一种乙肝疫苗的解析方法
阅读说明：本技术 一种乙肝疫苗的解析方法 (Method for analyzing hepatitis B vaccine ) 是由 张亚利 陈会珍 刘海侠 胡忠玉 王英 洪庆福 何鹏 方鑫 甄文晓 张卫婷 李微 于 2020-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种乙肝疫苗的解析方法,包括以下步骤：(a)将乙肝疫苗样品于-15℃以下反复冻融至少一次；(b)将经冻融处理的乙肝疫苗样品与盐酸混合,并在37℃条件下孵育1~3h,其中,乙肝疫苗样品与盐酸的体积比为1∶1~2；(c)最后加入保护剂Triton100,并在37℃条件下水浴1~3h,即完成解析。本发明能够将乙肝疫苗中的有效成分与佐剂有效分离,从而可通过免疫试剂盒对其有效成分进行准确监测。由于之前解析液解析率低,现有的测定乙肝疫苗活性的方法为动物法,新解析方式发明后可以有效替代动物实验,节约动物成本。(The invention provides an analytic method of hepatitis B vaccine, which comprises the following steps: (a) repeatedly freezing and thawing a hepatitis B vaccine sample at a temperature below-15 ℃ for at least one time; (b) mixing a hepatitis B vaccine sample subjected to freeze thawing treatment with hydrochloric acid, and incubating for 1-3 hours at 37 ℃, wherein the volume ratio of the hepatitis B vaccine sample to the hydrochloric acid is 1: 1-2; (c) and finally adding a protective agent Triton100, and carrying out water bath for 1-3 h at 37 ℃, thus completing the analysis. The invention can effectively separate the effective components in the hepatitis B vaccine from the adjuvant, thereby accurately monitoring the effective components through the immunoassay kit. Because the prior analytic solution has low resolution ratio, the existing method for determining the activity of the hepatitis B vaccine is an animal method, and the new analytic method can effectively replace animal experiments and save the animal cost.)
技术领域
本发明涉及乙肝疫苗含量检测技术领域，具体地说是一种乙肝疫苗的解析方法。
背景技术
疫苗用氢氧化铝佐剂通常是通过向铝盐溶液中加入碱液，生成不带电荷的中性物质相互聚集而形成沉淀。聚集物还会通过羟桥键发生双分子和多分子缩聚，形成大分子。铝盐加碱得到蓬松的絮状氢氧化铝沉淀，由于含有较多的配位水，氢氧化铝沉淀松散的聚集在一起，有时也被称之为晶态偏氢氧化铝AlO(OH)。
氢氧化铝是两性化合物，等电点(isoelectric point,pI)为11.4，在与机体间质液pH相近的缓冲液中其带正电荷，可很好的吸附酸性蛋白抗原。一般氢氧化铝粒径大小1-10μm，不同批次的氢氧化铝佐剂在粒径上存在一定的差别。
乙肝疫苗中的HBsAg被佐剂所吸附后，需要将其解析后采用酶联免疫实验检测其乙肝的真实含量。根据《中华人民共和国药典》第三部通则的要求，用二乙醇胺、Triton100来对佐剂进行解析，但由于与佐剂结合过于牢固，且现有的解析液解析效果比较差，采用酶联免疫实验检测不到乙肝疫苗的真实含量，测试结果仅为有效成分含量的40％左右，测定产品中含量值较低，不能真实反映产品的有效成分。应用现有方法对本公司样品进行解析率调查，结果如表1所示。
表1：
样品
含量(ug/mL)
解析率(％)
样品1
7.8
39.0
样品2
8.7
43.5
样品3
8.2
41.0
样品4
7.5
37.5
样品5
8.5
42.5
样品6
8.6
43.0
样品7
7.7
38.5
样品8
8.0
40.0
均值
8.1
40.6
为准确反映乙肝疫苗中有效成分的含量，根据佐剂的特性，认为加入酸可降低其吸附效果，将乙肝疫苗完全解析出来，用酶联免疫实验检测乙肝疫苗中HBsAg的真实含量。
发明内容
本发明的目的就是提供一种乙肝疫苗的解析方法，以解决现有方法解析率低的问题。
本发明的目的是这样实现的：一种乙肝疫苗的解析方法，包括以下步骤：
(a)将乙肝疫苗样品于-15℃以下反复冻融至少一次；
(b)将经冻融处理的乙肝疫苗样品与盐酸混合，并在37℃条件下孵育1～3h，其中，乙肝疫苗样品与盐酸的体积比为1∶1～2；
(c)最后加入保护剂Triton100，并在37℃条件下水浴1～3h，即完成解析。
更优选地，所述解析方法包括以下步骤：
(a)将乙肝疫苗样品于-20℃反复冻融两次；
(b)将经冻融处理的乙肝疫苗样品与盐酸混合，并在37℃条件下孵育2h，其中，乙肝疫苗样品与盐酸的体积比为1∶1；
(c)最后加入保护剂Triton100，并在37℃条件下水浴1h，即完成解析。
步骤(b)中，所述盐酸的浓度为1mol/L。
所述乙肝疫苗指用氢氧化铝佐剂吸附的乙肝疫苗。
本发明解决了背景技术中的不足，提供了一种解析乙肝疫苗的新型方法，能够将乙肝疫苗中的有效成分与佐剂有效分离，从而可通过免疫试剂盒对其有效成分进行准确监测，既提高了检验效率又节约成本。产品中有效成分与佐剂得以有效分离，可进行体外法测定乙肝产品效力的实验摸索。目前乙肝疫苗效力测定采用小鼠法，小鼠用量为1.5万只/年。乙肝疫苗中有效成分一旦可用体外法进行准确的定量测试，则可替代小鼠法，节约动物成本，提高检验效率和准确性，更好的保证疫苗的有效性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法进行。乙肝疫苗样品为我公司产品。
实施例1
将同批次的乙肝疫苗样品分别与硫酸、盐酸、磷酸混合，混合后于37℃水浴半小时，之后加入保护剂Triton100，再37℃水浴半小时。其中，三种酸的浓度均为1mol/L，样品与酸的体积比均为1:2，做若干平行试验并测定解析率，结果如表2所示。
表2：
酸的种类
解析率均值/％
盐酸
70.1250A
硫酸
47.3125B
磷酸
44.8750B
未使用同一字母表示数据存在显著差异。
由上可知，使用盐酸解析效果更优。
实施例2
将同批次的乙肝疫苗样品分别以体积比1:1、1:2、1:5与盐酸混合，混合后于37℃水浴半小时，之后加入保护剂Triton100，再37℃水浴半小时。其中，使用盐酸的浓度均为1mol/L，做若干平行试验并测定解析率，结果如表3所示。
表3：
体积比
解析率均值/％
1:1
76.7500A
1:2
70.1250B
1:5
67.3125C
未使用同一字母表示数据存在显著差异。
由上可知，产品与盐酸的比例在1:1时解析效果更优。
实施例3
将同批次的乙肝疫苗样品分别以体积比1:1与盐酸混合，混合后于37℃分别水浴0.5h、1h、2h、3h，之后加入保护剂Triton100，再37℃水浴半小时。其中，使用盐酸的浓度均为1mol/L，做若干平行试验并测定解析率，结果如表3所示。
表3：
水浴时间/h
解析率均值/％
3
88.1875A
2
88.6250A
1
78.6875B
0.5
72.8125C
未使用同一字母表示数据存在显著差异。
由上可知，水浴2h时解析效果更优。
实施例4
将同批次的乙肝疫苗样品分别以体积比1:1与盐酸混合，混合后于37℃水浴2h，之后加入保护剂Triton100，再于37℃下分别水浴0.5h、1h、2h、3h。其中，使用盐酸的浓度均为1mol/L，做若干平行试验并测定解析率，结果如表4所示。
表4：
水浴时间/h
解析率均值/％
3
89.1875A
2
89.6875A
1
90.8750A
0.5
83.4375B
未使用同一字母表示数据存在显著差异。
由上可知，与保护剂Triton100的作用时间1h时解析效果更优。
实施例5
样品的解析条件最终确定为盐酸与产品比例在1:1，水浴2h后，再加入保护剂Triton100，水浴1h。但是样品的解析率在90％，仍未达到100％。加入对样品的前期处理，即将样品放置-20℃冰箱中连续冻融两次，进行实验。结果如表5所示。
表5：
样品
含量(ug/mL)
解析率/％
1
19.8
99
2
19.5
98
3
20.0
100
4
20.2
100
5
19.9
100
6
19.0
95
7
19.6
98
8
19.5
98
均值
19.7
99
由上可知，样品前处理对最终解析率具有突出的作用。
实施例6
本方法建立以后，由三名人员对三批样品分别进行测试，得到的样品解析率均为95％以上，人员的RSD均<5％，结果见表6，说明此方法效果显著。
表6：
提供了一种解析乙肝疫苗的新型方法，即样品解析之前于-20℃反复冻融两次，用HCL与疫苗1:1混合，37℃孵育2h，后再加入保护剂Triton100，37℃水浴1h。将乙肝疫苗从佐剂中解析的解析率由40％左右提升至95％以上，使乙肝疫苗的有效成分得以与佐剂有效分离，从而可通过免疫试剂盒对其有效成分进行准确监测。
由于之前解析液解析率低，现有的测定乙肝疫苗活性的方法为动物法，新解析方式发明后可以有效替代动物实验。