阅读说明：本技术 一种粗品尿激酶的纯化方法 (Method for purifying crude urokinase ) 是由 顾京 郭芬 张茜 韩庆坤 熊心磊 丁晶 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种粗品尿激酶的纯化方法,涉及生物工程及化学工程领域,该纯化方法包括以下步骤：(1)将新鲜男性尿液加入硅胶吸附,用水冲洗硅胶,氨水洗脱,收集洗脱液,向洗脱液中加入固体硫酸铵进行沉淀,过滤收集棕色的尿激酶沉淀,即为人尿激酶粗品；(2)使用平衡缓冲液平衡层析柱,待紫外、pH和电导稳定后,将步骤(1)得到的人尿激酶粗品溶解并上样,经过滤、葡聚糖凝胶层析后,使用洗脱液进行洗脱至直至UV280nm<0.1,收集洗脱液,得到尿激酶中间品；(3)使用异丙醇和NaOH溶液清洗层析柱,再用注射水冲洗至中性。从而实现了尿激酶粗品的高效回收,尿激酶的活性收率可达70％以上,满足量产经济效益要求。(The invention provides a purification method of crude urokinase, which relates to the field of biological engineering and chemical engineering, and comprises the following steps: (1) adding silica gel into fresh male urine for adsorption, washing the silica gel with water, eluting with ammonia water, collecting the eluate, adding solid ammonium sulfate into the eluate for precipitation, and filtering and collecting brown urokinase precipitate to obtain a human urokinase crude product; (2) balancing the chromatographic column by using an equilibrium buffer solution, dissolving and sampling the crude human urokinase obtained in the step (1) after ultraviolet, pH and electric conductivity are stable, eluting by using an eluent until the UV280nm is less than 0.1 after filtering and sephadex chromatography, and collecting the eluent to obtain a urokinase intermediate product; (3) the column was washed with isopropanol and NaOH solution and washed to neutrality with water for injection. Therefore, the high-efficiency recovery of the crude urokinase is realized, the activity yield of the urokinase can reach more than 70 percent, and the requirement of mass production on economic benefit is met.)

一种粗品尿激酶的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物工程及化学工程领域，具体涉及一种粗品尿激酶的纯化方法。

背景技术

尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物。它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以，尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且它是无抗原性问题，可长时间使用。

目前，尿激酶的分离纯化通常采用层析柱方法进行，比较常用的即为采用D-160吸附树脂纯化尿激酶，但吸附树脂存在的主要问题是处理步骤繁琐，大量使用强酸强碱，环保压力大，且大体积强酸的使用对工作环境和人的伤害也比较大。

中国专利CN106929497B公开了一种尿激酶的分离纯化方法。该方法包括如下步骤：1)尿激酶粗品的制备；2)尿激酶的纯化；所述的步骤2)包括如下步骤：将步骤1)制得的尿激酶粗品溶解后的澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱进行纯化。该发明提供的分离纯化方法，可同时提高尿激酶比活性达至2万IU/mg蛋白以上，收率达75-87％，大小分子尿激酶的比例大于85％；而且，由于尿激酶的分离纯化过程中避免使用强酸强碱，减少了环境污染。但该发明的分离纯化方法载量较低，流速较低，工艺经济性不好。

中国专利CN1164536公开了一种重组人尿激酶原的四步纯化工艺，是以CM-径向离子交换色谱法为基础，结合其它三种色谱法组成，该纯化工艺操作简易，纯化效率较高。纯化后尿激酶原比活性要提高280多倍，能除去杂蛋白98％以上，总回收率达到50％以上。但该发明中的纯化工艺仅是四步纯化方法的叠加，耗时较长、较为复杂且最终得到的收率相对而言较低。

针对现有的尿激酶粗品纯化方法存在的步骤繁琐、对环境造成大量污染等问题，应寻找一种操作简单、耗时段、污染小同时能够保证尿激酶活性收率的尿激酶粗品纯化方法。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种粗品尿激酶的纯化方法，该方法采用葡聚糖凝胶层析，结合其他工艺条件的优化，替代目前使用的D160大孔吸附树脂生产工艺，实现了尿激酶粗品的高效回收，活性收率>70％，满足量产经济效益要求。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种粗品尿激酶的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜男性尿液加入硅胶吸附，用水冲洗硅胶，氨水洗脱，收集洗脱液，向洗脱液中加入固体硫酸铵进行沉淀，过滤收集棕色的尿激酶沉淀，即为人尿激酶粗品；

(2)使用平衡缓冲液平衡层析柱，待紫外、pH和电导稳定后，将步骤(1)得到的人尿激酶粗品溶解并上样，经过滤、葡聚糖凝胶层析后，使用洗脱液进行洗脱至直至UV280nm<0.1，收集洗脱液，得到尿激酶中间品；

(3)使用异丙醇和NaOH溶液清洗层析柱，再用注射水冲洗至中性。

进一步地，步骤(2)中所述葡聚糖凝胶包括美国通用电气公司型号为CM sephadexC-25、SP sephadex C-25、CM sephadex C-50或SP sephadex C-50的葡聚糖凝胶。优选地，所述葡聚糖凝胶为美国通用公司型号为CM sephadex C-50的葡聚糖凝胶。

进一步地，步骤(1)中所述沉淀的温度为0-10℃。

进一步地，步骤(2)中所述洗脱液包括含有氯化钠的醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。优选地，所述洗脱液为含有氯化钠的醋酸盐缓冲液。进一步地，所述氯化钠浓度为0.1-1M，作用是增加离子强度，使尿激酶从层析柱上解吸附。

进一步地，步骤(2)中所述洗脱液的电导为15-90ms/cm，pH为6.5-9.0。

进一步地，步骤(2)中所述平衡缓冲溶液包括醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的一种或多种。优选为醋酸缓冲液。

进一步地，步骤(2)中所述平衡的状态为紫外水平线上下偏差<0.1Mau，电导值为1-25ms/cm，pH为6.5-9.0。

进一步地，步骤(3)具体为使用质量百分浓度为1-30％的异丙醇和0.1-1M的NaOH溶液清洗层析柱，冲洗时间为0.5-2h。

本发明所取得的技术效果是：

1.本发明中的方法采用葡聚糖凝胶层析，结合其他工艺条件的优化，替代目前使用的D-160吸附树脂生产工艺，实现了尿激酶粗品的高效回收，无须消耗大量盐酸，同时节约时间，能够保持尿激酶的活性收率>70％，满足量产经济效益要求；

2.本发明中的方法使用美国通用电气公司型号为CM sephadex C-25、SPsephadex C-25、CM sephadex C-50或SP sephadex C-50的葡聚糖凝胶，相比于其他类型的葡聚糖凝胶或层析填料，结合本发明工艺的优化能够保证尿激酶的活性收率。

具体实施方式

值得说明的是，本发明中使用的葡聚糖凝胶如表1所示，其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。

表1

实施例1

一种粗品尿激酶的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜男性尿液加入硅胶吸附，用水冲洗硅胶，氨水洗脱，收集洗脱液，向洗脱液中加入固体硫酸铵进行沉淀，沉淀温度为0℃，过滤收集棕色的尿激酶沉淀，即为人尿激酶粗品；

(2)使用平衡缓冲液平衡层析柱，待紫外、pH和电导稳定后(平衡的状态为紫外水平线上下偏差<0.1Mau，电导值为1ms/cm，pH为6.5)，将步骤(1)得到的人尿激酶粗品溶解并上样，经过滤、葡聚糖凝胶层析后，使用洗脱液进行洗脱至直至UV280nm<0.1，洗脱液的电导为15ms/cm，pH为6.5，收集洗脱液，得到尿激酶中间品；

(3)使用重量份数为1％的异丙醇和0.1M的NaOH溶液清洗层析柱，冲洗时间为2h，再用注射水冲洗至中性。

步骤(2)中的平衡缓冲液为磷酸缓冲液，洗脱液为含有浓度为的0.1M氯化钠的磷酸缓冲液，葡聚糖凝胶为美国通用电气公司型号为CM sephadex C-25的葡聚糖凝胶。

实施例2

一种粗品尿激酶的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜男性尿液加入硅胶吸附，用水冲洗硅胶，氨水洗脱，收集洗脱液，向洗脱液中加入固体硫酸铵进行沉淀，沉淀温度为10℃，过滤收集棕色的尿激酶沉淀，即为人尿激酶粗品；

(2)使用平衡缓冲液平衡层析柱，待紫外、pH和电导稳定后(平衡的状态为紫外水平线上下偏差<0.1Mau，电导值为25ms/cm，pH为9.0)，将步骤(1)得到的人尿激酶粗品溶解并上样，经过滤、葡聚糖凝胶层析后，使用洗脱液进行洗脱至直至UV280nm<0.1，洗脱液的电导为90ms/cm，pH为9.0，收集洗脱液，得到尿激酶中间品；

(3)使用重量份数为30％的异丙醇和1M的NaOH溶液清洗层析柱，冲洗时间为0.5h，再用注射水冲洗至中性。

步骤(2)中的平衡缓冲液为柠檬酸缓冲液，洗脱液为含有浓度为的1M氯化钠的柠檬酸缓冲液，葡聚糖凝胶为美国通用电气公司型号为SP sephadex C-25的葡聚糖凝胶。

实施例3

一种粗品尿激酶的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜男性尿液加入硅胶吸附，用水冲洗硅胶，氨水洗脱，收集洗脱液，向洗脱液中加入固体硫酸铵进行沉淀，沉淀温度为5℃，过滤收集棕色的尿激酶沉淀，即为人尿激酶粗品；

(2)使用平衡缓冲液平衡层析柱，待紫外、pH和电导稳定后(平衡的状态为紫外水平线上下偏差<0.1Mau，电导值为18ms/cm，pH为8.0)，将步骤(1)得到的人尿激酶粗品溶解并上样，经过滤、葡聚糖凝胶层析后，使用洗脱液进行洗脱至直至UV280nm<0.1，洗脱液的电导为50ms/cm，pH为8.0，收集洗脱液，得到尿激酶中间品；

(3)使用重量份数为20％的异丙醇和0.5M的NaOH溶液清洗层析柱，冲洗时间为1h，再用注射水冲洗至中性。

步骤(2)中的平衡缓冲液为醋酸缓冲液，洗脱液为含有浓度为的0.8M氯化钠的醋酸缓冲液，葡聚糖凝胶为美国通用电气公司型号为CM sephadex C-50的葡聚糖凝胶。

对比例1

现有技术常规粗品尿激酶的纯化方法，包括以下步骤：取尿激酶粗品溶解于磷酸缓冲液中，过滤除去不溶物，滤液上D160大孔树脂柱吸附，氨水洗脱，收集活性部分。使用盐酸清洗D160大孔树脂，每个生产周期至少清洗三次。

对比例2

与实施例3的区别仅在于，层析凝胶为CMC。

对比例3

与实施例3的区别仅在于，层析凝胶为724阳离子交换树脂。

对比例4

一种粗品尿激酶的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜男性尿液加入硅胶吸附，用水冲洗硅胶，氨水洗脱，收集洗脱液，向洗脱液中加入固体硫酸铵进行沉淀，沉淀温度为12℃，过滤收集棕色的尿激酶沉淀，即为人尿激酶粗品；

(2)使用平衡缓冲液平衡层析柱，待紫外、pH和电导稳定后(平衡的状态为紫外水平线上下偏差<0.1Mau，电导值为26ms/cm，pH为6.0)，将步骤(1)得到的人尿激酶粗品溶解并上样，经过滤、葡聚糖凝胶层析后，使用洗脱液进行洗脱至直至UV280nm<0.1，洗脱液的电导为12ms/cm，pH为10.0，收集洗脱液，得到尿激酶中间品；

(3)使用重量份数为0.8％的异丙醇和1.2M的NaOH溶液清洗层析柱，冲洗时间为2h，再用注射水冲洗至中性。

步骤(2)中的平衡缓冲液为醋酸缓冲液，洗脱液为含有浓度为的0.8M氯化钠的醋酸缓冲液，葡聚糖凝胶为美国通用电气公司型号为CM sephadex C-50的葡聚糖凝胶。

根据《中国药典》2015版第二部正文品种第一部分尿激酶部分计算各实例中尿激酶的活性收率，同时将工艺过程的盐酸用量和操作时间统计至表2。

表2

由表2可知，本发明的方法能够获得高活性收率的尿激酶，可达到71-76％，同时不使用盐酸，操作时间也较短，仅为43-46h。在相同活性收率条件下，使用葡聚糖凝胶工艺相比于旧工艺，操作更简便，环保压力小，不使用强酸，工作环境和人员安全都有保障，经济效益满足企业量产要求。而当将层析凝胶替换为其他类型的材料或各类参数在本发明保护范围之外时时，获得的尿激酶活性收率较低，同时操作时间也较长。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。