一种快速鉴定驴、马源成分及制品中驴、马源成分的试剂盒及其应用
阅读说明：本技术 一种快速鉴定驴、马源成分及制品中驴、马源成分的试剂盒及其应用 (Kit for rapidly identifying donkey and horse-derived components and donkey and horse-derived components in product and application of kit ) 是由 齐鹏飞 张伟 朱曼玲 张燕 王怀中 黄迪海 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种快速鉴定驴源成分及其制品中驴源成分的试剂盒,属于动物种源性成分分子检测技术领域。试剂盒包括SEQ-ID-No.1～3所示引物、探针、RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、以及阳性和阴性质控品。此外还包括马的特异性引物及探针,其核苷酸序列如SEQ-ID-No.4～6所示。本发明采用RAA荧光法在30-42℃下进行等温扩增,5-20min完成检测,可判定样品中是否含有驴源成分,以及是否掺有马源成分。本发明的试剂盒操作简单,可以为肉类、皮张中驴源成分的分子鉴定及其中掺假成分的检测提供快速、灵敏、准确的检测方法；配合小型便携式仪器,既适用于实验室大规模检测,也适合基层和现场的快速检测,具有良好的应用前景。(The invention provides a kit for rapidly identifying donkey-derived components and donkey-derived components in products thereof, and belongs to the technical field of molecular detection of animal-derived components. The kit comprises primers shown in SEQ-ID-Nos. 1-3, a probe, an RAA fluorescent universal reaction reagent, a reaction buffer solution and positive and negative quality control substances. In addition, the kit also comprises horse specific primers and probes, and the nucleotide sequences of the primers and probes are shown in SEQ-ID-Nos. 4-6. The method adopts an RAA fluorescence method to perform isothermal amplification at 30-42 ℃, completes detection within 5-20min, and can judge whether the sample contains donkey source components or not and whether horse source components are doped or not. The kit is simple to operate, and can provide a rapid, sensitive and accurate detection method for molecular identification of donkey-derived components in meat and skin and detection of adulterated components in the donkey-derived components; the kit is matched with a small portable instrument, is suitable for large-scale laboratory detection and rapid detection of a basic level and a site, and has good application prospect.)
技术领域
本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一种快速鉴定驴、马源成分及制品中驴、马源成分的试剂盒及其应用。
背景技术
驴肉自古便享有“天上龙肉，地上驴肉”的美誉，足以见得驴肉的味道口感之绝美。其实，驴肉的营养价值并不低于甚至高于牛、羊、猪肉。其具有“三高三低”特点,即高蛋白、高必需氨基酸、高必需脂肪酸，低脂肪、低胆固醇、低热量，是不可多得的健康肉质品。驴肉营养丰富、味道鲜美，对预防肥胖和心血管疾病也有很好的效果。
随着经济快速的发展和人们生活水平的提高，物质和精神消费需求开始呈现多样化,对畜产品品质的要求越来越高。驴肉肉质鲜美、风味独特，其相关肉制品深受消费者的喜爱，需求量日益增大。与此同时，驴肉及制品的质量安全问题也成为社会和监管部门关注的重点。驴肉及制品的掺假已成为一个较为严重的社会性问题，称之为“经济利益驱动的掺假”。为了追求利益，一些不法商贩用低质的马肉冒充优质的驴肉从中牟利，驴肉制品来源的安全性已成为消费者最关心的问题之一。因此，针对驴源性制品建立一套快速、灵敏、准确的检测方法是十分必要的。
依靠感官和经验鉴别动物产品的方法已不能达到对驴肉及其加工制品的掺假进行控制与监管的目的。近年来，具有高度稳定性和在不同组织中同一性的DNA被用作动物源性成分的检测靶点。包括以普通的聚合酶链式反应(PCR)技术、荧光定量PCR技术（RT-PCR）已成为动物源性成分鉴定的主流方法（曹琛福，宗卉，张彩虹等.驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针；中国专利：CN102311999A，一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法。PCR以及RT-PCR有一个共同的不足，就是耗时久，通常需要2小时以上才能得到结果。因此，一种更加快速、灵敏、准确鉴别肉类掺假的检测方法成为迫切的需求。RAA（重组酶介导的等温扩增）可以在35-42℃条件下，只需5-20min既可完成扩增的快速、灵敏、准确的DNA扩增技术。
目前用于能同时鉴别驴、马肉源性成分的快速检测方法尚未见报道。此外，在驴皮张中动物源性成分掺假的现象也非常普遍发生。因此，建立一种快速鉴别驴、马源成分的检测方法将对驴肉食品及制品***的意义重大。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术耗时久的不足，提供一种RAA荧光法快速鉴定驴源成分的引物、探针或试剂盒，可实现在30min内完成样品检测，具有快速、灵敏、准确的特点，可以满足实验室大规模检测及现场快速检测的需求。
本发明的目的还在于提供鉴别驴源制品掺假马肉的快速检测方法。
为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面对驴基因组特异性DNA序列进行了筛选，通过在驴、马的基因组DNA中的检测，筛选驴特异性的、在马或其他动物种中不存在或同源性较低的DNA片段作为检测靶标。经过大量的分析和实验，最终获得可供检测用的驴特异性DNA序列。
本发明首先提供一种RAA荧光法快速检测驴特异性DNA片段的引物或探针，所述引物或探针序列如下：
EA-A：5’-CAAGATGCTCCCATAATTGGAACACCTGATG-3’，SEQ-ID-NO.1；
EA-B：5’-GTAGAGCCTTGTGAAGCAGTGTCTGAGAAC-3’，SEQ-ID-NO.2。
EA-C：5’- CCACAACTGACGGAGACCTGTGCACTGGC[FAM-dT]G[THF]C[BHG1-dT]GGACCCACAGAAGC[C3-spacer]-3’；SEQ-ID-NO.3；
所述探针采用荧光报告基团FAM-dT和荧光淬灭基团BHG1-dT进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基GCC，其中间碱基C用四氢呋喃残基THF替换，所述的探针EA-C的3’端连接有C3-spacer。
进一步，本发明提供含有上述特异性引物或探针的检测试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括以下引物或探针：
RAA荧光法检测马特异性DNA片段的引物，所述引物或探针序列如下：
EC-D：5'-CGGCCTCCATTCTCAGTGACAAGGCGGTGAA-3'，SEQ-ID-NO.4；
EC-E：5'-CGCAGGACGCAGTTCTCGAACGTCTTGGGTG-3'，SEQ-ID-NO.5。
EA-F：5’-tctcctcccaccttgtgggtatcccgggc[fam-dt]c[thf]a[bhg1-dt]gcggatgctgccag[c3-spacer]-3’；SEQ-ID-NO.6；
所述探针EA-F采用荧光报告基团FAM-dT和荧光淬灭基团BHG1-dT进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基CAA，其中间碱基A用四氢呋喃残基THF替换;所述的探针EA-F的3’端连接有C3-spacer。
进一步，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种： RAA荧光法通用反应试剂、阴、阳性质控品；所述阳性质控品为驴基因组DNA模板，所述阴性质控品为ddH2O或纯化水。
进一步，所述阳性质控品还包括马基因组DNA模板。
进一步，本发明提供上述的RAA荧光法用驴特异性引物或探针或检测试剂盒在驴源成分鉴定或驴源制品掺假检测中的应用。
本发明还提供一种RAA荧光法检测驴源成分及其制品中马源成分的方法，其步骤叙述如下：
1)样品基因组DNA模板的制备；
2)RAA荧光法等温扩增：在30-42℃下等温扩增5-20min；
A)用RAA荧光法检测驴源成分的引物及RAA荧光法检测驴源成分的探针对样品进行RAA荧光法检测，并以驴基因组DNA模板为阳性对照，以ddH2O或纯化水为阴性对照；得到试剂盒；
B)用A）的试剂盒，对样品进行RAA荧光法检测，并以驴基因组DNA模板、马DNA模板中的一种或多种为阳性对照，以ddH2O或纯化水为阴性对照；
3)结果的分析判定。
本发明的有益效果
1、同时鉴别驴、马肉源性成分的快速检测方法
可实现在30min内完成样品检测，具有快速、灵敏、准确的特点，可以满足实验室大规模检测及现场快速检测的需求。本发明的试剂盒操作简单，可以为肉类、皮张中驴源成分的分子鉴定及其中掺假成分的检测提供快速、灵敏、准确的检测方法；配合小型便携式仪器，既适用于实验室大规模检测，也适合基层和现场的快速检测，具有良好的应用前景。
2、在食品***上的作用
在驴皮张中动物源性成分掺假的现象也非常普遍发生。因此，建立一种快速鉴别驴、马源成分的检测方法将对驴肉食品及制品***的意义重大。
具体实施方式
以下实施例用于进一步对本发明进行说明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的保护范围。
实施例1样品中驴源成分的特异性检测
1.样品的制备与保存
1.1取样
采集驴肉样品1g，于-20℃下保存备用。
1.2DNA模板制备
DNA模板制备既可使用常规的抽提法也可使用市售的免抽提试剂盒，制备好的模板4℃存放备用，或于-20℃下保存备用。
2.引物设计
本实施例引物或探针的DNA序列如SEQ-ID-NO：1~3所示。
本发明设计的驴特异性引物探针
EA-A：5’-CAAGATGCTCCCATAATTGGAACACCTGATG-3’，SEQ-ID-NO.1；
EA-B：5’-GTAGAGCCTTGTGAAGCAGTGTCTGAGAAC-3’，SEQ-ID-NO.2。
EA-C：5’- CCACAACTGACGGAGACCTGTGCACTGGC[FAM-dT]G[THF]C[BHG1-dT]GGACCCACAGAAGC[C3-spacer]-3’；SEQ-ID-NO.3；
3. 选择荧光报告基团和荧光淬灭基团
采用无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的RAA-F1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为FAM荧光，因此荧光报告基团选为FAM，荧光淬灭基团选为BHQ1。
也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光报告基团选择为HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。荧光淬灭基团选择TAMRA、Eclipse、BHQ2、BHQ3或DABCYL。但优选荧光报告基团为FAM、HEX，优选荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2。
所述探针的修饰方法优选包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基GCC，其中中间位置的碱基C用四氢呋喃残基替换。经过修饰的探针EA-C为：CCACAACTGACGGAGACCTGTGCACTGGC[FAM-dT]G[THF]C[BHG1-dT]GGACCCACAGAAGC[C3-spacer]。
4 RAA荧光法检测
本实施例中RAA荧光通用反应试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号F00001，按照说明书严格操作。具体操作步骤叙述如下：
1）接通仪器（RAA-F1620）电源进行预热，设置好反应参数：温度39℃，时间20min。
2）重溶RAA反应缓冲液，按表3配置反应体系，同时设置阴阳性对照。
表3RAA荧光法反应体系
名称
体积（μl）
RAA通用反应缓冲液
25
ddH2O
15.7
EA-F
2.1
EA-R
2.1
EA-p
0.6
硫酸镁
2.5
DNA模板
2
合计
50
3）上述步骤2）的反应体系充分混匀后放入仪器RAA-F1620进行检测。
5检测结果的分析与判定
5.1对照检测结果分析
根据RAA-F1620仪器的阳性判定方法，斜率值K≥20，判为阳性；斜率值K＜20，判为阴性；阳性对照应当斜率值K≥20，阴性对照应当斜率值K＜20，表明反应体系正常，可进行结果判定。
5.2样品检测结果的分析与判定
若样品斜率值K≥20，判为阳性，即“样品中检测出驴源成分”；若斜率值K＜20，判为阴性，即“样品中未检测出驴源成分”。
实施例2灵敏度试验
分别使用0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL不同浓度的驴基因组DNA模板，按照实施例1的条件进行检测。1ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较高的灵敏性。
实施例3检测驴源性制品中掺入马源性成分的引物组
本发明是对于驴、马源性成分的检测，通过使用各物种相应引物探针的进行RAA荧光法检测，判断是否为或含有马的DNA，进而判定是否有马源性成分掺入。
1样品DNA模板的制备
各物种DNA模板的制备及保存方法同前实施例1中所述。
2引物的设计
本实施例引物或探针的DNA序列如SEQ-ID-NO：4~6所示。
本发明设计的马特异性引物探针
EC-D：5'-CGGCCTCCATTCTCAGTGACAAGGCGGTGAA-3'，SEQ-ID-NO.4；
EC-E：5'-CGCAGGACGCAGTTCTCGAACGTCTTGGGTG-3'，SEQ-ID-NO.5。
EA-F：5’-tctcctcccaccttgtgggtatcccgggc[fam-dt]c[thf]a[bhg1-dt]gcggatgctgccag[c3-spacer]-3’；SEQ-ID-NO.6；
3.选择荧光报告基团和荧光淬灭基团
选择荧光报告基团和荧光淬灭基团的选择同前实施例1中所述，经过修饰的探针如下所述：EC-F：TCTCCTCCCACCTTGTGGGTATCCCGGGC[FAM-dT]C[THF]A[BHG1-dT]GCGGATGCTGCCAG[C3-spacer]-3′。
4 RAA荧光法检测
本实施例的检测方法同前实施例1所述。
5检测结果的分析与判定
结果表明：特异性引物均只能对相应物种的DNA模板进行扩增，特异性良好。
实施例4一种检测驴、马源性成分的试剂盒
该试剂盒的组成包括：
引物及探针(驴、马引物及探针SEQIDNo.1~6和各一份)；
RAA荧光法通用缓冲液；
阳性质控品(驴、马基因组DNA模板各一份)；
ddH20。
试剂盒的应用方法如前实施例1或实施例3所述。
实施例5一种检测驴、马源性成分试剂盒的应用
1.样品DNA模板的制备、RAA荧光法检测及结果的分析判定同前实施例1或实施3所述。
2.将该检测方法应用于市面上驴肉制品的检测，购买不同商家的驴肉火烧等驴肉制品，并记录基本信息，制备DNA模板，进行RAA荧光法检测，检测其中的真实组分。
3.用本发明的试剂盒对于市面上获取的13组样品进行了检测，结果显示，其中仅6个是合格产品，有7组的PCR检测结果与食品标签有所不同，检测结果表明，7个产品有马肉的掺假现象。
本发明的方法应用于驴源性产品检测将具有广阔的前景。除可对驴肉或驴肉制品进行检测外，也可广泛应用于皮张制品和中药成分检测等驴产品相关领域。
序列表
<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种快速鉴定驴、马源成分及制品中驴、马源成分的试剂盒及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
caagatgctc ccataattgg aacacctgat g 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
gtagagcctt gtgaagcagt gtctgagaac 30
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
ccacaactga cggagacctg tgcactggcg cggacccaca gaagc 45
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
cggcctccat tctcagtgac aaggcggtga a 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
cgcaggacgc agttctcgaa cgtcttgggt g 31
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
tctcctccca ccttgtgggt atcccgggcc agcggatgct gccag 45