺病毒的E4-orf6编码序列换为人亚组C的腺病毒(如Ad5)的E4-orf6。这使得这类腺病毒在公知的表达Ad5的E1基因的互补细胞系中繁殖，例如293细胞、PER.C6细胞等(参见，例如Havenga etal,2006,J Gen Virol 87:2135-43；WO 03/104467)。在本申请的一实施方案中，腺病毒为血清型35的人腺病毒，其在克隆有编码抗原的核酸的E1区中有缺失，并且具有Ad5的E4orf6区。在本申请的一实施方案中，腺病毒为血清型26的人腺病毒，其在克隆有编码抗原的核酸的E1区中有缺失，并且具有Ad5的E4 orf6区。对于Ad35腺病毒，通常保留腺病毒中E1B55K开放阅读框的3’端，例如pIX开放阅读框直接上游的166bp或者包含其的片段，例如pIX起始密码子直接上游的243bp的片段，在5’端用Bsu36I限制性酶切位点标记，因为这会增加腺病毒的稳定性，因为pIX基因的启动子部分地位于这个区域(参见，例如Havenga et al,2006,supra；WO 2004/001032)。

重组腺病毒载体的制备是本领域公知的。rAd26载体的制备描述于，例如WO 2007/104792和Abbink et al.,(2007)Virol 81(9):4654-63。Ad26的示例性基因组序列可见GenBank登录号EF 153474和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1。rAd35载体的制备描述于，例如美国专利号7,270,811和Vogels et al.,(2003)J Virol 77(15):8263-71。Ad35的示例性基因组序列可见GenBank登录号AC_000019。

在本申请的一实施方案中，用于本申请的载体包括描述于WO2012/082918的那些，其公开整体援引加入本文。

通常，用于本申请的载体利用核酸来制备，所述核酸包含完全的重组腺病毒基因组(例如，质粒、粘粒或杆状病毒载体)。因此，本申请还提供分离的核酸分子，其编码本申请的腺病毒载体。本申请的核酸分子可以为通过克隆获得或合成制备的RNA形式或DNA形式。DNA可以是双链或单链的。

用于本申请的腺病毒载体通常是复制缺陷的。在这些实施方案中，通过删除或灭火对于病毒复制关键的区域，如E1区，使病毒复制缺陷。所述区域可以通过，例如***所关注的基因(通常连接至启动子)基本上缺失或灭活。在一些实施方案中，本申请的载体可以在其他区域(例如E2、E3或E4区)中含有缺失或含有连接至启动子的异源基因的***。对于E2-和/或E4-突变的腺病毒，通常使用E2-和/或E4-互补细胞系来产生重组腺病毒。腺病毒的E3区中的突变无需由细胞系补充，因为E3不是复制所需的。

包装细胞系通常用于制备足量的本申请的腺病毒载体。包装细胞是这样的细胞，其包含复制缺陷载体中已经缺失或灭活的基因，从而使得病毒在细胞中复制。合适的细胞系包括，例如PER.C6、911、293和E1 A549。

如上文所述，在载体中可以表达多种乙型肝炎病毒(HBV)抗原(例如HBV核心和HBV聚合酶抗原)。若需要，编码HBV抗原的异源基因可以进行密码子优化，以确保在治疗的宿主(如，人)中的正确表达。密码子优化是本领域广泛使用的技术。通常，将异源基因克隆入腺病毒基因的E1和/或E3区。

异源乙型肝炎病毒基因可以在腺病毒衍生的启动子(例如，主要晚期启动子)的控制下(即，可操作地连接)，或者可以在异源启动子的控制下。合适的异源启动子的实例包括CMV启动子和RSV启动子。优选地，启动子位于表达盒中所关注的异源基因的上游。

MVA载体

用于本申请的MVA载体使用源自改良型痘苗病毒安卡拉病毒的减毒病毒。MVA载体表达多种HBV抗原(例如，HBV核心和HBV聚合酶抗原)。在一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码抗原性HBV核心抗原。在另一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码抗原性HBVpol抗原。在一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含第一异源核苷酸序列和第二异源核苷酸序列，所述第一异源核苷酸序列编码抗原性HBV核心抗原，所述第二异源核苷酸序列编码抗原性HBV pol抗原。在另一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码抗原性HBV核心-HBV pol融合蛋白。

改良型痘苗病毒安卡拉(“MVA”)

人造的减毒改良型痘苗病毒安卡拉(“MVA”)通过痘苗病毒(CVA)的安卡拉(Ankara)株在鸡胚成纤维细胞中516次连续传代而产生(参见综述Mayr,A.,etal.Infection 3,6-14(1975))。由于这些长期传代，所得的MVA病毒的基因组具有其基因组序列约31k碱基的缺失，因此描述为对于在禽类细胞中复制是高度宿主细胞限制的(Meyer,H.et al.,J.Gen.Virol.72,1031-1038(1991))。据证实，与具有完全复制能力的起始原料相比，在各种动物模型中，所得的MVA是明显无毒的(Mayr,A.&Danner,K.,Dev.Biol.Stand.41:225-34(1978))。

用于本申请的实践中的MVA病毒可以包括但不限于MVA-572(1994年1月27日，作为ECACC V94012707保藏)；MVA-575(2000年12月7日，作为ECACC V00120707保藏)，MVA-I721(Suter et al.,Vaccine 2009中引用)和ACAM3000(2003年3月27日，作为PTA-5095保藏)。

更优选地，根据本申请使用的MVA包括MVA-BN和MVA-BN的衍生物。MVA-BN已经描述于PCT国际公布WO 02/042480。MVA-BN的“衍生物”指这样的病毒，如本文所述，其表现出与MVA-BN基本上相同的复制特征，但在其基因组的一个或多个部分表现出差异。

MVA-BN及其衍生物是无复制能力的(replication incompetent)，表示无法在体内和体外繁殖复制。更具体地，在体外，MVA-BN或其衍生物已经描述为能够在鸡胚成纤维细胞(CEF)中繁殖复制，但是在以下细胞系中不能繁殖复制：人角质细胞系HaCat(Boukamp etal(1988),J.Cell Biol.106:761-771)、人骨骨肉瘤细胞系143B(ECACC保藏号91112502)、人胚肾细胞系293(ECACC保藏号85120602)和人***细胞系HeLa(ATCC保藏号CCL-2)。此外，在Hela细胞和HaCaT细胞系中，MVA-BN或其衍生物的病毒扩增率比MVA-575低至少2倍，更优选低3倍。MVA-BN及其衍生物的这些性质的测试和测定描述于WO 02/42480(美国专利申请号2003/0206926)和WO 03/048184(美国专利申请号2006/0159699)。

如前几段所述，术语在体外人细胞系中“不能繁殖复制”或“无繁殖复制能力”例如描述于WO 02/42480，其还教导如何获得具有上文所述的期望性质的MVA。该术语适用于这样的病毒，使用WO 02/42480或美国专利号6,761,893中描述的测定，在感染4天后时，体外病毒扩增率小于1。

如前几段所述，术语“未能繁殖复制”指这样的病毒，在感染后第4天时，体外人细胞系中的病毒扩增率小于1。WO 02/42480或美国专利号6,761,893中描述的测定可用于确定病毒扩增率。

如前几段所述，病毒在体外人细胞系中的扩增或复制通常表示为，从受感染细胞产生的病毒(输出)与最初首先用于感染细胞的病毒的量(输入)的比率，称为“扩增率”。扩增率“1”定义了这样的扩增状态，其中从受感染细胞产生的病毒量与最初用于感染细胞的量相同，这意味着受感染细胞允许病毒感染和繁殖。相比之下，小于1的扩增率，即与输入水平相比，输出降低，表明缺乏繁殖复制，因此病毒减弱。

基于MVA的疫苗的优势包括它们的安全性特征谱以及大规模生产疫苗的可用性。临床前测试表明，与其他MVA菌株相比，MVA-BN表现出优异的减毒和效力(WO02/42480)。MVA-BN菌株的另一个性质是，与DNA-初免/痘苗病毒加强方案相比，能够在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中诱导基本相同水平的免疫。

重组MVA-BN病毒，本文中最优选的实施方案，被认为是安全的，因为它们在哺乳动物细胞中具有明显的复制缺陷和具有公认的无毒性。此外，除了其效力之外，工业规模制造的可行性也是有益的。另外，基于MVA的疫苗可以递送多种异源抗原，并允许同时诱导体液和细胞免疫。

用于本申请的MVA载体可以利用本领域已知的方法制备，例如WO/2002/042480和WO/2002/24224中描述的那些，其相关公开援引加入本文。

在本申请的优选实施方案中，MVA载体包含核酸，其编码选自以下的一种或多种抗原性蛋白：HBV核心抗原、HBV pol抗原和HBV核心-HBV pol融合抗原。

HBV抗原蛋白可以***MVA的一个或多个基因间区(IGR)。在本申请的一实施方案中，IGR选自IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137和IGR 148/149。在本申请的一实施方案中，重组MVA的5、4、3或2个以下的IGR包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码HBV核心抗原和/或HBV pol抗原的抗原决定簇。异源核苷酸序列可以，额外或替代地，***一个或多个天然存在的缺失位点中，特别是***MVA基因组的主要缺失位点I、II、III、IV、V或VI。在本申请的一实施方案中，重组MVA的5、4、3或2个以下的天然存在的缺失位点包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码HBV核心抗原和/或HBV pol抗原的抗原决定簇。

MVA的***位点的数目可以是1、2、3、4、5、6、7个或更多个，所述MVA包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码HBV蛋白的抗原决定簇。在本申请的一实施方案中，异源核苷酸序列***到4、3、2、或更少个***位点。优选地，使用2个***位点。在本申请的一实施方案中，使用3个***位点。优选地，重组MVA包含***2或3个***位点的至少2、3、4、5、6或7个基因。

本文提供的重组MVA病毒可以利用本领域已知的常规方法产生。获得重组痘病毒或将外源编码序列***痘病毒基因组的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，用于标准分子生物学技术的方法如DNA克隆、DNA和RNA分离、蛋白印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术描述于Molecular Cloning,A laboratory Manual(2nd Ed.)(J.Sambrook et al.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))，并且处理和操纵病毒的技术描述于VirologyMethods Manual(B.W.J.Mahy et al.(eds.),Academic Press(1996))。类似地，MVA的处理、操纵和基因工程的技术和专门技能描述于Molecular Virology:A PracticalApproach(A.J.Davison&R.M.Elliott(Eds.),The Practical Approach Series,IRLPress at Oxford University Press,Oxford,UK(1993)(参见，例如，Chapter 9:Expression of genes by Vaccinia virus vectors))和Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Son,Inc.(1998)(参见，例如，Chapter 16,Section IV:Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector))。

可以使用不同的方法产生本文公开的各种重组MVA。要***病毒的DNA序列可以置于大肠杆菌(E.coli)质粒构建体中，向其中已经***与MVA的一部分DNA同源的DNA。分别地，要***的DNA序列可以与启动子连接。启动子-基因连接可以置于质粒构建体中，从而所述启动子-基因连接在两端都有与含有非必需基因座的MVA DNA区域侧翼的DNA序列同源的DNA。所得的质粒构建体可以通过在大肠杆菌扩繁而扩增并分离。包含要***的DNA基因序列的分离的质粒可以转染入细胞培养物，例如鸡胚成纤维细胞(CEF)的细胞培养物，所述培养物同时用MVA感染。质粒中与病毒基因组中同源MVA DNA之间分别的重组可以产生通过外源DNA序列的存在修饰的MVA。

根据优选的实施方案，合适细胞培养物的细胞例如CEF细胞，可以用痘病毒感染。受感染的细胞可以随后用第一质粒载体转染，所述第一质粒载体包含外源或异源基因或多个基因，优选在痘病毒表达控制元件的转录控制下。如上文所揭示的，质粒载体还包含序列，其能够指导外源序列***痘病毒基因组的选定的部分。任选地，质粒载体还含有盒，其包含与痘病毒启动子可操作地连接的标记和/或选择基因。

合适的标记或选择基因有，例如编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、新霉素-磷酸核糖转移酶(neomycin-phosphoribosyltransferase)或其他标记的基因。选择盒或标记盒的使用简化产生的重组痘病毒的鉴定和分离。然而，重组痘病毒也可以通过PCR技术来鉴定。随后，进一步的细胞可以用如上文所述获得的重组痘病毒感染，并用第二载体转染，所述第二载体包含第二外源或异源基因或多种基因。在这种情况下，该基因应当引入痘病毒基因组的不同***位点，第二载体在痘病毒同源序列上也有不同，所述序列指导第二外源基因或多种基因整合入痘病毒基因组中。当发生同源重组后，可以分离包含两种或更多种外源或异源基因的重组病毒。对于将额外的外源基因引入重组病毒，通过使用先前感染步骤中分离的重组病毒，并且通过使用包含用于转染的其他外源基因或多种基因的其他载体，可以重复感染和转染步骤。

或者，上述感染和转染步骤是可互换的，即，合适的细胞可以首先用包含外源基因的质粒载体转染，然后用痘病毒感染。作为进一步的替代选择，还可以将外源基因各自引入不同的病毒，用所有获得的重组病毒共感染细胞，并筛选包含所有外源基因的重组子(recombinant)。第三种替代选择是在体外连接DNA基因组和外源序列，并使用辅助病毒重建重组的痘苗病毒DNA基因组。第四种替代选择是，在大肠杆菌或其他细菌物种中，克隆为细菌人工染色体(BAC)的痘苗病毒基因组(例如MVA)与线性外源序列(其侧翼有与整合到痘苗病毒基因组中的期望位点侧翼的序列同源的DNA序列)之间的同源重组。

异源HBV基因(例如，HBV核心抗原、HBV pol抗原和/或HBV核心-HBV-pol融合蛋白)可以在一种或多种痘病毒启动子的控制下(即，可操作地连接)。在本申请的一实施方案中，痘病毒启动子为Pr7.5启动子、杂合早期/晚期启动子或PrS启动子、PrS5E启动子、合成或天然早期或晚期启动子或者牛痘病毒ATI启动子。

组合物、免疫原性组合和疫苗

本申请还涉及组合物、免疫原性组合，更具体地，试剂盒和疫苗，其包含本申请的一种或多种HBV抗原、编码一种或多种HBV抗原的多核苷酸和/或载体。本文所述的任何本申请的HBV抗原、多核苷酸(包括RNA和DNA)和/或载体可以用于本申请的组合物、免疫原性组合或试剂盒和疫苗。

在一总的方面，本申请提供一种组合物，其包含分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其编码截短的HBV核心抗原或者HBV聚合酶抗原，所述截短的HBV核心抗原由与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列组成，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列；一种包含所述分离的或非天然存在的核酸分子的载体；和/或一种分离的或非天然存在的多肽，其由所述分离的或非天然存在的核酸分子编码。

在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同。

在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其编码HBV Pol抗原，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。

在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原；和分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。截短的HBV核心抗原和HBVpol抗原的编码序列可以存在于相同的分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)中，或者存在于两种不同的分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)中。

在本申请的一实施方案中，组合物包含病毒载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同。

在本申请的一实施方案中，组合物包含病毒载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码HBV pol抗原，所述HBV pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。

在本申请的一实施方案中，组合物包含病毒载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同；以及病毒载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码HBV pol抗原，所述HBV pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。包含截短的HBV核心抗原的编码序列的载体和包含HBV pol抗原的编码序列的载体可以是相同的载体或者两种不同的载体。

在本申请的一实施方案中，组合物包含病毒载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含截短的HBV核心抗原，其可操作地连接至HBV pol抗原，或者反之亦然，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。优选地，融合蛋白还包含接头，其可操作地将截短的HBV核心抗原连接至HBV Pol抗原，或者反之亦然。优选地，接头具有(AlaGly)_n的氨基酸序列，其中n为2-5的整数。

在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的截短的HBV核心抗原，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ IDNO:2 100％相同。

在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的HBV Pol抗原，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。

在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的截短的HBV核心抗原和分离的或非天然存在的HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同，所述HBV pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4100％相同。

在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的融合蛋白，所述融合蛋白包含截短的HBV核心抗原，其可操作地连接至HBV Pol抗原，或者反之亦然，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。优选地，融合蛋白还包含接头，其可操作地将截短的HBV核心抗原连接至HBV Pol抗原，或者反之亦然。优选地，接头具有(AlaGly)_n的氨基酸序列，其中n为2-5的整数。

在另一总的方面，本申请还涉及一种免疫原性组合或试剂盒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸表达本申请的实施方案的截短的HBV核心抗原和HBV pol抗原。本文所述的编码本申请的HBV核心和pol抗原的任何多核苷酸和/或载体可以用于本申请的免疫原性组合或试剂盒。

根据本申请的实施方案，疫苗组合或试剂盒中的多核苷酸可以是连接的或者分离的，从而从这类多核苷酸表达的HBV抗原融合在一起或者作为分别的蛋白产生，不论从相同或不同的多核苷酸中表达。在一实施方案中，第一和第二多核苷酸存在于分别的病毒载体中，在相同或分别的组合物中联合使用，从而表达的蛋白也是分别的蛋白，但是联合使用。在另一实施方案中，第一和第二多核苷酸编码的HBV抗原可以从相同的病毒载体表达，从而产生HBV核心-pol融合抗原。任选地，核心和pol抗原可以通过短接头连接或融合在一起。或者，第一和第二多核苷酸编码的HBV抗原可以利用核心和pol抗原编码序列之间的核糖体滑动位点(ribosomal slippage site)(又称为顺式水解酶位点)独立地从单一载体表达。这种策略获得双顺反子表达载体，其中单独的核心和pol抗原从单一的mRNA转录物产生。从这样的双顺反子表达载体产生的核心和pol抗原可以具有额外的N或C末端残基，取决于mRNA转录物上编码序列的排序。可以用于这一目的的核糖体滑动位点的实例包括但不限于来自***病毒(FMDV)的FA2滑动位点。另一种可能性是第一和第二多核苷酸编码的HBV抗原可以独立地从两种分别的载体表达，一种编码HBV核心抗原，而另一种编码HBV pol抗原。

在一优选的实施方案中，第一和第二多核苷酸存在于分别的病毒载体中。优选地，分别的载体存在于相同的组合物中。

在本申请的一具体实施方案中，免疫原性组合或试剂盒包含第一载体和第二载体，所述第一载体优选为DNA质粒或病毒载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同，所述第二载体优选为DNA质粒或病毒载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少98％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。

在本申请的一具体实施方案中，第一载体为第一DNA质粒，并且第二载体为第二DNA质粒。第一和第二DNA质粒各自包含复制起点，优选SEQ ID NO:21的pUC ORI，和抗生素抗性盒，优选包含密码子优化的Kan^r(卡那霉素抗性)基因，其具有与SEQ ID NO:22至少90％相同的多核苷酸序列，优选在bla启动子的控制下，例如SEQ ID NO:24所示的bla启动子。第一和第二DNA质粒各自独立地还包含启动子序列、增强子序列和编码信号肽序列的多核苷酸序列中的至少一个，可操作地连接至第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列。优选地，第一和第二DNA质粒各自包含上游序列，其可操作地连接至第一多核苷酸或第二多核苷酸，其中所述上游序列从5’端至3’端包含，SEQ ID NO:7的启动子序列、SEQ ID NO:8的增强子序列以及编码信号肽序列的多核苷酸序列，所述信号肽序列具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。第一和第二DNA质粒各自还可以包含位于HBV抗原的编码序列下游的多腺苷酸化信号，例如SEQ ID NO:9的bGH多腺苷酸化信号。

在本申请的一具体实施方案中，第一载体为第一病毒载体，并且第二载体为第二病毒载体。优选地，第一和第二病毒载体各自为腺病毒载体，更优选Ad26或Ad35载体，其包含表达盒，所述表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸编码本申请的HBV pol抗原或截短的HBV核心抗原；上游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，从5’端至3’端包含，启动子序列(优选SEQ ID NO:7的CMV启动子序列)、增强子序列(优选SEQ ID NO:15的ApoAI基因片段序列或SEQ ID NO:8的三重增强子序列)和多核苷酸序列，其编码信号肽序列(优选具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的cystatin S信号或具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的免疫球蛋白分泌信号)；以及下游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，包含多腺苷酸化信号(优选SEQ ID NO:16的SV40多腺苷酸化信号)。

在本申请的一具体实施方案中，第一载体为第一病毒载体，并且第二载体为第二病毒载体。优选地，第一和第二病毒载体各自为MVA载体，其包含表达盒，所述表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸编码本申请的HBV pol抗原或截短的HBV核心抗原；上游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，从5’端至3’端包含，启动子序列(优选SEQ ID NO:25的PrMVA13.5长启动子序列或SEQ ID NO:26的PrHyb启动子序列)和多核苷酸序列，其编码信号肽序列(优选具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的cystatin S信号或具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的免疫球蛋白分泌信号)；以及下游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，包含多腺苷酸化信号或早期终止信号(其中，所述早期终止信号具有SEQ ID NO:28的核苷酸序列，或者其中所述多腺苷酸化信号选自具有SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的SV40多腺苷酸化信号或具有SEQ ID NO:9的多核苷酸序列的bGH多腺苷酸化信号)，优选地，可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸的下游序列为具有SEQ ID NO:28的核苷酸序列的早期终止信号。

在本申请的一实施方案中，提供一种疫苗组合，其包含(a)第一组合物，所述第一组合物包含免疫学有效量的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；和(b)第二组合物，所述第二组合物包含免疫学有效量的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体，所述改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；其中向人受试者给药所述第一组合物以用于引发免疫应答，并且向人受试者给药所述第二组合物一次或多次以加强免疫应答。

在本申请的一实施方案中，提供一种疫苗组合物，其包含(a)第一组合物，所述第一组合物包含免疫学有效量的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体，所述改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；和(b)第二组合物，所述第二组合物包含免疫学有效量的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；其中向人受试者给药所述第一组合物以用于引发免疫应答，并且向人受试者给药所述第二组合物一次或多次以加强免疫应答。

在本申请的免疫原性组合包含第一病毒载体和第二病毒载体的那些实施方案中，所述第一载体和所述第二载体各自的量没有特别的限制。例如，第一病毒载体和第二病毒载体可以以按重量10:1-1:10的比例存在，例如按重量10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10的比例。优选地，第一病毒载体和第二病毒载体以按重量1:1的比例存在。

本申请的组合物和免疫原性组合可以包含额外的多核苷酸或载体，其编码额外的HBV抗原和/或额外的HBV抗原或其免疫原性片段。但是，在特定的实施方案中，本申请的组合物和免疫原性组合不包含某些抗原。

在一具体的实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合或试剂盒不包含HBsAg或编码HBsAg的多核苷酸序列。

在另一具体的实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合或试剂盒不包含HBVL蛋白或编码HBV L蛋白的多核苷酸序列。

在本申请的另一具体实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合不包含HBV包膜蛋白或编码HBV包膜蛋白的多核苷酸序列。

本申请的组合物和免疫原性组合还可以包含药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂为无毒的，并且不干扰活性成分的效力。药学上可接受的载剂可以包括一种或多种赋形剂，例如粘合剂、崩解剂、溶胀剂、助悬剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、风味剂、甜味剂、防腐剂、染料、增溶剂和包衣剂。载剂或其他材料的确切性质可以取决于给药途径，例如肌内、皮内、皮下、口服、静脉内、皮肤、粘膜内(例如肠)、鼻内或腹膜内途径。对于液体注射制剂，例如混悬剂和溶液剂，合适的载剂和添加剂包括水、二醇、油、醇、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂，例如散剂、胶囊剂、囊片、软胶囊剂和片剂，合适的载剂和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。对于鼻喷雾剂/吸入剂混合物，水溶液/悬浮液可以包含水、二醇、油、软化剂、稳定剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂、调味剂等作为合适的载剂和添加剂。

本申请的组合物和免疫原性组合可以配制成适合于向受试者给药的任何形式以促进给药和改善效力，包括但不限于口服(肠)给药和肠胃外注射。肠胃外注射包括静脉内注射或输注、皮下注射、皮内注射和肌内注射。本申请的组合物还可以配制为用于其他给药途径，包括经粘膜、眼、直肠、长效植入、舌下给药、舌下给药(under the tongue)、从口腔粘膜绕过门脉循环、吸入或鼻内给药。

在本申请的优选实施方案中，本申请的组合物和免疫原性组合配制为用于肠胃外注射，优选皮下、皮内注射或肌内注射、更优选肌内注射。

根据本申请的实施方案，用于给药的组合物和免疫原性组合通常包括在药学上可接受的载剂中的缓冲溶液，例如含水载剂，例如缓冲盐水等，如磷酸缓冲盐水(PBS)。组合物和免疫原性组合还可以包含近似生理条件所需的药物上可接受的物质，例如pH调节剂和缓冲剂。在一典型实施方案中，包含质粒DNA的本申请的组合物或免疫原性组合可以包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为药学上可接受的载剂。质粒DNA可以存在的浓度有，例如0.5mg/mL-5mg/mL、如0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL，优选1mg/mL。

可以根据本领域熟知的方法将本申请的组合物和免疫原性组合配制成疫苗(也称为“免疫原性组合物”)。这类组合物还可以包含佐剂以增强免疫应答。根据本公开，可以通过本领域技术人员熟知的技术来确定制剂中每种组分的最佳比例。

在本申请的一实施方案中，佐剂包含在本申请的组合物或免疫原性组合中，或者与本申请的组合物或免疫原性组合共给药。佐剂的使用是任选的，并且当组合物用于疫苗接种目的时可以进一步增强免疫应答。适合于与本申请的组合物共给药或包含于其中的佐剂应当优选是这样的佐剂，其在人中是潜在安全、良好耐受且有效的。佐剂可以是小分子或抗体，包括但不限于免疫检验点抑制剂(如抗PD1、抗RIM-3等)、toll样受体抑制剂、RIG-1抑制剂、IL-15超激动剂(Altor Bioscience)、突变体IRF3和IRF7基因佐剂、STING激动剂(Aduro)、FLT3L基因佐剂、IL-12基因佐剂和IL-7-hyFc。

本申请的实施方案还涉及制备本申请的组合物和免疫原性组合的方法。根据本申请的实施方案，制备组合物或免疫原性组合的方法包括将本申请的编码HBV抗原的分离的多核苷酸、载体和/或多肽与一种或多种药学上可接受的载剂混合。本领域技术人员会熟悉用于制备这类组合物的常规技术。

诱导免疫应答的方法

在另一总的方面，本申请还提供一种用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答的方法，其包括向所述受试者给药免疫有效量的本申请的组合物免或疫原性组合物。本文所述的任何组合物和免疫原性组合可以用于本申请的方法。

本申请提供一种利用MVA载体联合腺病毒载体，在人受试者中对HBV抗原性蛋白或其免疫原性多肽引发和加强免疫应答的改进方法。

根据本申请的一总的方面，在人受试者中增强免疫应答的方法包括：

a.向所述人受试者给药第一组合物，其包含免疫学有效量的本申请的腺病毒载体；和

b.向所述人受试者给药第二组合物，其包含免疫学有效量的本申请的MVA载体；

从而在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。

根据本申请的另一总的方面，在人受试者中增强免疫应答的方法包括：

a.向所述人受试者给药第一组合物，其包含免疫学有效量的本申请的MVA载体；和

b.向所述人受试者给药第二组合物，其包含免疫学有效量的本申请的腺病毒载体；

从而在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。

根据本申请的另一总的方面，在人受试者中增强免疫应答的方法包括：

a.向所述人受试者给药第一组合物，其包含免疫学有效量的第一质粒和免疫学有效量的第二质粒，所述第一质粒包含第一非天然存在的核酸，所述第一非天然存在的核酸包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码本申请的HBV pol抗原，所述第二质粒包含第二非天然存在的核酸，所述第二非天然存在的核酸包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码本申请的截短的HBV核心抗原；和

b.向所述人受试者给药第二组合物，其包含免疫学有效量的本申请的MVA载体；

从而在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。

根据本申请的另一总的方面，在人受试者中增强免疫应答的方法包括：

a.向所述人受试者给药第一组合物，其包含免疫学有效量的本申请的MVA载体；和

b.向所述人受试者给药第二组合物，其包含免疫学有效量的第一质粒和免疫学有效量的第二质粒，所述第一质粒包含第一非天然存在的核酸，所述第一非天然存在的核酸包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码本申请的HBV pol抗原，所述第二质粒包含第二非天然存在的核酸，所述第二非天然存在的核酸包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码本申请的截短的HBV核心抗原；

从而在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。

向有需要的人受试者给药第一组合物以引发免疫应答，而向有需要的人受试者给药第二组合物以加强免疫应答。引发和加强免疫应答可以例如，增强免疫应答。

根据本申请的实施方案，增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原性蛋白的增强的抗体应答。

优选地，增强的免疫应答还包括人受试者中针对HBV抗原性蛋白的增强的CD4+应答或增强的CD8+T细胞应答。根据本申请的实施方案的方法产生的增强的CD4+T细胞应答可以是例如，人受试者中，针对HBV抗原性蛋白的优势的CD4+T细胞应答的增加或诱导，和/或HBV抗原性蛋白特异性的多功能CD4+T细胞的增加或诱导。多功能CD4+T表达一种以上的细胞因子，例如IFN-γ、IL-2和TNF-α中的两种或更多种。根据本申请的实施方案的方法产生增强的CD8+T细胞应答可以是例如，人受试者中，HBV抗原性蛋白特异性的多功能CD8+T细胞的增加或诱导。

更优选地，由本申请的一实施方案产生的增强的免疫应答包括，人受试者中，针对HBV抗原性蛋白的增强的CD4+T细胞应答、增强的抗体应答和增强的CD8+T细胞应答。

如本文所用，术语“感染”指导致疾病的物质侵入宿主。如果导致疾病的物质能够侵入宿主，并在该宿主中复制或增殖，则认为其是“感染性”的。感染性物质的实例包括病毒，如HBV和某些腺病毒种、朊病毒、细菌、真菌、原生动物等。“HBV感染”具体地指宿主有机体，例如宿主有机体的细胞和组织被HBV侵入。

根据本申请的实施方案，“诱导免疫应答”，当对于本文所述的方法使用时，涵盖在有需要的受试者中引起针对HBV或HBV感染的期望的免疫应答或效果。“诱导免疫应答”还涵盖提供用于针对病原性物质(即HBV)进行治疗的治疗性免疫。如本文所用，术语“治疗性免疫”或“治疗性免疫应答”表示感染有HBV的疫苗接种的受试者能够控制针对其进行了疫苗接种的病原性物质(即HBV)的感染。在一实施方案中，“诱导免疫应答”表示在有需要的受试者中产生免疫，例如来提供针对疾病(例如HBV感染)的治疗效果。在本申请的一实施方案中，“诱导免疫应答”指引起或提高针对HBV的细胞免疫，例如T细胞应答。在本申请的一实施方案中，“诱导免疫应答”指引起或改善针对HBV的体液免疫应答。在本申请的一实施方案中，“诱导免疫应答”指引起或改善针对HBV的细胞和体液免疫应答。

通常，给药本申请的实施方案的组合物和免疫原性组合，在HBV感染或发展HBV感染的特征性症状后，会具有产生针对HBV的免疫应答的治疗目的，即用于治疗性疫苗接种。

如本文所用，“免疫原性有效量”或“免疫学有效量”表示组合物、多核苷酸、载体或抗原的量足以在有需要的受试者中诱导期望的免疫效果或免疫应答。在一实施方案中，免疫学有效量表示足以在有需要的受试者中诱导免疫应答的量。在另一实施方案中，免疫学有效量表示足以在有需要的受试者中产生免疫的量，例如提供针对疾病(例如HBV感染)的保护效果。免疫学有效量可以取决于各种因素而变化，例如受试者的身体状况、年龄、体重、健康等；特定的应用，如提供保护性免疫或治疗性免疫；以及特定的疾病，如病毒感染，免疫对于其是期望。免疫学有效量可以由本领域技术人员根据本公开容易地确定。

在本申请的具体实施方案中，免疫学有效量指组合物或免疫原性组合的量，其足以实现1、2、3、4种或更多种以下效果：(i)减少或改善HBV感染或与其相关的症状的严重性；(ii)减少HBV感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)防止HBV感染或与其相关的症状的进展；(iv)使得HBV感染或与其相关的症状消退；(v)防止HBV感染或与其相关的症状发展或发作；(vi)防止HBV感染或与其相关的症状复发；(vii)减少患有HBV感染的受试者的住院治疗；(viii)减少患有HBV感染的受试者的住院长度；(ix)提高患有HBV感染的受试者的存活；(x)消除受试者中的HBV感染；(xi)抑制或减少受试者中的HBV复制；和/或(xii)增强或改进另一疗法的预防或治疗效果。

在另一具体实施方案中，免疫学有效量还可以是这样的量，其足以与临床血清学转换的演变一致地降低HBsAg水平；实现与受试者的免疫系统的受感染肝细胞的减少相关的持续HBsAg清除；诱导HBV抗原特异性的活化的T细胞群体；和/或实现12个月内HBsAg的持续丧失。目标指数的示例包括低于500个拷贝的HBsAg IU阈值的较低的HBsAg和/或较高的CD8计数。

作为一般性指导，当对于病毒载体使用时，免疫学有效量可以为约1X10⁷病毒颗粒/剂量至约1X10¹²病毒颗粒/剂量。免疫学有效量可以为约1X10¹⁰、约2X10¹⁰、约3X10¹⁰、约4X10¹⁰、约5X10¹⁰、约6X10¹⁰、约7X10¹⁰、约8X10¹⁰、约9X10¹⁰、约1X10¹¹、约2X10¹¹、约3X10¹¹、约4X10¹¹、约5X10¹¹或约1X10¹²病毒颗粒/剂量。免疫学有效量可以来自一种载体或者来自多种载体。免疫学有效量可以在单一组合物或者多种组合物中给药，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种组合物(例如，片剂、胶囊剂或注射剂)，其中多种胶囊剂或注射剂的给药共同地为受试者提供免疫学有效量。在所谓的初免-加强方案中，还可以向受试者给药免疫学有效量，然后向相同的受试者给药另一剂量的免疫学有效量。初免-加强方案的一般概念是疫苗领域技术人员熟知的。按需要，还可以任选地向方案中加入进一步加强的给药。

根据本申请的实施方案，通过混合两种病毒载体(如编码HBV核心抗原的第一病毒载体和编码HBV pol抗原的第二病毒载体)并将混合物递送至单一的解剖学部位，可以向受试者给药免疫原性组合。或者可以进行两种分别的免疫接种，其各自递送单一的表达载体。在这类方案中，无论两种病毒载体在单一免疫接种中作为混合物或者在两个分别的免疫接种中给药，第一病毒载体和第二病毒载体可以以按重量10:1-1:10的比例给药，例如按重量10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。优选地，第一病毒载体和第二病毒载体以按重量1:1的比例给药。

在一些实施方案中，要根据本申请的方法治疗的受试者为感染有HBV的受试者，特别是患有慢性HBV感染的受试者。急性HBV感染的特征在于固有免疫系统的有效激活，补充有后续的广泛适应性反应(例如，HBV特异性T细胞，中和抗体)，其通常造成成功抑制复制或者去除受感染的肝细胞。相比之下，这类反应由于高病毒和抗原负荷而受损或减少，例如HBV包膜蛋白大量产生并且可以在1,000倍过量于感染性病毒的亚病毒颗粒中释放。

慢性HBV感染描述为阶段(phase)，特征在于病毒负荷、肝酶水平(坏死炎性(necroinflammatory)活性)、HBeAg或HBsAg负荷，或者这些抗原的抗体的存在。cccDNA水平保持相对恒定，约10-50个拷贝/细胞，虽然病毒血症可以变化很大。cccDNA物质的持续导致慢性。更具体地，慢性HBV感染的阶段包括(i)免疫耐受阶段，其特征在于高病毒负荷以及正常的或最小提升的肝酶；(ii)免疫激活HBeAg阳性阶段，其中观察到较低或下降水平的病毒复制，伴随有明显升高水平的肝酶；(iii)无活性HBsAg载体(carrier)阶段，这是低复制状态，具有血清中的低病毒负荷和正常的肝酶水平，其可能伴随HBeAg血清学转换；以及(iv)HBeAg阴性阶段，其中周期性地发生病毒复制(再激活)，伴有肝酶水平的波动，pre-core和/或基本核心(basal core)启动子中的突变是常见的，使得受感染的细胞不产生HBeAg。

如本文所用，“慢性HBV感染”指受试者具有HBV可检测的存在6个月以上。患有慢性HBV感染的受试者可以处于慢性HBV感染的任何阶段。在优选的实施方案中，本文所指的慢性HBV感染遵循疾病预防控制中心(CDC)发布的定义，根据该定义，慢性HBV感染可以由实验室标准来表征，(i)乙型肝炎核心抗原(IgM抗-HBc)的IgM抗体阴性，并且乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)或乙型肝炎病毒DNA的核酸测试阳性；或者(ii)HBsAg或HBV DNA的核酸测试阳性，或者HBeAg至少相隔6个月两次阳性。

根据具体的实施方案，免疫原性有效量指组合物或免疫原性组合的量，其足以治疗慢性HBV感染。

在一些实施方案中，患有慢性HBV感染的受试者正进行核苷类似物(NUC)治疗，并且是NUC抑制的。如本文所用，“NUC抑制”指受试者具有不可检测的HBV病毒水平和稳定的丙氨酸转氨酶(ALT)水平达至少6个月。核苷/核苷酸类似物治疗的实例包括HBV聚合酶抑制剂，例如恩替卡韦(entecavir)和替诺福韦(tenofovir)。优选地，患有慢性HBV感染的受试者不患有晚期肝纤维化或肝硬化。这样的受试者通常会具有3以下的METAVIR分数和9kPa以下的肝脏瞬时弹性硬度检查(fibroscan)结果。METAVIR分数为评分系统，其通常用于评价乙型肝炎的患者的肝活检中的组织病理学评价的炎症和纤维化的程度。该评分系统指定两个标准化数字，一个反映炎症程度，而另一个反映纤维化程度。

据信慢性HBV的消除或减少可能实现包括病毒诱导的肝硬化和肝细胞癌在内的严重肝病的早期疾病阻断。因此，本申请的方法还可以用作治疗HBV诱导的疾病的疗法。HBV诱导的疾病的实例包括但不限于肝硬化、癌症(如肝细胞癌)和纤维化，特别是特征在于3或更高METAVIR分数的晚期纤维化。在这类实施方案中，免疫原性有效量是这样的量，其足以实现12个月内HBsAg的持续丧失以及临床疾病(如肝硬化、肝细胞癌等)的明显减少。

本申请实施方案的方法还包括向有需要的受试者给药另一免疫原性剂(如另一HBV抗原或其他抗原)或另一抗HBV剂(如核苷类似物或其他抗HBV剂)，与本申请的组合物组合。

递送方法

根据本公开，可以通过本领域任何已知的方法将本申请的组合物和免疫原性组合向受试者给药，包括但不限于肠胃外给药(如肌内、皮下、静脉内或皮内注射)、口服给药、经皮给药和经鼻给药。优选地，组合物和免疫原性组合通过肠胃外给药(如通过肌内注射或皮内注射)或经皮给药。

在本申请的一些实施方案中，其中组合物或免疫原性组合包含一种或多种病毒载体，给药可以通过皮肤注射进行，例如肌内或皮内注射，优选肌内注射。肌内注射可与电穿孔结合，即施加电场以促进DNA质粒向细胞的递送。如本文所用，术语“电穿孔”指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观途径(孔)。在体内电穿孔过程中，将适当强度和持续时间的电场施加到细胞上，诱导细胞膜通透性增强的瞬态，从而使细胞能够吸收自行无法穿过细胞膜的分子。通过电穿孔产生这样的孔促进生物分子，如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物等从细胞膜的一侧通过到另一侧。体内电穿孔用于递送DNA疫苗已显示显著增加宿主细胞对质粒的吸收，同时还导致注射部位的轻度至中度炎症。因此，与常规注射相比，皮内或肌内电穿孔显著改善转染效率和免疫应答(例如分别高达1,000倍和100倍)。

在典型的实施方案中，将电穿孔与肌内注射结合。但是，也可以将电穿孔与其他形式的肠胃外给药相结合，例如皮内注射、皮下注射等。

可以使用电穿孔装置来完成通过电穿孔对本申请的组合物、免疫原性组合或疫苗的给药，所述电穿孔装置可以配置成将能量脉冲有效传递至哺乳动物期望的组织，以造成细胞膜内可逆孔的形成。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔组件可以包括电穿孔设备的以下组件中的一个或多个：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源和电源开关。可以使用体内电穿孔装置完成电穿孔。可以促进本申请的组合物和免疫原性组合递送的电穿孔装置和电穿孔方法，特别是包括DNA质粒那些，的实例包括

(InovioPharmaceuticals,Blue Bell,PA)、Elgen电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)Tri-Grid^TM递送系统(Ichor Medical Systems,Inc.,San Diego,CA92121)，以及以下中描述的那些：美国专利号7,664,545、美国专利号8,209,006、美国专利号9,452,285、美国专利号5,273,525、美国专利号6,110,161、美国专利号6,261,281、美国专利号6,958,060、和美国专利号6,939,862、美国专利号7,328,064、美国专利号6,041,252、美国专利号5,873,849、美国专利号6,278,895、美国专利号6,319,901、美国专利号6,912,417、美国专利号8,187,249、美国专利号9,364,664、美国专利号9,802,035、美国专利号6,117,660以及国际专利申请公布WO2017172838，其整体援引加入本文。本申请还涵盖用于递送本申请的组合物和免疫原性组合的脉冲电场的用途，例如如美国专利号6,697,669所描述，其整体援引加入本文。

在本申请的其他实施方案中，其中组合物或免疫原性组合包含一种或多种DNA质粒，给药方法是经皮给药。经皮给药可以与表皮皮肤磨损结合使用，以促进DNA质粒向细胞的递送。例如，皮肤病贴剂可以用于表皮皮肤磨损。在去除皮肤病学贴剂后，可以将组合物或免疫原性组合沉积在磨损的皮肤上。

递送方法不限于上述实施方案，并且可以使用用于细胞内递送的任何方式。本申请的方法考虑的其他细胞内递送方法包括但不限于脂质体包封、纳米颗粒等。

佐剂

在本申请的一些实施方案中，诱导针对HBV的免疫应答的方法还包括给药佐剂。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且定义为一种或多种引起免疫系统刺激的物质。在本文上下文中，佐剂用于增强对本申请的HBV抗原和抗原性HBV多肽的免疫应答。

根据本申请的实施方案，佐剂可以存在于本申请的免疫原性组合或组合物中，或者在分别的组合物中给药。佐剂可以是例如小分子或抗体。适合用于本申请的佐剂的实例包括但不限于免疫检验点抑制剂(如，抗-PD1、抗-RIM-3等)、toll样受体抑制剂、RIG-1抑制剂、IL-15超激动剂(Altor Bioscience)、突变体IRF3和IRF7基因佐剂、STING激动剂(Aduro)、FLT3L基因佐剂、IL-12基因佐剂和IL-7-hyFc。

本申请的组合物和免疫原性组合还可以与至少一种其他抗HBV剂联合给药。适合于与本申请一起使用的抗HBV剂的实例包括但不限于小分子、抗体和/或CAR-T疗法(其充当衣壳抑制剂)、TLR抑制剂、cccDNA抑制剂、HBV聚合酶抑制剂(如恩替卡韦和替诺福韦)和/或免疫检验点抑制剂等。这类抗HBV剂可以与本申请的组合物和免疫原性组合同时或顺序给药。

初免/加强免疫的方法

本申请的实施方案还考虑，在所谓的初免-加强方案中，向受试者给药免疫学有效量的组合物或免疫原性组合，然后向相同的受试者给药另一剂量的免疫学有效量的组合物或免疫原性组合。因此，在一实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合是用于引发(priming)免疫应答的初免疫苗。在另一实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合是用于加强(boosting)免疫应答的加强疫苗。本申请的实施方案的初免和加强疫苗可以用于本文所述的本申请的方法。初免-加强(prime-boost)方案的一般概念是疫苗领域技术人员熟知的。本文所述的本申请的任何组合物和免疫原性组合可以用作初免和/或加强疫苗，用于引发和/或加强针对HBV的免疫应答。

根据本申请的实施方案，可以给药本申请的组合物或免疫原性组合至少一次，以用于引发免疫。可以再给药组合物或免疫原性组合，以用于加强免疫。若需要，可以任选地在方案中加入进一步的加强给药组合物或疫苗组合。本申请的组合物中可以存在佐剂以用于加强免疫，存在于分别的组合物中，来与本申请的组合物或免疫原性组合一起给药以加强免疫，或者其自身作为加强免疫给药。在方案中包括佐剂的那些实施方案中，佐剂优选用于加强免疫。

初免-加强方案的示例性且非限制性的实例包括向受试者给药单一剂量的免疫学有效量的本申请的组合物或免疫原性组合以引发免疫应答，然后给药另一剂量的免疫学有效量的本申请的组合物或免疫原性组合以加强免疫应答，其中初次给药的引发免疫后约一至十二(1-12)周、约二至十二(2-12)周、约二至十(2-10)周、约二至六(2-6)周、优选约4周，首次给药加强免疫，优选地，初次给药的引发免疫后约8周首次给药加强免疫。在本申请的一实施方案中，引发免疫后至少1周给药加强免疫。在本申请的一实施方案中，在引发免疫后至少2周给药加强免疫。任选地，初次给药初免免疫后约10-14周、优选12周，给药进一步加强免疫的组合物或免疫原性组合或其他佐剂。

试剂盒

本申请还提供一种试剂盒，其包含本申请的免疫原性组合。试剂盒可以包含分别的组合物中的第一多核苷酸和第二多核苷酸，或者试剂盒可以包含单一组合物中的第一多核苷酸和第二多核苷酸。试剂盒还可以进一步包含一种或多种佐剂或免疫刺激剂和/或其他抗HBV剂。

在动物或人有机体内给药后诱导或刺激抗HBV免疫应答的能力可以使用本领域标准的各种测定法在体外或体内进行评估。对于评估免疫应答的出现和激活的可用技术的一般描述可以参见例如Coligan et al.(1992and 1994,Current Protocols inImmunology；ed.J Wiley&Sons Inc,National Institute of Health)。细胞免疫性的测量可以通过以下进行：测量活化的效应细胞分泌的细胞因子谱(profile)，包括源自CD4+和CD8+T细胞的那些(例如，通过ELISPOT定量产生IL-10或IFNγ的细胞)，确定免疫效应细胞的活化状态(例如，通过经典的[3H]胸苷吸收进行的T细胞增殖测定)，测定敏化的受试者中抗原特异性T淋巴细胞(如细胞毒性测定中的肽特异性裂解等)。

刺激细胞和/或体液应答的能力可以通过抗体结合和/或竞争性结合来确定(参见，例如Harlow,1989,Antibodies,Cold Spring Harbor Press)。例如，可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量响应于给药提供免疫原的组合物而产生的抗体的效价。免疫应答也可以通过中和抗体测定来测量，其中病毒的中和定义为通过特异性抗体对病毒的反应/抑制/中和而丧失的感染性。免疫应答还可以通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定来测量。

实施方案

本申请还提供以下非限制性实施方案。

实施方案1为一种改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体，其包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列。

实施方案2为实施方案1的MVA载体，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。

实施方案3为实施方案1或2的MVA载体，其中所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8T细胞应答。

实施方案4为实施方案1-3中任一项的MVA载体，其中所述HBV聚合酶抗原包含SEQID NO:4的氨基酸序列。

实施方案5为实施方案1-4中任一项的MVA载体，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原的信号序列。

实施方案6为实施方案5的MVA载体，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:11的氨基酸序列；优选地所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案7为实施方案1-6中任一项的MVA载体，其中所述第一多核苷酸序列与SEQID NO:3至少90％相同。

实施方案8为实施方案7的MVA载体，其中所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列。

实施方案9为实施方案1-8中任一项的MVA载体，其还包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

实施方案10为实施方案9的MVA载体，其中所述第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少90％相同。

实施方案11为实施方案10的MVA载体，其中所述第二多核苷酸序列包含SEQ IDNO:1的多核苷酸序列。

实施方案12为实施方案9-11中任一项的MVA载体，其中所述第二多核苷酸序列还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至截短的HBV核心抗原的信号序列。

实施方案13为实施方案12的MVA载体，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQID NO:11的氨基酸序列；优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案14为实施方案9-13中任一项的MVA载体，其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白包含可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。

实施方案15为实施方案14的MVA载体，其中所述融合蛋白包含通过接头可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。

实施方案16为实施方案15的MVA载体，其中所述接头包含(AlaGly)n的氨基酸序列，n为2-5的整数；优选地，所述接头由SEQ ID NO:14的多核苷酸序列编码。

实施方案17为实施方案16的MVA载体，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

实施方案18为实施方案14-17中任一项的MVA载体，其中所述融合蛋白还包含信号序列；优选地，所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；更优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案19为实施方案1-18中任一项的MVA载体，其还包含至少一个启动子序列，任选存在的一个或多个额外的调节序列；优选地，所述至少一个启动子序列包含SEQ IDNO:25和/或SEQ ID NO:26的多核苷酸序列，并且所述额外的调节序列选自SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的增强子序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:16的多腺苷酸化信号序列。

实施方案20为实施方案1-19中任一项的MVA载体，其中所述非天然存在的核酸分子不编码选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。

实施方案21为一种MVA载体，其包含第一非天然存在的核酸分子和第二非天然存在的核酸分子，所述第一非天然存在的核酸分子包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，其中所述第一多核苷酸序列还编码信号序列，所述信号序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且其中所述第一多核苷酸序列还包含启动子序列，所述启动子序列包含SEQ ID NO:26的多核苷酸序列；所述第二非天然存在的核酸分子包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，所述第二多核苷酸序列还编码信号序列，所述信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且其中所述第二多核苷酸序列还包含启动子序列，所述启动子序列包含SEQ ID NO:25的多核苷酸序列。

实施方案22为一种组合物，其包含实施方案1-21中任一项的MVA载体，以及药学上可接受的载剂。

实施方案23为一种在人受试者中增强免疫应答的方法，所述方法包括(a)向所述人受试者给药第一组合物，其包含免疫学有效量的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列；以及(b)向所述人受试者给药第二组合物，其包含免疫学有效量的实施方案1-21中任一项的MVA载体；以在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。

实施方案24为实施方案23的方法，其中所述第一组合物的HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。

实施方案25为实施方案23或24的方法，其中所述第一组合物用于引发免疫应答，而所述第二组合物用于加强免疫应答。

实施方案26为实施方案23-25中任一项的方法，所述第一组合物的HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

实施方案27为实施方案23-26中任一项的方法，其中所述第一组合物的HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施方案28为实施方案23-27中任一项的方法，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至所述第一组合物的HBV聚合酶抗原的信号序列。

实施方案29为实施方案28的方法，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:11的氨基酸序列；优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案30为实施方案23-29中任一项的方法，其中所述第一组合物的第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:19至少90％相同。

实施方案31为实施方案30的方法，其中所述第一组合物的第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列。

实施方案32为实施方案23-31中任一项的方法，其中所述第一组合物中的腺病毒的核酸分子还包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

实施方案33为实施方案32的方法，其中所述第一组合物的第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:17至少90％相同。

实施方案34为实施方案33的方法，其中所述第一组合物的第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列。

实施方案35为实施方案32-34中任一项的方法，其中所述第一组合物的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白包含可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。

实施方案36为实施方案35的方法，其中所述第一组合物的融合蛋白包含通过接头可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。

实施方案37为实施方案36的方法，其中所述第一组合物的接头包含(AlaGly)n的氨基酸序列，n为2-5的整数；优选地，所述接头由SEQ ID NO:14的多核苷酸序列编码。

实施方案38为实施方案37的方法，其中所述第一组合物的融合蛋白包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列。

实施方案39为实施方案35-38中任一项的方法，其中所述第一组合物的融合蛋白还包含信号序列；优选地，所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；更优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案40为实施方案23-39中任一项的方法，其中所述第一组合物的非天然存在的核酸分子还包含启动子序列，任选存在的一个或多个额外的调节序列；优选地，所述启动子序列包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列，并且所述额外的调节序列选自SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的增强子序列和SEQ ID NO:16的多腺苷酸化信号序列。

实施方案41为实施方案23-40中任一项的方法，其中所述第一组合物的非天然存在的核酸分子不编码选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。

实施方案42为实施方案23-41中任一项的方法，其中所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的增强的抗体应答。

实施方案43为实施方案42的方法，其中所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的增强的CD8+T细胞应答。

实施方案44为实施方案42或43的方法，所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的CD4+T细胞应答。

实施方案45为实施方案23-44中任一项的方法，其中所述腺病毒载体为rAd26或rAd35载体。

实施方案46为实施方案23-45中任一项的方法，其中在步骤(a)后1-12周进行步骤(b)。

实施方案47为实施方案23-45中任一项的方法，其中在步骤(a)后2-12周进行步骤(b)。

实施方案48为实施方案23-45中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少1周进行步骤(b)。

实施方案49为实施方案23-45中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少2周进行步骤(b)。

实施方案50为一种疫苗组合，其包含(a)第一组合物，其包含免疫学有效量的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列；以及(b)第二组合物，其包含免疫学有效量的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体，其包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列；其中向人受试者给药所述第一组合物以用于引发免疫应答，并且向人受试者给药所述第二组合物一次或多次以加强免疫应答。

实施方案51为实施方案50的疫苗组合，其中所述第一组合物和第二组合物的HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。

实施方案52为实施方案50或51的疫苗组合，其中述第一组合物和第二组合物的HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

实施方案53为实施方案50-52中任一项的疫苗组合，其中所述第一组合物和第二组合物的HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施方案54为实施方案50-53中任一项的疫苗组合，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至所述第一组合物和第二组合物的HBV聚合酶抗原的信号序列。

实施方案55为实施方案54的疫苗组合，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQID NO:11的氨基酸序列；优选地所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案56为实施方案50-55中任一项的疫苗组合，其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:3至少90％相同。

实施方案57为实施方案56的疫苗组合，其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列。

实施方案58为实施方案50-57中任一项的疫苗组合，其中所述第一组合物的腺病毒载体还包含第三多核苷酸序列，并且所述第二组合物的MVA载体还包含第四多核苷酸序列，其中所述第三多核苷酸序列和第四多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

实施方案59为实施方案58的疫苗组合，其中所述第三多核苷酸序列和第四多核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少90％相同。

实施方案60为实施方案59的疫苗组合，其中所述第三多核苷酸序列和第四多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。

实施方案61为一种疫苗组合，其包含(a)第一组合物，其包含免疫学有效量的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体，其包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列；以及(b)第二组合物，其包含免疫学有效量的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列；其中向人受试者给药所述第一组合物以引发免疫应答，并且向人受试者给药所述第二组合物一次或多次以加强免疫应答。

实施方案62为实施方案61的疫苗组合，其中所述第一组合物和第二组合物的HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。

实施方案63为实施方案61或62的疫苗组合，其中所述第一组合物和第二组合物的HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

实施方案64为实施方案61-63中任一项的疫苗组合，其中所述第一组合物和第二组合物的HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施方案65为实施方案61-64中任一项的疫苗组合，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至所述第一组合物和第二组合物的HBV聚合酶抗原的信号序列。

实施方案66为实施方案65的疫苗组合，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQID NO:11的氨基酸序列；优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案67为实施方案61-66中任一项的疫苗组合，其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:3至少90％相同。

实施方案68为实施方案67的疫苗组合，其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列。

实施方案69为实施方案61-68中任一项的疫苗组合，其中所述第一组合物的MVA载体还包含第三多核苷酸序列，并且所述第二组合物的腺病毒载体还包含第四多核苷酸序列，其中所述第三多核苷酸序列和第四多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

实施方案70为实施方案69的疫苗组合，其中所述第三多核苷酸序列和第四多核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少90％相同。

实施方案71为实施方案70的疫苗组合，其中所述第三多核苷酸序列和第四多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。

实施方案72为实施方案50-71中任一项的疫苗组合，其为试剂盒。

实施方案73为一种在人受试者中增强免疫应答的方法，所述方法包括(a)向所述人受试者给药第一组合物，其包含免疫学有效量的第一质粒和第二质粒，所述第一质粒包含第一非天然存在的核酸分子，所述第一非天然存在的核酸分子包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，所述第二质粒包含第二非天然存在的核酸分子，所述第二非天然存在的核酸分子包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；以及(b)向所述人受试者给药第二组合物，其包含免疫学有效量的实施方案1-21中任一项的MVA载体；以在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。

实施方案74为实施方案73的方法，其中所述第一组合物的HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。

实施方案75为实施方案73或74的方法，其中所述第一组合物用于引发免疫应答，而所述第二组合物用于加强免疫应答。

实施方案76为实施方案73-75中任一项的方法，其中所述第一组合物的HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

实施方案77为实施方案73-76中任一项的方法，其中所述第一组合物的HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施方案78为实施方案73-77中任一项的方法，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至所述第一组合物的HBV聚合酶抗原的信号序列。

实施方案79为实施方案78的方法，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:11的氨基酸序列；优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案80为实施方案73-79中任一项的方法，其中所述第一组合物的第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:20至少90％相同。

实施方案81为实施方案80的方法，其中所述第一组合物的第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:20的多核苷酸序列。

实施方案82为实施方案73-81中任一项的方法，其中所述第一组合物的第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:18至少90％相同。

实施方案83为实施方案82的方法，其中所述第一组合物的第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列。

实施方案84为实施方案73-83中任一项的方法，其中所述第一组合物的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列还包含启动子序列、任选存在的一个或多个额外的调节序列；优选地，所述启动子序列包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列，并且所述额外的调节序列选自SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的增强子序列和SEQ ID NO:16的多腺苷酸化信号序列。

实施方案85为实施方案73-84中任一项的方法，其中所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的增强的抗体应答。

实施方案86为实施方案85的方法，其中所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的增强的CD8+T细胞应答。

实施方案87为实施方案85或86的方法，所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的CD4+T细胞应答。

实施方案88为实施方案73-87中任一项的方法，其中在步骤(a)后1-12周进行步骤(b)。

实施方案89为实施方案73-87中任一项的方法，其中在步骤(a)后2-12周进行步骤(b)。

实施方案90为实施方案73-87中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少1周进行步骤(b)。

实施方案91为实施方案73-87中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少2周进行步骤(b)。

实施方案92为一种在人受试者中增强免疫应答的方法，所述方法包括(a)向所述人受试者给药第一组合物，所述第一组合物包含免疫学有效量的实施方案1-21中任一项的MVA载体；以及(b)向所述人受试者给药第二组合物，所述第二组合物包含免疫学有效量的第一质粒和第二质粒，所述第一质粒包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，所述第二质粒包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；以在所述人受试者中获得针对HBV抗原的增强的免疫应答。

实施方案93为实施方案92的方法，其中所述第二组合物的HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。

实施方案94为实施方案92或93的方法，其中所述第一组合物用于引发免疫应答，而所述第二组合物用于加强免疫应答。

实施方案95为实施方案92-94中任一项的方法，其中所述第二组合物的HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。

实施方案96为实施方案92-95中任一项的方法，其中所述第二组合物的HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施方案97为实施方案92-96中任一项的方法，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至所述第二组合物的HBV聚合酶抗原的信号序列。

实施方案98为实施方案97的方法，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:11的氨基酸序列；优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10的多核苷酸序列编码。

实施方案99为实施方案92-98中任一项的方法，其中所述第二组合物的第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:20至少90％相同。

实施方案100为实施方案99的方法，其中所述第二组合物的第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:20的多核苷酸序列。

实施方案101为实施方案92-100中任一项的方法，其中所述第二组合物的第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:18至少90％相同。

实施方案102为实施方案101的方法，其中所述第二组合物的第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列。

实施方案103为实施方案92-102中任一项的方法，其中所述第二组合物的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列还包含启动子序列、任选存在的一个或多个额外的调节序列；优选地，所述启动子序列包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列，并且所述额外的调节序列选自SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的增强子序列和SEQ ID NO:16的多腺苷酸化信号序列。

实施方案104为实施方案92-103中任一项的方法，其中所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的增强的抗体应答。

实施方案105为实施方案104的方法，其中所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的增强的CD8+T细胞应答。

实施方案106为实施方案104或105的方法，所述增强的免疫应答包括人受试者中针对HBV抗原的CD4+T细胞应答。

实施方案107为实施方案92-106中任一项的方法，其中在步骤(a)后1-12周进行步骤(b)。

实施方案108为实施方案92-106中任一项的方法，其中在步骤(a)后2-12周进行步骤(b)。

实施方案109为实施方案92-106中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少1周进行步骤(b)。

实施方案110为实施方案92-106中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少2周进行步骤(b)。

实施方案111为实施方案92-106中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少4周进行步骤(b)。

实施方案112为实施方案92-106中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少8周进行步骤(b)。

实施方案113为实施方案92-106中任一项的方法，其中在步骤(a)后至少12周进行步骤(b)。

实施例

本申请的以下实施例用于进一步说明本申请的性质。应当理解，以下实施例并不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。

实施例1：HBV核心和Pol抗原序列的产生

据认为肝炎核心蛋白上的T细胞表位对消除乙型肝炎感染很重要，并且乙型肝炎病毒蛋白(如聚合酶)可能有助于提高应答的广度。因此，选择乙型肝炎核心蛋白和聚合酶蛋白作为抗原，用于设计治疗性乙型肝炎病毒(HBV)疫苗。

HBV核心和聚合酶抗原共有序列的衍生

HBV pol和核心抗原共有序列基于HBV基因型B、C和D产生。从不同来源获得不同HBV序列，并分别对核心和聚合酶蛋白进行比对。随后将所有亚型(A-H)的原始序列比对限于HBV基因型B、C和D。为每种亚型分别和所有联合(joint)BCD序列中的每种蛋白进行比对来定义共有序列。在可变比对位置，共有序列中使用频率最高的氨基酸。

HBV核心抗原的优化

通过产生天然病毒蛋白中所含的两个缺失来优化HBV核心抗原共有序列。第一缺失为构成pre-core“锌指”部分的核心蛋白的N末端延伸的缺失，因为文献报道已经指出，病毒利用这一序列来诱导对受感染的个体中对病毒蛋白的耐受。第二缺失是对应于C末端高度带正电区段的34个氨基酸的缺失，其对于病毒生命循环中前基因组封装和生产性病毒正链DNA合成是必需的。

HBV Pol抗原的优化

通过改变4个残基以消除逆转录酶和RNAseH酶促活性来优化HBV pol抗原共有序列。具体地，将逆转录酶结构域的“YXDD”基序中的天冬氨酸残基(D)变为天冬酰胺残基(N)，以消除任何配位功能，从而消除核苷酸/金属离子结合。此外，在RNaseH结构域的“DEDD”基序中，将第一个天冬氨酸残基(D)变为天冬酰胺残基(N)，并且将第一个谷氨酸残基(E)变改为谷氨酰胺残基(A)，以消除Mg²⁺配位。此外，对HBV pol抗原的序列进行密码子优化，以扰乱包膜蛋白的内部开放阅读框，包括S蛋白以及具有N末端延伸的S蛋白pre-S1和pre-S2。结果，去除了包膜蛋白(pre-S1、pre-S2和S蛋白)和X蛋白的开放阅读框。

有效蛋白分泌的信号肽的选择

对HBV核心抗原的N末端框架内引入的3种不同信号肽进行评估：(1)Ig重链γ信号肽SPIgG(BAA75024.1)；(2)Ig重链ε信号肽SPIgE(AAB59424.1)；和(3)Cystatin S前体信号肽SPCS(NP_0018901.1)。使用Signal P预测程序在计算机上(in silico)优化信号肽切割位点以进行核心融合。通过分析上清中的核心蛋白水平来确定分泌效率。使用在N末端融合的3种不同信号肽进行核心抗原分泌的蛋白印迹分析表明，半Cystatin S信号肽造成最有效的蛋白分泌。

实施例2：表达融合的截短的HBV核心抗原和HBV Pol抗原的腺病毒载体的产生

腺病毒载体的创建为从单一的开放阅读框表达截短的HBV核心抗原和HBV pol抗原的融合蛋白。还可以设想用于表达两种蛋白(例如截短的HBV核心抗原和HBV pol抗原)的额外构型，例如，使用两个分别的表达盒，或使用2A样序列来分开两个序列。

腺病毒载体的表达盒的设计

表达盒(示意于图2A和图2B)包含CMV启动子(SEQ ID NO:7)、内含子(SEQ ID NO:15)(衍生自人ApoAI基因的片段-GenBank登录号X01038295–523碱基对，带有ApoAI第二内含子)，然后是优化的编码序列–单独的核心或者核心和聚合酶融合蛋白，其前面是人免疫球蛋白分泌信号编码序列(SEQ ID NO:10)，然后是SV40多腺苷酸化信号(SEQ ID NO:16)。

包括分泌信号是因为过去的经验表明，某些带有分泌的转基因的腺病毒载体的可制造性得到改善，而没有影响引发的T细胞应答(小鼠实验)。

核心蛋白的最后两个残基(VV)和聚合酶蛋白的前两个残基(MP)如果融合导致连接序列(VVMP)，其存在于人多巴胺受体蛋白(D3亚型)，以及侧翼的同源性。

在核心和聚合酶序列之间***AGAG接头消除这种同源性，并且在人蛋白质组的Blast中没有进一步的命中。

实施例3：表达HBV核心抗原和HBV pol抗原的MVA载体的产生

MVA载体已经设计为编码本申请的HBV Core和Pol编码序列的每一个。将HBV Core和Pol编码序列的每一个***MVA载体的IGR44/45处，各自在分别的启动子的控制下。还可以设想用于表达两种蛋白的其他构型，例如使用其中核心和Pol抗原包含融合蛋白的单一表达盒，或者使用2A样序列来分开两个序列。此外，还可以设想在MVA载体中的额外和/或替代的***位点，例如，将HBV核心和Pol编码序列的每一个***相同或不同的***位点。

MVA载体的表达盒的设计

表达盒(示意于图2C)包含Pr13.5长启动子(SEQ ID NO:25)，其邻近HBV核心抗原并指导其表达，和PrHyb启动子(SEQ ID NO:26)，其邻近HBV pol抗原并指导其表达。HBV核心编码序列包含SEQ ID NO:1，并且HBV Pol编码序列包含SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:1和3各自通过消除负顺式作用位点和通过调节GC含量来修饰。此外，针对人密码子使用对SEQ IDNO:1和3各自进行密码子优化，而不影响氨基酸序列。SEQ ID NO:1和3各自包括邻近终止密码子布置的额外的早期终止信号(TTTTTNT(SEQ ID NO:28))。

实施例4：HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的组合在小鼠中的免疫原性

材料和方法

载体设计：使用两个腺病毒载体，其表达单独的Core(具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HBV核心抗原)或者作为融合蛋白从单一的开放阅读框表达的Polymerase(具有SEQID NO:4的氨基酸序列的HBV pol抗原)和Core。为此，在计算机上设计了序列，以为乙型肝炎病毒的B、C和D基因型提供共有部分。表达盒包含CMV启动子、ApoAI内含子、人免疫球蛋白分泌信号，其后是编码序列-单独的Core或者Core和Polymerase融合蛋白以及SV40多腺苷酸化信号。

重组MVA载体包含痘病毒启动子Pr13.5(SEQ ID NO:25)和PrHyb(SEQ ID NO:26)，两者后都是TTTTTNT(SEQ ID NO:28)转录终止序列，Pr13.5连接至核心编码序列(SEQ IDNO:1的核苷酸序列，以及SEQ ID NO:2的多肽序列)，PrHyb(SEQ ID NO:26)连接至编码聚合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:3的核苷酸序列，以及SEQ ID NO:4的多肽序列)。核心编码序列包含N末端免疫球蛋白分泌标签(SEQ ID NO:11)，并且聚合酶编码序列包含N末端cystatin S信号序列(SEQ ID NO:6)。参见，例如，图2C。

小鼠体内免疫原性研究：为了评估HBV腺病毒载体和HBV MVA的组合的体内免疫原性，对F1小鼠(C57BL/6x Balb/C)用不同载体组合进行肌内初免加强免疫接种。这些免疫原性研究侧重于确定HBV抗原Core和Polymerase引起的细胞免疫应答。

通过IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)分析和定量抗原特异性应答，并通过流式细胞术检测细胞内细胞因子的产生(TNF-α、IL-2和IFN-γ)。在这些测定中，将免疫的动物分离的脾细胞与覆盖Core蛋白、Pol蛋白或小肽前导序列和连接序列(junction sequence)(每种肽2μg/ml)的肽池一起孵育。另外，使用MVA特异性肽(2μg/ml)。池由重叠11个残基的15元(mer)肽组成，所述11个残基与Core和Pol腺病毒载体的基因型ABCD共有序列匹配。94kDa的大HBV Pol蛋白在中间***为两个肽池。在ELISPOT中，通过合适的抗体以及随后显色检测为微孔板上的有色斑点(称为斑点形成细胞(SFC))来观察单个抗原特异性T细胞的IFN-γ释放。在ICS中，确定特定群体(CD3阳性、CD4阳性或CD8阳性细胞)中释放细胞因子的细胞的百分比。

结果

小鼠中HBV腺病毒载体和HBV MVA组合的免疫原性评估：本研究的目的是评估IM递送至F1小鼠后，HBV腺病毒载体和HBV MVA的组合诱导的免疫应答。向F1小鼠的给药如表1所总结。动物接受了一次HBV腺病毒载体免疫接种，然后在8周后进行了HBV MVA免疫接种。在最后一次免疫接种后1周收集脾细胞。

表1：小鼠免疫接种实验设计

IM：肌内；vp：病毒颗粒；TCID50：50％组织培养感染剂量；MVA：改良型痘苗病毒安卡拉

单独的HBV腺病毒载体，以及与HBV MVA载体的组合，在小鼠中产生Pol特异性T细胞应答。Core pol融合+核心腺病毒载体诱导低水平的核心应答，这些应答通过用HBV MVA载体加强而放大。Core pol融合腺病毒载体和HBV MVA载体的组合也诱导了核心应答(图3)。

Pol应答主要由CD8(+)T细胞介导，而核心应答主要涉及CD4(+)T细胞(图4和5)。Core pol融合+核心腺病毒载体和HBV MVA的组合也诱导CD8(+)T细胞驱动的核心应答(图4)。

结论：HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的组合在F1小鼠中引起针对核心和pol的T细胞应答。

实施例5：非人灵长类(NHP)中HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的组合的免疫原性

NHP的体内免疫原性研究：为了评估HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的组合的体内免疫原性，用不同载体组合对毛里求斯食蟹猴进行肌内初免-加强-加强免疫。这些免疫原性研究侧重于确定HBV核心和聚合酶抗原引发的细胞免疫应答。

通过IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)分析和定量抗原特异性应答，并通过流式细胞术检测细胞内细胞因子产生(TNF-α、IL-2和IFN-γ)。在这些测定中，将免疫的动物的PBMC与覆盖Core蛋白或Pol蛋白的肽池(每种肽2μg/ml)一起孵育。池由重叠11个残基的15元肽组成，所述11个残基与Core和Pol腺病毒载体的基因型ABCD共有序列匹配。94kDa的大HBV Pol蛋白在中间***为两个肽池。在ELISPOT中，通过合适的抗体以及随后显色检测为微孔板上的有色斑点(称为斑点形成细胞(SFC))来观察单个抗原特异性T细胞释放的IFN-γ。在细胞内细胞因子染色(ICS)中，确定特定群体(CD3阳性、CD4阳性或CD8阳性细胞)中释放细胞因子的细胞的百分比。

结果

在NHP中评估HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的组合的免疫原性：本研究的目的是评估IM递送至毛里求斯食蟹猴后，HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的组合诱导的免疫应答。向NHP的给药如表2所总结。动物接受了一次HBV腺病毒载体免疫接种，然后在8周后进行了HBV MVA载体免疫接种，然后在8周后再进行HBV腺病毒载体免疫接种。在每次免疫接种后2周收集PBMC。

表2：NHP免疫实验设计

IM：肌内；vp：病毒颗粒；TCID50：50％组织培养感染剂量；MVA：改良型痘苗病毒安卡拉

单独的Core pol融合腺病毒载体以及Core pol融合+核心腺病毒载体与HBV MVA载体的组合，在NHP中产生了稳健的(robust)Pol和Core特异性T细胞应答。用Core pol融合腺病毒载体进一步加强没有进一步增加应答(图6)。

NHP中的Core和Pol应答是由CD4(+)和CD8(+)T细胞介导的。Core pol融合腺病毒载体+核心腺病毒载体(用作初免)和HBV MVA(用作加强)的组合诱导了最高的CD4(+)Core特异性和CD8(+)Pol特异性T细胞IFN-γ应答(图7)。

这些结果表明，HBV腺病毒载体和HBV MVA载体的组合在NHP中产生了针对核心和pol抗原的稳健的T细胞应答。

本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施方案进行改变。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，而是旨在涵盖由本说明书限定的本发明的精神和范围内的修改。

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巴法里安诺迪克有限公司

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<150> PCT/IB2017/058148

<151> 2017-12-19

<150> US 62/607,439

<151> 2017-12-19

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 447

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBV core

<400> 1

atggacatcg atccctacaa ggagttcggt gccagcgtgg aactgctgag cttcctgccc 60

agcgacttct tcccttccat cagagacctg ctggacactg ccagcgcact gtacagagag 120

gctctggaaa gccctgagca ctgcagccct caccacaccg ctctgagaca ggccatcctg 180

tgctggggag agctgatgaa cctggccacc tgggtcggaa gcaacctgga agatccagcc 240

agtcgcgagc tggtggtgtc ctacgtgaac gtgaacatgg gcttgaagat ccggcagctc 300

ctgtggttcc acatcagctg cctgaccttc ggacgggaaa ccgtgctgga atacctggtg 360

tcctttggcg tgtggatccg gacacctcca gcctacagac ctcccaacgc tcctatcctg 420

agcaccctgc ctgagacaac cgtggtg 447

<210> 2

<211> 149

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBV core

<400> 2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

85 90 95

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu Thr Thr Val Val

145

<210> 3

<211> 2529

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBV pol

<400> 3

atgcctctga gctaccagca ctttcggaag ctgctgctcc tggacgacga ggccggacct 60

ctggaagagg aactgcccag actggcagac gagggtctga acagaagagt ggccgaggac 120

ctgaacctgg gcaacctgaa cgtgtccatc ccttggaccc acaaggtcgg aaacttcacc 180

ggtctgtaca gcagcaccgt gcctgtgttc aaccctgagt ggcagacacc cagctttccc 240

aacatccatc tgcaggaaga tatcatcaac cgctgcgagc agttcgtggg acctctgacc 300

gtgaacgaga agcggagact gaagctgatc atgccagcca gattctaccc taacgtgacc 360

aagtacctgc ctctggacaa gggcatcaag ccctactacc ctgagcacct ggtcaaccac 420

tacttccaga ccagacacta cctgcacacc ctgtggaagg ccggcatcct gtacaagaga 480

gagacaacca gaagcgccag cttctgcggc agcccttaca gctgggagca ggaactccag 540

cacggacgcc tggtgttcca gaccagcacc agacacggcg acgagagctt ttgccagcag 600

agcagcggca tcctgagcag atctcctgtg ggtccttgcc tgcagagcca gctgaggaag 660

tccagactgg gcctgcagcc tcagcaggga catctggcta gacggcagca gggcagaagc 720

ggcagcatca gagccagagt gcaccctacc accagacggc ctttcggcgt ggaacctagc 780

ggctctggcc acaccaccaa caccgcctct agctccagct cctgcctgca ccagtcagcc 840

gtgcggaagg ctgcctacag ccacctgagc accagcaaga gacacagcag ctccggacac 900

gctgtcgagc tgcacaacat ccctcccaac agcgccagaa gccagagcga gggtcctgtg 960

ttcagctgtt ggtggctgca gttccggaac agcaagccct gcagcgacta ctgcctgagc 1020

cacatcgtga acctgctgga agattgggga ccttgcaccg agcacggcga gcaccacatc 1080

cggatcccta gaacaccagc cagagtgaca ggaggcgtgt tcctcgtgga caagaaccct 1140

cacaacacca ccgagagcag actggtggtg gacttcagcc agttctccag aggcaacacc 1200

agagtgtcct ggcccaagtt cgccgttccc aacctgcagt ccctgaccaa cctgctgagc 1260

agcaacctga gctggctgag cctggacgtg tccgctgcct tctaccatct gcctctgcac 1320

cctgcagcca tgcctcatct gctcgttggc agcagcggac tgtccagata cgtggctcgg 1380

ctgtccagca actctcggat catcaaccac cagcacggca ccatgcagaa cctgcacgac 1440

agctgcagca gaaatctgta tgtgtccctg ctcctgctgt acaagacctt tggccggaag 1500

ctgcacctgt acagccatcc catcatcctg ggcttccgga agatccctat gggcgtggga 1560

ctgagcccat tcctgctggc ccagttcacc agcgccatct gcagcgtcgt gcggagagcc 1620

ttccctcact gcctggcctt cagctacatg aacaacgtgg tgctgggcgc caagagcgtg 1680

cagcacctgg aatccctgtt taccgccgtg accaacttcc tgctgtccct gggcatccac 1740

ctgaatccca acaagaccaa gagatgggga tacagcctga acttcatggg ctacgtgatc 1800

ggcagctggg gcacactgcc tcaggaacac atcgtccaga agatcaaaga gtgcttccgc 1860

aagcttcccg tgaacagacc catcgactgg aaagtgtgcc agcggatcgt tggactgctg 1920

ggctttgcag ctcctttcac ccagtgcggc taccctgctc tgatgcctct gtacgcctgc 1980

atccagagca agcaggcctt caccttcagc cctacctaca aggccttcct gtgcaagcag 2040

tacctgaatc tgtaccctgt ggccagacag agaccaggcc tgtgccaggt gttcgccaat 2100

gccacaccta ccggctgggg ccttgccatt ggccaccaga gaatgagagg caccttcgtg 2160

gctcctctgc ccatccacac agcccagctg ctggctgcct gcttcgccag aagcagatcc 2220

ggagccaagc tgatcggcac cgacaactcc gtggtgctga gccggaagta caccagcttc 2280

ccttggctgc tgggctgcgc tgccaactgg atcctgcgag gcaccagctt cgtgtacgtg 2340

ccctctgccc tgaaccctgc cgacgaccct tctagaggca ggctgggact gtacagacct 2400

ctgcttagac tgcccttcag acccaccacc ggacggacca gcctgtacgc cgatagccct 2460

agcgtgccca gccatctgcc cgacagagtg cacttcgcca gccctctgca tgtggcctgg 2520

agacctcca 2529

<210> 4

<211> 843

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBV pol

<400> 4

Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp

1 5 10 15

Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly

20 25 30

Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val

35 40 45

Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro

65 70 75 80

Asn Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Glu Gln Phe Val

85 90 95

Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro

100 105 110

Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly

115 120 125

Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln Thr

130 135 140

Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg

145 150 155 160

Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu

165 170 175

Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His

180 185 190

Gly Asp Glu Ser Phe Cys Gln Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser

195 200 205

Pro Val Gly Pro Cys Leu Gln Ser Gln Leu Arg Lys Ser Arg Leu Gly

210 215 220

Leu Gln Pro Gln Gln Gly His Leu Ala Arg Arg Gln Gln Gly Arg Ser

225 230 235 240

Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Arg Arg Pro Phe Gly

245 250 255

Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Asn Thr Ala Ser Ser Ser

260 265 270

Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr Ser His

275 280 285

Leu Ser Thr Ser Lys Arg His Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu

290 295 300

His Asn Ile Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Gly Pro Val

305 310 315 320

Phe Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp

325 330 335

Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys

340 345 350

Thr Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg

355 360 365

Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Thr

370 375 380

Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Thr

385 390 395 400

Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr

405 410 415

Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala

420 425 430

Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu

435 440 445

Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn

450 455 460

Ser Arg Ile Ile Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp

465 470 475 480

Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr

485 490 495

Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe

500 505 510

Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln

515 520 525

Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys

530 535 540

Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asn Asn Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val

545 550 555 560

Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser

565 570 575

Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser

580 585 590

Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln

595 600 605

Glu His Ile Val Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val

610 615 620

Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu

625 630 635 640

Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro

645 650 655

Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr

660 665 670

Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala

675 680 685

Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asn Ala Thr Pro Thr

690 695 700

Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val

705 710 715 720

Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Gln Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala

725 730 735

Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val

740 745 750

Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala

755 760 765

Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu

770 775 780

Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Tyr Arg Pro

785 790 795 800

Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr

805 810 815

Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe

820 825 830

Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro

835 840

<210> 5

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cystatin S signal peptide

<400> 5

atggctcgac ctctgtgtac cctgctactc ctgatggcta ccctggctgg agctctggcc 60

agc 63

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cystatin S signal peptide

<400> 6

Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Leu Ala Ser

20

<210> 7

<211> 684

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMV promoter

<400> 7

accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 60

agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 120

ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 180

gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 240

ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 300

atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 360

catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 420

gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 480

gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 540

attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 600

agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 660

ccgggaccga tccagcctcc gcgg 684

<210> 8

<211> 378

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> triple enhancer

<400> 8

ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt 60

gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt 120

aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 180

actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctagt tctctcgtta 240

acttaatgag acagatagaa actggtcttg tagaaacaga gtagtcgcct gcttttctgc 300

caggtgctga cttctctccc ctgggctttt ttctttttct caggttgaaa agaagaagac 360

gaagaagacg aagaagac 378

<210> 9

<211> 225

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BGH poly A

<400> 9

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 10

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Immunoglobulin secretion signal

<400> 10

atggagttcg gcctgtcttg ggtctttctg gtggcaatcc tgaagggcgt gcagtgtgaa 60

gtgcagctgc tggagtctgg a 81

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Immunoglobulin secretion signal

<400> 11

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly

20 25

<210> 12

<211> 996

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Core-Pol fusion

<400> 12

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

85 90 95

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Ala Gly Ala Gly Met Pro Leu Ser Tyr Gln His

145 150 155 160

Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu

165 170 175

Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu

180 185 190

Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val Ser Ile Pro Trp Thr His Lys

195 200 205

Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val Pro Val Phe Asn

210 215 220

Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro Asn Ile His Leu Gln Glu Asp

225 230 235 240

Ile Ile Asn Arg Cys Glu Gln Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu

245 250 255

Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val

260 265 270

Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu

275 280 285

His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu

290 295 300

Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser

305 310 315 320

Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu Gln His Gly Arg

325 330 335

Leu Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His Gly Asp Glu Ser Phe Cys Gln

340 345 350

Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser Pro Val Gly Pro Cys Leu Gln

355 360 365

Ser Gln Leu Arg Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gln Pro Gln Gln Gly His

370 375 380

Leu Ala Arg Arg Gln Gln Gly Arg Ser Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val

385 390 395 400

His Pro Thr Thr Arg Arg Pro Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly

405 410 415

His Thr Thr Asn Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Cys Leu His Gln Ser

420 425 430

Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr Ser His Leu Ser Thr Ser Lys Arg His

435 440 445

Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu His Asn Ile Pro Pro Asn Ser

450 455 460

Ala Arg Ser Gln Ser Glu Gly Pro Val Phe Ser Cys Trp Trp Leu Gln

465 470 475 480

Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His Ile Val

485 490 495

Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His His

500 505 510

Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu

515 520 525

Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp

530 535 540

Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe

545 550 555 560

Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu

565 570 575

Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu

580 585 590

His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser

595 600 605

Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Ile Asn His Gln

610 615 620

His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr

625 630 635 640

Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu

645 650 655

Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val

660 665 670

Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser

675 680 685

Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asn

690 695 700

Asn Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe

705 710 715 720

Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro

725 730 735

Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val

740 745 750

Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Gln Lys Ile

755 760 765

Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys

770 775 780

Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr

785 790 795 800

Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser

805 810 815

Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys

820 825 830

Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys

835 840 845

Gln Val Phe Ala Asn Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly

850 855 860

His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr

865 870 875 880

Ala Gln Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys

885 890 895

Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser

900 905 910

Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr

915 920 925

Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser

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Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro

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Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala

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Trp Arg Pro Pro

995

<210> 13

<211> 1023

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Core-Pol fusion

<400> 13

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Met Asp Ile Asp Pro

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Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser

35 40 45

Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu

50 55 60

Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr

65 70 75 80

Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala

85 90 95

Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val

100 105 110

Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu

115 120 125

Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu

130 135 140

Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg

145 150 155 160

Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val

165 170 175

Ala Gly Ala Gly Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu

180 185 190

Leu Leu Asp Asp Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu

195 200 205

Ala Asp Glu Gly Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly

210 215 220

Asn Leu Asn Val Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr

225 230 235 240

Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr

245 250 255

Pro Ser Phe Pro Asn Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys

260 265 270

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275 280 285

Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro

290 295 300

Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His

305 310 315 320

Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile

325 330 335

Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro

340 345 350

Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr

355 360 365

Ser Thr Arg His Gly Asp Glu Ser Phe Cys Gln Gln Ser Ser Gly Ile

370 375 380

Leu Ser Arg Ser Pro Val Gly Pro Cys Leu Gln Ser Gln Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Arg Leu Gly Leu Gln Pro Gln Gln Gly His Leu Ala Arg Arg Gln

405 410 415

Gln Gly Arg Ser Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Arg

420 425 430

Arg Pro Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Asn Thr

435 440 445

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala

450 455 460

Ala Tyr Ser His Leu Ser Thr Ser Lys Arg His Ser Ser Ser Gly His

465 470 475 480

Ala Val Glu Leu His Asn Ile Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu

595 600 605

Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met

610 615 620

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675 680 685

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725 730 735

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820 825 830

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835 840 845

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850 855 860

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Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg

885 890 895

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900 905 910

Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp

915 920 925

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930 935 940

Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val

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Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly

965 970 975

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980 985 990

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<210> 14

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker coding sequence

<400> 14

gccggagctg gc 12

<210> 15

<211> 248

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ApoA1 gene fragment

<400> 15

ttggccgtgc tcttcctgac gggtaggtgt cccctaacct agggagccaa ccatcggggg 60

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tagccacc 248

<210> 16

<211> 130

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SV40 polyadenylation signal

<400> 16

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aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

tatcatgtct 130

<210> 17

<211> 447

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBV core

<400> 17

atggacatcg acccttacaa ggagttcggc gccagcgtgg aactgctgtc ttttctgccc 60

agtgatttct ttccttccat tcgagacctg ctggataccg cctctgctct gtatcgggaa 120

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tgctgggggg agctgatgaa cctggccaca tgggtgggat ccaatctgga ggaccccgct 240

tcacgggaac tggtggtcag ctacgtgaac gtcaatatgg gcctgaaaat ccgccagctg 300

ctgtggttcc atattagctg cctgactttt ggacgagaga ccgtgctgga atacctggtg 360

tccttcggcg tctggatccg cactccccct gcttatcgac cacccaacgc accaattctg 420

tccaccctgc ccgagaccac agtggtc 447

<210> 18

<211> 447

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBV core

<400> 18

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agtgatttct ttccttccat tcgagacctg ctggataccg cctctgctct gtatcgggaa 120

gccctggaga gcccagaaca ctgctcccca caccataccg ctctgcgaca ggcaatcctg 180

tgctgggggg agctgatgaa cctggccaca tgggtgggat cgaatctgga ggaccccgct 240

tcacgggaac tggtggtcag ctacgtgaac gtcaatatgg gcctgaaaat ccgccagctg 300

ctgtggttcc atattagctg cctgactttt ggacgagaga ccgtgctgga atacctggtg 360

tccttcggcg tctggattcg cactccccct gcttatcgac cacccaacgc accaattctg 420

tccaccctgc ccgagaccac agtggtc 447

<210> 19

<211> 2529

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBV pol

<400> 19

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ctggaggaag agctgccaag gctggcagac gaggggctga accggagagt ggccgaagat 120

ctgaatctgg gaaacctgaa cgtgagcatc ccttggactc ataaagtcgg caacttcacc 180

gggctgtaca gctccacagt gcctgtcttc aatccagagt ggcagacacc atcctttccc 240

aacattcacc tgcaggagga catcattaat agatgcgaac agttcgtggg acctctgaca 300

gtcaacgaaa agaggcgcct gaaactgatc atgcctgcca ggttttaccc aaatgtgact 360

aagtatctgc cactggataa gggcatcaag ccttactatc cagagcacct ggtgaaccat 420

tacttccaga ctagacacta tctgcatacc ctgtggaagg ccggaatcct gtacaaacga 480

gaaactaccc ggagtgcttc attttgtggc tccccatatt cttgggaaca ggagctgcag 540

catggcaggc tggtgttcca gaccagcaca cgccacgggg atgagtcctt ttgccagcag 600

tctagtggca tcctgagcag atcccccgtg gggccttgtc tgcagtctca gctgcggaag 660

agtagactgg gactgcagcc acagcaggga cacctggcac gacggcagca gggaaggtct 720

ggcagtatcc gggctagagt gcatcccaca actagaaggc ctttcggcgt cgagccatca 780

ggaagcggcc acaccacaaa caccgcatca agctcctcta gttgcctgca tcagtcagcc 840

gtgagaaagg ccgcttacag ccacctgtcc acatctaaaa ggcactcaag ctccgggcat 900

gctgtggagc tgcacaacat ccctccaaat tctgcacgca gtcagtcaga aggacccgtg 960

ttcagctgct ggtggctgca gtttcggaac tcaaagcctt gcagcgacta ttgtctgagc 1020

catattgtga atctgctgga ggattggggc ccttgtaccg agcacgggga acaccatatc 1080

aggattccac gaacaccagc acgagtgact ggaggggtgt tcctggtgga caagaacccc 1140

cacaatacta ccgagagccg gctggtggtc gatttcagtc agttttcaag aggcaacaca 1200

agggtgtcat ggcccaaatt cgccgtccct aatctgcaga gtctgactaa cctgctgtct 1260

agtaatctga gctggctgtc cctggacgtg tccgcagcct tttaccacct gcctctgcat 1320

ccagctgcaa tgccccatct gctggtgggg tcaagcggac tgagtcgcta cgtcgcccga 1380

ctgtcctcta actcacgcat cattaatcac cagcatggca ccatgcagaa cctgcacgat 1440

agctgttccc ggaatctgta cgtgtctctg ctgctgctgt ataagacatt cggcagaaaa 1500

ctgcacctgt acagccatcc tatcattctg gggtttagga agatcccaat gggagtggga 1560

ctgagcccct tcctgctggc acagtttacc tccgccattt gctctgtggt ccgccgagcc 1620

ttcccacact gtctggcttt ttcctatatg aacaatgtgg tcctgggcgc caaatccgtg 1680

cagcatctgg agtctctgtt cacagctgtc actaactttc tgctgagcct ggggatccac 1740

ctgaacccaa ataagactaa acgctggggg tacagcctga atttcatggg atatgtgatt 1800

ggatcctggg ggaccctgcc acaggagcac atcgtgcaga agatcaagga atgctttcgg 1860

aagctgcccg tcaacagacc tatcgactgg aaagtgtgcc agcggattgt cggactgctg 1920

ggcttcgccg ctccctttac ccagtgcggg tacccagcac tgatgcccct gtatgcctgt 1980

atccagtcta agcaggcttt cacctttagt cctacataca aggcattcct gtgcaaacag 2040

tacctgaacc tgtatccagt ggcaaggcag cgacctggac tgtgccaggt ctttgcaaat 2100

gccactccta ccggctgggg gctggctatc ggacatcagc gaatgcgggg cacattcgtg 2160

gcccccctgc ctattcacac tgctcagctg ctggcagcct gctttgctag atctaggagt 2220

ggagcaaagc tgatcggcac cgacaatagt gtggtcctgt caagaaaata cacatccttc 2280

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ccctcagccc tgaatcctgc tgacgatcca tcccgcgggc gactgggact gtaccgacct 2400

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cggcctcca 2529

<210> 20

<211> 2529

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBV pol

<400> 20

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ctggaggaag agctgccaag gctggcagac gaggggctga accggagagt ggccgaagat 120

ctgaatctgg gaaacctgaa cgtgagcatc ccttggactc ataaagtcgg caacttcacc 180

gggctgtaca gctccacagt gcctgtcttc aatccagagt ggcagacacc atcctttccc 240

aacattcacc tgcaggagga catcattaat agatgcgaac agttcgtggg acctctgaca 300

gtcaacgaaa agaggcgcct gaaactgatc atgcctgcca ggttttaccc aaatgtgact 360

aagtatctgc cactggataa gggcatcaag ccttactatc cagagcacct ggtgaaccat 420

tacttccaga ctagacacta tctgcatacc ctgtggaagg ccggaatcct gtacaaacga 480

gaaactaccc ggagtgcttc attttgtggc tccccatatt cttgggaaca ggagctgcag 540

catggcaggc tggtgttcca gaccagcaca cgccacgggg atgagtcctt ttgccagcag 600

tctagtggca tcctgagcag atcccccgtg gggccttgtc tgcagtctca gctgcggaag 660

agtagactgg gactgcagcc acagcaggga cacctggcac gacggcagca gggaaggtct 720

ggcagtatcc gggctagagt gcatcccaca actagaaggc ctttcggcgt cgagccatca 780

ggaagcggcc acaccacaaa caccgcatca agctcctcta gttgcctgca tcagtcagcc 840

gtgagaaagg ccgcttacag ccacctgtcc acatctaaaa ggcactcaag ctccgggcat 900

gctgtggagc tgcacaacat ccctccaaat tctgcacgca gtcagtcaga aggacccgtg 960

ttcagctgct ggtggctgca gtttcggaac tcaaagcctt gcagcgacta ttgtctgagc 1020

catattgtga atctgctgga ggattggggc ccttgtaccg agcacgggga acaccatatc 1080

aggattccac gaacaccagc acgagtgact ggaggggtgt tcctggtgga caagaacccc 1140

cacaatacta ccgagagccg gctggtggtc gatttcagtc agttttcaag aggcaacaca 1200

agggtgtcat ggcccaaatt cgccgtccct aatctgcaga gtctgactaa cctgctgtct 1260

agtaatctga gctggctgtc cctggacgtg tccgcagcct tttaccacct gcctctgcat 1320

ccagctgcaa tgccccatct gctggtgggg tcaagcggac tgagtcgcta cgtcgcccga 1380

ctgtcctcta actcacgcat cattaatcac cagcatggca ccatgcagaa cctgcacgat 1440

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cagcatctgg agtctctgtt cacagctgtc actaactttc tgctgagcct ggggatccac 1740

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atccagtcta agcaggcttt cacctttagt cctacataca aggcattcct gtgcaaacag 2040

tacctgaacc tgtatccagt ggcaaggcag cgacctggac tgtgccaggt ctttgcaaat 2100

gccactccta ccggctgggg gctggctatc ggacatcagc gaatgcgggg cacattcgtg 2160

gcccccctgc ctattcacac tgctcagctg ctggcagcct gctttgctag atctaggagt 2220

ggagcaaagc tgatcggcac cgacaatagt gtggtcctgt caagaaaata cacatccttc 2280

ccatggctgc tgggatgtgc tgcaaactgg attctgaggg gcaccagctt cgtgtacgtc 2340

ccctcagccc tgaatcctgc tgacgatcca tcccgcgggc gactgggact gtaccgacct 2400

ctgctgagac tgcccttcag gcctacaact ggccggacat ctctgtatgc cgattcacca 2460

agcgtgccct cacacctgcc tgacagagtc cactttgctt cacccctgca cgtcgcttgg 2520

cggcctcca 2529

<210> 21

<211> 671

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pUC Ori

<400> 21

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 60

ttgcaaacaa aaaaaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 180

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660

tttgctcaca t 671

<210> 22

<211> 795

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Kan resistance

<400> 22

atgattgagc aagatggtct tcacgctggc tcgccagctg cgtgggtgga acgcctgttt 60

ggttatgatt gggcgcagca gactattgga tgttccgacg cggctgtatt tcggctgtct 120

gctcagggtc gccccgtgct gtttgtgaag acggatttgt ctggcgcatt aaatgagtta 180

caggacgagg cggctcgtct gagttggttg gccaccaccg gcgtgccctg cgccgcagtg 240

ctggatgtcg tgacagaagc aggccgcgat tggctccttc tcggcgaagt gccgggccag 300

gacctgctca gcagccactt ggcaccggca gaaaaagttt ctatcatggc cgacgccatg 360

cgtcgtcttc acactctcga tccggccacg tgcccctttg accaccaggc caagcatcgt 420

attgaacgtg cgcgtactcg gatggaagca ggtttagtag accaggacga tttggatgag 480

gaacatcaag gcctggcccc ggctgaactg tttgcgcgct taaaagcgtc gatgccagat 540

ggcgaagatt tggtagtcac ccatggagat gcgtgtttgc caaacatcat ggttgaaaat 600

ggccgcttct caggctttat tgactgtggg cgcctgggtg ttgccgaccg ctatcaagat 660

attgcgctcg caactcgtga catcgctgaa gagctgggcg gagaatgggc tgaccgtttc 720

ctggtactgt atggcattgc agcgcccgat tcccaacgca tcgcatttta tcgtctgctg 780

gatgagtttt tctaa 795

<210> 23

<211> 264

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Kan resistance

<400> 23

Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val

1 5 10 15

Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser

20 25 30

Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe

35 40 45

Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala

50 55 60

Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val

65 70 75 80

Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu

85 90 95

Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys

100 105 110

Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro

115 120 125

Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala

130 135 140

Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu

145 150 155 160

Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala

165 170 175

Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys

180 185 190

Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp

195 200 205

Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala

210 215 220

Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe

225 230 235 240

Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe

245 250 255

Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe

260

<210> 24

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> bla promoter

<400> 24

acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 60

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagt 99

<210> 25

<211> 124

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PrMVA13.5 Long Promoter

<400> 25

taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agtattgctc ttgtgactag 60

agactttagt taaggtactg taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt 120

agta 124

<210> 26

<211> 227

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PrHyb Promoter

<400> 26

gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60

tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120

gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180

tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227

<210> 27

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Immunoglobulin Secretion Tag

<400> 27

atggaattcg gcctgagctg ggtgttcctg gtggccatcc tgaagggagt gcagtgcgag 60

gtgcagctgc tggaaagcgg t 81

<210> 28

<211> 7

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Transcription Termination Sequence

<220>

<221> n

<222> (6)..(6)

<223> n, wherein n can be any nucleotide

<400> 28

tttttnt 7