阅读说明：本技术 一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法 (Method for removing endotoxin in refining process of human urokinase raw material ) 是由 顾京 李争 倪萌 蔡宏兵 唐维 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法,涉及生物工程及化学工程领域,该方法具体包括以下步骤：(1)样品预处理；(2)层析柱制备与装柱；(3)消毒以及上样处理。该方法通过采用一种新的聚合物阴离子层析介质并优化各项工艺条件,处理过程简单,可以有效去除尿激酶中间产品中的内毒素,同时保证尿激酶活性收率达到75％以上。在该处理过程中,节约了工时与材料,降低了生产成本。(The invention provides a method for removing endotoxin in the refining process of human urokinase raw material, which relates to the field of biological engineering and chemical engineering, and specifically comprises the following steps: (1) sample pretreatment; (2) preparing a chromatographic column and filling the chromatographic column; (3) and (4) sterilizing and loading. The method adopts a new polymer anion chromatography medium and optimizes various process conditions, has simple treatment process, can effectively remove endotoxin in the intermediate product of urokinase, and simultaneously ensures that the activity yield of urokinase reaches more than 75 percent. In the treatment process, the working hours and materials are saved, and the production cost is reduced.)

一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法

技术领域

本发明涉及生物工程及化学工程领域，具体涉及一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法。

背景技术

尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物，它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力，所以，尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且它是无抗原性问题，可长时间使用。尿激酶作为注射药物，成品对内毒素有着严格要求，药典中对于尿激酶成品中内毒素的含量有明确要求(<1EU/1万单位)，因此在尿激酶原料生产过程中必须有效去除内毒素。但目前为止，大多数的技术仍是将内毒素的去除和尿激酶的纯化工艺分离，从而增加了生产成本。

中国专利CN104031901B公开了一种纯化尿激酶的方法，该发明将尿激酶粗品中2个主要分子量区域的蛋白分开处理，通过调节pH值等手段进一步去除粗品中的杂质、热源和细胞内毒素，得到了尿激酶精品。但该发明的方法较为复杂，同时该方法中主要使用超滤膜进行超滤，由于超滤膜大部分不能进行化学处理，因此使用寿命较短，在更换层面会增加成本。

针对尿激酶纯化方法存在的复杂、成本高以及尿激酶活性收率低等问题，亟需寻找一种活性收率高、去除效果优良的尿激酶去除内毒素的方法，从而有效去除尿激酶中间产品中的内毒素的同时降低生产成本。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法，该方法通过采用一种新的聚合物阴离子层析介质并优化各项工艺条件，处理过程简单，可以有效去除尿激酶中间产品中的内毒素，同时操作简便、节约工时与材料，降低了生产成本。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：调节人尿激酶原料中间体溶液的pH和电导；

(2)层析柱制备与装柱：向聚合物阴离子交换层析填料中加水，得到混悬液，装柱，得到层析柱；

(3)消毒：对层析柱和层析系统消毒，检测内毒素，结果为阴性；

(4)上样处理：使用平衡缓冲液平衡层析柱，待紫外、电导和pH稳定后上样，上样的样品为步骤(1)的人尿激酶原料中间体溶液，层析系统检测到流穿峰紫外吸收>50mAU时开始收集流穿液体，上样结束后，继续使用平衡缓冲液冲洗层析柱，直至系统检测到紫外吸收<50mAU，停止收集，收集液即为去除内毒素的尿激酶原料溶液。

进一步地，步骤(1)中所述pH为6.0-9.0，所述电导为1-10ms/cm。

进一步地，步骤(1)中所述人尿激酶原料中间体溶液为经过亲和层析步骤纯化以后的洗脱液。

进一步地，步骤(2)中所述聚合物阴离子交换层析填料为英国漂莱特树脂有限公司的Chromalite MQ/F弱碱阴离子树脂、日本东曹株式会社的TOYOPEARL离子交换树脂superQ-650M或美国通用电气公司的SOURCE 30Q高速低反压离子交换介质。

优选地，步骤(2)中所述聚合物阴离子交换层析填料为英国漂莱特树脂有限公司的Chromalite MQ/F弱碱阴离子树脂。

进一步地，步骤(2)中所述装柱的柱高为10-30cm，层析柱的直径为1.6-30cm。

进一步地，步骤(2)中所述装柱的具体步骤为：用注射用水置换层析填料中的保存液，一共三次；启动层析系统，用注射用水排干净层析系统和层析柱柱头筛网的空气，混匀层析填料和水，一次性匀速加入层析柱中；装上层析柱柱头，排干净管道中的气泡，打开层析柱出口阀，开始装柱；随着时间延长，层析填料在层析柱中沉降为一个稳定柱床，停泵，关闭出口阀，将层析柱进口的柱头阀切换到排气口，通过旋转层析柱柱头调节装置将柱头下方的水排出，并确保柱头筛网紧紧接触层析填料，装柱完成。

更进一步地，步骤(2)中所述装柱的具体步骤为：用注射用水置换层析填料中的保存液，一共三次，最后一次置换结束后调整层析填料:水的比例为1:0.4-1；启动层析系统，用注射用水排干净层析系统和层析柱柱头筛网的空气，充分混匀层析填料和水，一次性匀速加入层析柱中；装上层析柱柱头，排干净管道中的气泡，调整流速为30-60cm/h，打开层析柱出口阀，开始装柱；随着时间延长，层析填料会在层析柱中沉降为一个稳定柱床，此时停泵，关闭出口阀，将层析柱进口的柱头阀切换到排气口，通过旋转层析柱柱头调节装置将柱头下方的水排出，并确保柱头筛网紧紧接触层析填料，装柱完成。

进一步地，步骤(2)中所述层析具体步骤为：使用NaOH溶液，连续冲洗3-5个柱体积；使用注射用水，连续冲洗5-10个柱体积。

更进一步地，步骤(2)中所述层析具体步骤为：使用0.1-2M NaOH溶液，设定层析系统流速为30-60cm/h，连续冲洗3-5个柱体积；使用注射用水，设定层析系统流速为60-90cm/h，连续冲洗5-10个柱体积。

进一步地，步骤(4)中所述平衡缓冲液为包括磷酸盐缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液。优选为磷酸缓冲液。

进一步地，步骤(4)中所述平衡的条件为紫外水平线上下偏差<0.1mAU，pH为6.0-9.0，电导为1-10ms/cm。

进一步地，用清洗液冲洗层析柱，去除层析填料上吸附的杂质(主要为内毒素)，待层析系统检测到紫外吸收归零且稳定时，用注射用水冲洗层析柱直至pH中性、内毒素检测阴性。其中，清洗液为2-6M盐酸胍、0.1-2M NaOH溶液或20-50％乙醇，清洗时间为0.5-2小时。

本发明所取得的技术效果是：

1.本发明中的方法通过采用一种新的聚合物阴离子层析介质并优化各项工艺条件，处理过程简单，可以有效去除尿激酶中间产品中的内毒素，同时操作简便、节约工时与材料，降低了生产成本。

2.本发明中使用的聚合物阴离子层析介质包括英国漂莱特树脂有限公司的Chromalite MQ/F弱碱阴离子树脂、日本东曹株式会社的TOYOPEARL离子交换树脂superQ-650M和美国通用电气公司的SOURCE 30Q高速低反压离子交换介质，相比于其他介质，上述三种材料在内毒素去除方面具有显著的优势，结合本发明中的工艺优化，能够有效地去除内毒素，同时保证尿激酶活性收率达到75％以上。

具体实施方式

值得说明的是，本发明中使用的聚合物阴离子交换层析填料如表1所示，其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。

表1层析填料

层析填料	公司/厂家
		Chromalite MQ/F	英国漂莱特树脂有限公司(Purolite)
TOYOPEARL superQ-650M	日本东曹株式会社(TOSOH)
		SOURCE 30Q	美国通用电气公司(GE)

实施例1

一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：调节人尿激酶原料中间体溶液的pH至6.0和电导至1ms/cm；

(2)层析柱制备与装柱：向日本东曹株式会社的TOYOPEARL离子交换树脂superQ-650M中加水，得到混悬液，装柱，得到层析柱；其中，装柱的柱高为10cm，层析柱的直径为1.6cm；其中，装柱的具体步骤为：用注射用水置换层析填料中的保存液，一共三次，最后一次置换结束后调整层析填料:水的比例为1:0.4；启动层析系统，用注射用水排干净层析系统和层析柱柱头筛网的空气，充分混匀层析填料和水，一次性匀速加入层析柱中；装上层析柱柱头，排干净管道中的气泡，调整流速为30cm/h，打开层析柱出口阀，开始装柱；随着时间延长，层析填料会在层析柱中沉降为一个稳定柱床，此时停泵，关闭出口阀，将层析柱进口的柱头阀切换到排气口，通过旋转层析柱柱头调节装置将柱头下方的水排出，并确保柱头筛网紧紧接触层析填料，装柱完成。层析具体步骤为：使用0.1M NaOH溶液，设定层析系统流速为30cm/h，连续冲洗5个柱体积；使用注射用水，设定层析系统流速为60cm/h，连续冲洗10个柱体积；

(3)消毒：对层析柱和层析系统消毒，检测内毒素，结果为阴性；

(4)上样处理：使用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，平衡的条件为紫外水平线上下偏差<0.1mAU，pH为6.0，电导为1ms/cm，待紫外、电导和pH稳定后上样，上样的样品为步骤(1)的人尿激酶原料中间体溶液，层析系统检测到流穿峰紫外吸收>50mAU时开始收集流穿液体，上样结束后，继续使用平衡缓冲液冲洗层析柱，直至系统检测到紫外吸收<50mAU，停止收集，收集液即为去除内毒素的尿激酶原料溶液。

另外，使用后的层析柱需要进行处理，处理方式为：用清洗液冲洗层析柱，去除层析填料上吸附的杂质(主要为内毒素)，待层析系统检测到紫外吸收归零且稳定时，用注射用水冲洗层析柱直至pH中性、内毒素检测阴性。其中，清洗液为2M盐酸胍，清洗时间为0.5小时。

实施例2

一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：调节人尿激酶原料中间体溶液的pH至9.0和电导至10ms/cm；

(2)层析柱制备与装柱：向美国通用电气公司的SOURCE 30Q高速低反压离子交换介质中加水，得到混悬液，装柱，得到层析柱；其中，装柱的柱高为30cm，层析柱的直径为30cm；其中，装柱的具体步骤为：用注射用水置换层析填料中的保存液，一共三次，最后一次置换结束后调整层析填料:水的比例为1:1；启动层析系统，用注射用水排干净层析系统和层析柱柱头筛网的空气，充分混匀层析填料和水，一次性匀速加入层析柱中；装上层析柱柱头，排干净管道中的气泡，调整流速为60cm/h，打开层析柱出口阀，开始装柱；随着时间延长，层析填料会在层析柱中沉降为一个稳定柱床，此时停泵，关闭出口阀，将层析柱进口的柱头阀切换到排气口，通过旋转层析柱柱头调节装置将柱头下方的水排出，并确保柱头筛网紧紧接触层析填料，装柱完成。层析具体步骤为：使用2M NaOH溶液，设定层析系统流速为60cm/h，连续冲洗3个柱体积；使用注射用水，设定层析系统流速为90cm/h，连续冲洗5个柱体积；

(3)消毒：对层析柱和层析系统消毒，检测内毒素，结果为阴性；

(4)上样处理：使用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，平衡的条件为紫外水平线上下偏差<0.1mAU，pH为9.0，电导为10ms/cm，待紫外、电导和pH稳定后上样，上样的样品为步骤(1)的人尿激酶原料中间体溶液，层析系统检测到流穿峰紫外吸收>50mAU时开始收集流穿液体，上样结束后，继续使用平衡缓冲液冲洗层析柱，直至系统检测到紫外吸收<50mAU，停止收集，收集液即为去除内毒素的尿激酶原料溶液。

另外，使用后的层析柱需要进行处理，处理方式为：用清洗液冲洗层析柱，去除层析填料上吸附的杂质(主要为内毒素)，待层析系统检测到紫外吸收归零且稳定时，用注射用水冲洗层析柱直至pH中性、内毒素检测阴性。其中，清洗液为2M NaOH溶液，清洗时间为2小时。

实施例3

一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：调节人尿激酶原料中间体溶液的pH至8.0和电导至5ms/cm；

(2)层析柱制备与装柱：向英国漂莱特树脂有限公司的Chromalite MQ/F弱碱阴离子树脂中加水，得到混悬液，装柱，得到层析柱；其中，装柱的柱高为20cm，层析柱的直径为20cm；其中，装柱的具体步骤为：用注射用水置换层析填料中的保存液，一共三次，最后一次置换结束后调整层析填料:水的比例为1:0.8；启动层析系统，用注射用水排干净层析系统和层析柱柱头筛网的空气，充分混匀层析填料和水，一次性匀速加入层析柱中；装上层析柱柱头，排干净管道中的气泡，调整流速为50cm/h，打开层析柱出口阀，开始装柱；随着时间延长，层析填料会在层析柱中沉降为一个稳定柱床，此时停泵，关闭出口阀，将层析柱进口的柱头阀切换到排气口，通过旋转层析柱柱头调节装置将柱头下方的水排出，并确保柱头筛网紧紧接触层析填料，装柱完成。层析具体步骤为：使用1M NaOH溶液，设定层析系统流速为50cm/h，连续冲洗4个柱体积；使用注射用水，设定层析系统流速为80cm/h，连续冲洗8个柱体积；

(3)消毒：对层析柱和层析系统消毒，检测内毒素，结果为阴性；

(4)上样处理：使用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，平衡的条件为紫外水平线上下偏差<0.1mAU，pH为8.0，电导为5ms/cm，待紫外、电导和pH稳定后上样，上样的样品为步骤(1)的人尿激酶原料中间体溶液，层析系统检测到流穿峰紫外吸收>50mAU时开始收集流穿液体，上样结束后，继续使用平衡缓冲液冲洗层析柱，直至系统检测到紫外吸收<50mAU，停止收集，收集液即为去除内毒素的尿激酶原料溶液。

另外，使用后的层析柱需要进行处理，处理方式为：用清洗液冲洗层析柱，去除层析填料上吸附的杂质(主要为内毒素)，待层析系统检测到紫外吸收归零且稳定时，用注射用水冲洗层析柱直至pH中性、内毒素检测阴性。其中，清洗液为30％乙醇，清洗时间为1小时。

对比例1

未经本发明中的方法处理的人尿激酶原料中间体溶液。

对比例2

与实施例3的区别在于，层析填料为美国通用电气公司的QAE sephadex A-25。

对比例3

与实施例3的区别在于，层析填料为D-160大孔吸附树脂。

对比例4

一种人尿激酶原料精制过程中去除内毒素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：调节人尿激酶原料中间体溶液的pH至5.5和电导至12ms/cm；

(2)层析柱制备与装柱：向英国漂莱特树脂有限公司的Chromalite MQ/F弱碱阴离子树脂中加水，得到混悬液，装柱，得到层析柱；其中，装柱的柱高为8cm，层析柱的直径32cm；其中，装柱的具体步骤为：用注射用水置换层析填料中的保存液，一共三次，最后一次置换结束后调整层析填料:水的比例为1:1.1；启动层析系统，用注射用水排干净层析系统和层析柱柱头筛网的空气，充分混匀层析填料和水，一次性匀速加入层析柱中；装上层析柱柱头，排干净管道中的气泡，调整流速为65cm/h，打开层析柱出口阀，开始装柱；随着时间延长，层析填料会在层析柱中沉降为一个稳定柱床，此时停泵，关闭出口阀，将层析柱进口的柱头阀切换到排气口，通过旋转层析柱柱头调节装置将柱头下方的水排出，并确保柱头筛网紧紧接触层析填料，装柱完成。层析具体步骤为：使用1M NaOH溶液，设定层析系统流速为65cm/h，连续冲洗4个柱体积；使用注射用水，设定层析系统流速为92cm/h，连续冲洗8个柱体积；

(3)消毒：对层析柱和层析系统消毒，检测内毒素，结果为阴性；

(4)上样处理：使用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，平衡的条件为紫外水平线上下偏差<0.1mAU，pH为5.5，电导为12ms/cm，待紫外、电导和pH稳定后上样，上样的样品为步骤(1)的人尿激酶原料中间体溶液，层析系统检测到流穿峰紫外吸收>50mAU时开始收集流穿液体，上样结束后，继续使用平衡缓冲液冲洗层析柱，直至系统检测到紫外吸收<50mAU，停止收集，收集液即为去除内毒素的尿激酶原料溶液。

另外，使用后的层析柱需要进行处理，处理方式为：用清洗液冲洗层析柱，去除层析填料上吸附的杂质(主要为内毒素)，待层析系统检测到紫外吸收归零且稳定时，用注射用水冲洗层析柱直至pH中性、内毒素检测阴性。其中，清洗液为30％乙醇，清洗时间为1小时。

取同一批次(20190426)人尿激酶原料中间体，收集采用实施例1-3和对比例1-4的方法得到的样品，用药典标准方法检测活性和内毒素，将试验结果统计至表2。

表2

由表2可知，经过本发明中方法处理的尿激酶原料内毒素含量<1EU/1万单位，符合药典检测方法的标准，尿激酶活性收率能够达到75％以上，尤其，当聚合物阴离子交换树脂为英国漂莱特树脂有限公司的Chromalite MQ/F弱碱阴离子树脂时，内毒素的含量最低，活性收率高达81％，而当将聚合物阴离子交换层析填料替换为其他交换介质时，内毒素的含量降低情况明显变差，同时活性收率也明显降低，由此可知，本申请中聚合物阴离子交换树脂类型的关键作用。而与各实施例相比，如对比例2-3所示，更换为其他层析填料进行处理后，内毒素的含量均较高，尿激酶活性收率均较低，由此可知，层析填料类型的重要性。另外，对比例4的相关参数均在本申请保护范围之外，进而内毒素的活性明显偏高，活性收率也明显偏低，可见本发明纯化方法中各类参数设置对于内毒素的含量及尿激酶活性收率有着十分重要的影响。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。