阅读说明：本技术 一种尿激酶的精制方法 (Method for refining urokinase ) 是由 顾京 李争 熊心磊 郭芬 张茜 于 2020-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种尿激酶的精制方法,属于尿激酶纯化技术领域。该方法包括以下步骤：取尿激酶中间体溶液,上凝胶色谱柱,用平衡缓冲液洗脱,收集中段洗脱液,得到精制的尿激酶溶液；其中,所述凝胶色谱的填料包括Superdex 75pg/GE、Superdex 200pg/GE、Sephacryl S-100HR/GE、Chromadex 75PG/BESTCHROM、Chromadex 200PG/BESTCHROM中的至少一种。该方法简便、安全、环保,纯度高、回收率好,适用范围广,通过优化各项工艺参数,仅需要通过一次凝胶色谱柱,满足量产经济效益要求。(The invention discloses a method for refining urokinase, belonging to the technical field of urokinase purification. The method comprises the following steps: taking the urokinase intermediate solution, loading the urokinase intermediate solution on a gel chromatographic column, eluting the urokinase intermediate solution by using an equilibrium buffer solution, and collecting middle-section eluent to obtain a refined urokinase solution; wherein the filler of the gel chromatography comprises at least one of Superdex 75PG/GE, Superdex 200PG/GE, Sephacryl S-100HR/GE, Chromadex 75PG/BESTCHROM and Chromadex200 PG/BESTCHROM. The method is simple, safe, environment-friendly, high in purity, good in recovery rate and wide in application range, and can meet the requirement of mass production economic benefit by optimizing various process parameters and only needing to pass through a gel chromatographic column once.)

一种尿激酶的精制方法

技术领域

本发明属于尿激酶纯化技术领域，具体涉及一种尿激酶的精制方法。

背景技术

尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物，是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种碱性蛋白，等电点在PH8.7左右，为白色非结晶状粉末，易溶于水。稀溶液性状不稳定，必须新鲜配用，且不得用酸性溶液稀释，冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似，也有酯酶的活力，无抗原性，不使体内产生抗体。体内半衰期为(14±6)min。

尿激酶能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以，尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且它无抗原性问题，可长时间使用。

尿激酶的精制过去一直采用D-160吸附树脂，吸附树脂存在的主要问题是处理步骤繁琐，大量使用强酸强碱，环保压力大，且大体积强酸的使用对工作环境和人的伤害也比较大。

中国专利申请200410018835.6公开了一种重组人尿激酶原的纯化方法，包括以下步骤：A.用阳离子交换Streaml ine-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶原；B.用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗产品；C.用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；D.用DEAE-SepharoseFast Flow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞的DNA,采用上述方法得到符合SFDA要求的重组人尿激酶原，总回收率在70％以上，纯度达到99％以上。

中国专利申请201711260186.4公开了一种1,一种溶血栓新药一重组人尿激酶原的四步纯化工艺，由羧甲基径向离子交换色谱(CM-RIEC)、微孔玻璃珠吸附色谱(MPG)、葡聚糖聚丙稀酰氨高效凝胶色谱(Sephacryl S-200HR)和对氨基本甲眯亲和色谱(PABZ)四步组成，其特征在于CM-径向离子交换色谱法与其他三个方法的组合配套。纯化后尿激酶原比活性要提高280多倍，能除去杂蛋白98％以上，总回收率达到50％以上。

但是以上方法均需要凝胶色谱与其他色谱柱联用，多次上不同的色谱柱，大大提高了纯化流程的复杂程度。

中国专利申请201710311962.2公开了一种尿激酶的分离纯化方法，该方法包括如下步骤：1)尿激酶粗品的制备；2)尿激酶的纯化；所述的步骤2)包括如下步骤：将步骤1)制得的尿激酶粗品溶解后的澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱进行纯化。本申请提供的分离纯化方法，可同时提高尿激酶比活性达至2万IU/mg蛋白以上，收率达75-87％，大小分子尿激酶的比例大于85％。该方法制备的粗品依次通过硅藻土柱和CM-C柱制得，纯度已经得到一定提高，直接用其纯化步骤用来纯化成品尿激酶产品不能取得同样的效果。

有鉴于此，本发明提供了一种简便、安全、环保的尿激酶精制方法，纯度高、回收率好，适用范围广，该方法通过优化各项工艺参数，仅需要通过一次凝胶色谱柱，满足量产经济效益要求。

发明内容

本发明的目的是在保证尿激酶纯度和回收率的前提下，采用高分辨率凝胶色谱，结合其他工艺条件的优化，简化尿激酶的纯化流程，满足量产经济效益要求，同时不需要使用强酸，安全环保。

为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：

一种尿激酶的精制方法，包括以下步骤：

取尿激酶中间体溶液，上凝胶色谱柱，用平衡缓冲液洗脱，收集中段洗脱液，得到精制的尿激酶溶液。

其中，所述凝胶色谱柱的填料包括Superdex 75pg/GE、Superdex 200pg/GE、Sephacryl S-100HR/GE、Chromadex 75PG/BESTCHROM、Chromadex 200PG/BESTCHROM中的至少一种，优选为Superdex 75pg。

优选的，所述尿激酶中间体溶液为人尿激酶中间体溶液，其纯度优选为65-85％，进一步优选为70％。

优选的，所述上凝胶色谱柱的蛋白浓度为2-20mg/mL，进一步优选为10mg/mL。

优选的，所述上凝胶色谱柱的上柱体积为柱体积的2-8％，进一步优选为5％。

优选的，所述平衡缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的至少一种，优选为柠檬酸盐缓冲液；所述缓冲液中含有氯化钠，缓冲液中氯化钠含量为150-500mM。

优选的，所述平衡缓冲液的pH4.5-8.0，进一步优选为6。

优选的，所述洗脱在电导值15-90ms/cm条件下进行，进一步优选为50ms/cm。

优选的，所述中段洗脱液是指保留时间40-70min的液体，进一步优选为55min。

优选的，在得到精制的尿激酶溶液后，还包括清洗的步骤；所述清洗步骤优选为：使用清洗溶液清洗柱子，再用注射水冲洗至中性；进一步优选的，所述清洗溶液为0.1-2M的NaOH溶液，所述清洗的时间为0.5-2小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

在保证良好的活性收率条件下，使用凝胶色谱工艺，操作简便，纯度高、回收率好，适用范围广；不使用强酸，环保压力小，工作环境和人员安全都有保障，经济效益满足企业量产要求。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所用的尿激酶中间体溶液为本公司自产，批号为20190426、20190518。

实施例1

取20190426批高纯人尿激酶中间体溶液，纯度为70％，按照蛋白浓度2mg/mL、柱体积2％上样体积，上高分辨率凝胶色谱柱Superdex 200pg，用pH4.5，含150mM氯化钠的醋酸盐缓冲液冲洗柱子，洗脱在电导值15ms/cm条件下进行。收集保留40min中段洗脱液，即为精制的尿激酶溶液。

完成后使用0.1M NaOH溶液清洗柱子2小时，用注射水冲洗至中性。

实施例2

取20190518批高纯人尿激酶中间体溶液，纯度为70％，按照蛋白浓度20mg/mL、柱体积8％上样体积，上高分辨率凝胶色谱柱Sephacryl S-100HR，用pH8.0，含500mM氯化钠的磷酸盐缓冲液冲洗柱子，洗脱在电导值90ms/cm条件下进行。收集保留70min中段洗脱液，即为精制的尿激酶溶液。

完成后使用2M NaOH溶液清洗柱子0.5小时，用注射水冲洗至中性。

实施例3

取20190426批高纯人尿激酶中间体溶液，纯度为70％，按照蛋白浓度10mg/mL、柱体积5％上样体积，上高分辨率凝胶色谱柱Superdex 75pg，用pH6，含150mM氯化钠的柠檬酸盐缓冲液冲洗柱子，洗脱在电导值50ms/cm条件下进行。收集保留55min中段洗脱液，即为精制的尿激酶溶液。

完成后使用1M NaOH溶液清洗柱子1小时，用注射水冲洗至中性。

实施例4

与实施例3不同的是，选用高分辨率凝胶色谱柱Chromadex 75PG，其余皆相同。

实施例5

与实施例3不同的是，平衡缓冲液选用Tris-HCl缓冲液，其余皆相同。

实施例6

与实施例1不同的是，选用高分辨率凝胶色谱柱Superdex 75pg，其余皆相同。

实施例7

与实施例1不同的是，上凝胶色谱柱的蛋白浓度为10mg/mL，其余皆相同。

对比例1

与实施例3不同的是，选用CM-葡聚糖微球柱，其余皆相同。

对比例2

与实施例3不同的是，选用CM-琼脂糖微球柱，其余皆相同。

对比例3

与实施例3不同的是，上凝胶色谱柱的蛋白浓度为30mg/mL，其余皆相同。

测试例

根据中国药典二部测定和计算实施例和对比例所的产品的纯度、活性收率，结果如表1所示。

表1.

批号	纯度	活性收率
			实施例1	95％	76％
实施例2	95％	72％
			实施例3	99％	83％
实施例4	97％	79％
			实施例5	96％	78％
实施例6	95％	74％
			实施例7	96％	76％
对比例1	88％	68％
			对比例2	89％	67％
对比例3	91％	71％

从表1中可以看出，本发明实施例所的产品的纯度均不低于95％，活性收率不低于70％，实施例3为最佳实施例，其纯度为99％。活性收率为83％，证明该实施例下的各方面工艺参数为最佳。但是，由实施例6和7发现，单一因素的改变并不会明显提高最终效果，证明本方案的工艺参数综合作用提高了纯度和收率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。