阅读说明：本技术 一种用琼脂糖凝胶4b吸附尿液中尿激酶的方法 (Method for adsorbing urokinase in urine by using agarose gel 4B ) 是由 顾京 李争 刘艳红 郭芬 唐维 魏飘飘 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用琼脂糖凝胶4B吸附尿液中尿激酶的方法,涉及分离提取技术领域。该方法包括如下步骤：(1)将琼脂糖凝胶4B亲和包放入过滤瓶中,使尿液穿过琼脂糖凝胶4B亲和包流入过滤瓶；(2)尿液流完后取出琼脂糖凝胶4B亲和包,装入层析柱,用缓冲液洗涤,然后用解脱液解脱,待解脱液流出颜色发生变化时进行收集,即得尿激酶溶液；(3)将步骤(2)所得的尿激酶溶液冷冻干燥,得尿激酶粉末。本发明提供的吸附尿液中尿激酶的方法无需对尿液进行处理,操作简单,得到的尿激酶收率佳、纯度高。(The invention discloses a method for adsorbing urokinase in urine by using agarose gel 4B, and relates to the technical field of separation and extraction. The method comprises the following steps: (1) putting the agarose gel 4B affinity bag into a filter flask, and enabling the urine to flow into the filter flask through the agarose gel 4B affinity bag; (2) taking out the agarose gel 4B affinity bag after the urine flow is finished, filling the agarose gel 4B affinity bag into a chromatographic column, washing the chromatographic column by using a buffer solution, then desorbing the affinity bag by using a desorption solution, and collecting the affinity bag when the color of the elution solution is changed, thus obtaining a urokinase solution; (3) and (3) carrying out freeze drying on the urokinase solution obtained in the step (2) to obtain urokinase powder. The method for adsorbing urokinase in urine provided by the invention does not need to treat urine, is simple to operate, and has good yield and high purity of the obtained urokinase.)

一种用琼脂糖凝胶4B吸附尿液中尿激酶的方法

技术领域

本发明涉及分离提取技术领域，具体涉及一种用琼脂糖凝胶4B吸附尿液中尿激酶的方法。

背景技术

尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物，是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种碱性蛋白，等电点在PH8.7左右，为白色非结晶状粉末，易溶于水。稀溶液性状不稳定，必须新鲜配用，且不得用酸性溶液稀释，冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似，也有酯酶的活力，无抗原性，不使体内产生抗体。体内半衰期为(14±6)min。

尿激酶能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以，尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且它无抗原性问题，可长时间使用。

由于尿激酶有着重要的医药价值，所以相继有很多专刊报道了尿激酶粗品的提取方法，因人体尿液中尿激酶含量很低，取尿激酶的主要关键就是如何从大量的尿液中富集尿激酶，从目前公开的文献来看，主要有三类方法：(1)、发泡法：即以高速搅拌使酶液发泡，然后使泡沫液化，加入硫酸铵使尿激酶沉淀；(2)、沉淀剂法：在尿液中加入沉淀剂，使尿激酶沉淀，尿激酶则保留在沉淀中；(3)、吸附剂，此法应用最多，选择适当的吸附剂，有选择的吸附尿激酶。

中国专利申请201510549397.1中公开了一种直接在小便池或便斗中用装改性硅胶的滤布袋吸附尿液中的尿蛋白，并将吸附尿蛋白的滤布袋运至加工点进行后续处理的尿蛋白富集方法。该方法利用特定尿蛋白的等电点性质，通过使用包括改性硅胶，大孔树脂，甲壳素，离子树脂等；对尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接有效吸附，避免了尿液的收集步骤。该方法所得冻干粉的活性为4.12×10⁵IU，不能满足要求。

中国专利申请201510691424.1提供了一种从尿液中提取尿激酶和乌司他丁的方法，包括：收集尿液并调节其pH值；在尿液中加入粉末状硅胶并搅拌使尿液中的尿激酶蛋白被硅胶吸附；通过过滤方式获取硅胶并调节过滤后的尿液PH值从硅胶上获取尿激酶蛋白液；将尿激酶蛋白液加入到饱和水中提取得到尿激酶，在乌司他丁蛋白液中加入硫酸铵提取得到乌司他丁。本发明可在尿液中提取尿激酶粗品和乌司他丁粗品，大大提高了尿液的经济价值。但是在吸附过程中尿激酶也会被洗附，因此会造成尿激酶的损失，从而降低尿激酶的产率。

对于从人尿液中收集尿激酶来说，如何提高尿液中尿蛋白的提取率非常重要，因此，亟需开发一种提高尿激酶收率的方法。有鉴于此，为解决现有技术中面临的问题，本发明提供一种使用琼脂糖凝胶4B吸附尿液中尿激酶的方法，该方法可以明显提升尿激酶的收率，提高尿激酶的纯度。

发明内容

本发明目的是提供一种使用琼脂糖凝胶4B吸附尿液中尿激酶的方法，该方法可以明显提高尿激酶的收率，提高尿激酶的纯度。

为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：

一种用琼脂糖凝胶4B吸附尿液中尿激酶的方法，包括如下步骤：

(1)将琼脂糖凝胶4B亲和包放入过滤瓶中，使尿液穿过琼脂糖凝胶4B亲和包流入过滤瓶；

(2)尿液流完后取出琼脂糖凝胶4B亲和包，装入层析柱，用缓冲液洗涤，然后用解脱液解脱，待解脱液流出颜色发生变化时进行收集，即得尿激酶溶液；

(3)将步骤(2)所得的尿激酶溶液冷冻干燥，得尿激酶粉末。

优选的，步骤(1)中，尿液和琼脂糖凝胶4B的体积比为400000-600000:15，进一步优选为500000:15。

优选的，步骤(1)中，尿液穿过的流速为1-10mL/min，进一步优选为4mL/min。

优选的，步骤(2)中，所述层析柱选自BPG/GE、Chromaflow/GE、Axichrom/GE、QuickScale/Merck、SAC-BIO/利穗科技、ABH-BIO/利穗科技、EAC-BIO/利穗科技、XK16/20/GE、GCC/利穗科技中的任一种，进一步优选为XK16/20/GE。

优选的，步骤(2)中，所述琼脂糖凝胶4B和层析柱的体积比为0.1-0.5：1，进一步优选为0.3:1。

优选的，步骤(2)中，所述缓冲液选自磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硫酸铵缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸-Tris缓冲液、甘氨酸-Tris缓冲液中的至少一种，优选为磷酸缓冲液，进一步优选为0.02M的磷酸缓冲液。

优选的，步骤(2)中，所述缓冲液的用量为2-4倍柱体积，优选为3倍柱。

优选的，步骤(2)中，所述解脱液为含有冰醋酸和氯化钠溶液的混合液；所述冰醋酸和氯化钠溶液的体积比为3:400-600，进一步优选为3:500；所述氯化钠溶液的浓度为0.01-0.03g/mL，进一步优选为0.02g/mL。

优选的，步骤(2)中，所述解脱液的用量为1.5-2.5倍柱体积，进一步优选为2倍柱。

优选的，步骤(2)中，所述解脱液的流速为1-4mL/min，进一步优选为2.5mL/min。

优选的，步骤(2)中，颜色发生变化是指颜色由浅灰变为深灰或者由浅黄变为深黄。

优选的，步骤(3)中，所述冷冻干燥具体是指：将步骤(2)所得的尿激酶溶液放入冻干机，在零下35-55度冷冻2-4小时，随后升温至室温，保持1.5-2.5小时；进一步优选的，所述冷冻干燥具体是指：将步骤(2)所得的尿激酶溶液放入冻干机，在零下45度冷冻3小时，随后升温至室温，保持2小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的吸附尿液中尿激酶的方法无需对尿液进行处理，直接将收集的尿液穿过尿液和琼脂糖凝胶4B，然后将尿液和琼脂糖凝胶4B装入层析柱中，洗脱即可得到尿激酶，操作简单，很好的减少了尿激酶的损失；

(2)本发明的方法能使尿激酶更好的分离，减少尿激酶的损失，得到的尿激酶收率佳、纯度高。

附图说明

图1为实施例1所得尿激酶溶液图谱，其中，02为目标峰；

图2为实施例1所得尿激酶粉末图谱，其中，02为目标峰。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，琼脂糖凝胶4B亲和包为本公司用琼脂糖凝胶4B制成的亲和层析凝胶，琼脂糖凝胶4B购自GE公司，货号17-0120-05。

实施例1

(1)将15mL琼脂糖凝胶4B亲和包放入过滤瓶中，取500L尿液以4mL/min流速穿过琼脂糖凝胶4B亲和包流入过滤瓶，尿液检测共380万iu；

(2)尿液流完后取出琼脂糖凝胶4B亲和包，装入层析柱(XK16/20/GE)按压紧密，琼脂糖凝胶4B和层析柱的体积比为0.3:1，用3倍体积0.02M磷酸缓冲液洗涤，然后用2倍体积解脱液(1L 0.02g/mL氯化钠溶液+6mL冰醋酸)进行解脱，解脱液流速为2.5mL/min，到解脱液颜色从浅灰变为深灰时进行收集，得尿激酶溶液；

(3)将步骤(2)收集的解脱液放入冻干机，在零下45度冷冻3小时，随后升温至室温真空冷冻干燥，保持2小时，取出得到尿激酶粉末。

实施例2

(1)将15mL琼脂糖凝胶4B亲和包放入过滤瓶中，取400L尿液以1mL/min流速穿过琼脂糖凝胶4B亲和包流入过滤瓶，尿液检测共302万iu；

(2)尿液流完后取出琼脂糖凝胶4B亲和包，装入层析柱(GCC/利穗科技)按压紧密，琼脂糖凝胶4B和层析柱的体积比为0.1:1，用2倍体积0.02M磷酸缓冲液洗涤，然后用1.5倍体积解脱液(0.8L 0.02g/mL氯化钠溶液+6mL冰醋酸)进行解脱，解脱液流速为1mL/min，到解脱液颜色从浅灰变为深灰时进行收集，得尿激酶溶液；

(3)将步骤(2)收集的解脱液放入冻干机，在零下35度冷冻4小时，随后升温至室温真空冷冻干燥，保持1.5小时，取出得到尿激酶粉末。

实施例3

(1)将15mL琼脂糖凝胶4B亲和包放入过滤瓶中，取600L尿液以10mL/min流速穿过琼脂糖凝胶4B亲和包流入过滤瓶，尿液检测共458万iu；

(2)尿液流完后取出琼脂糖凝胶4B亲和包，装入层析柱(XK16/20/GE)按压紧密，琼脂糖凝胶4B和层析柱的体积比为0.5:1，用4倍体积0.02M磷酸缓冲液洗涤，然后用2.5倍体积解脱液(1.2L 0.02g/mL氯化钠溶液+6mL冰醋酸)进行解脱，解脱液流速为4mL/min，到解脱液颜色从浅灰变为深灰时进行收集，得尿激酶溶液；

(3)将步骤(2)收集的解脱液放入冻干机，在零下55度冷冻2小时，随后升温至室温真空冷冻干燥，保持2.5小时，取出得到尿激酶粉末。

对比例1

与实施例1不同的是，用相同用量的硅胶替换琼脂糖凝胶4B，其余皆相同。

对比例2

与实施例1不同的是，用相同用量的甲壳质替换琼脂糖凝胶4B，其余皆相同。

对比例3

与实施例1不同的是，解脱液用量为4倍柱体积，其余皆相同。

对比例4

与实施例1不同的是，尿液流速为0.6mL/min，其余皆相同。

测试例1

将实施例和对比例所得尿激酶粉末按2020版【中国药典】检验方法，取10mg稀释，测定活性含量，并按照下式计算收率：

收率＝(酶溶液/粉末总活性含量÷尿液总活性含量)×100％

实施例和对比例测试结果如表1所示：

表1.

从表1可以看出，本发明实施例收率高，其中，实施例1中尿激酶溶液活性收率达72％，尿激酶粉末的收率达71％。从对比例3、对比例4看出，加大解脱液用量或减慢尿液流速，收率无明显变化，从成本和时间角度考虑，优选实施例1中用量和流速。

测试例2

以实施例1为例，按照2015版药典中标准方法分子排阻(分子筛)高效液相色谱得到谱图如图1、图2所示。

对图1谱图进行分析，如表2所示：

表2.

峰号	峰名	保留时间	峰高	峰面积	含量
						1	-	21.484	113535.961	13281305.000	23.8550
2	-	28.338	96910.352	11423309.000	20.5178
						3	02	33.173	184770.750	27426234.000	49.2613
4	-	39.777	11329.014	927477.750	1.6659
						5	-	41.444	9600.839	1409818.875	2.5322
6	-	45.313	5178.754	531627.375	0.9549
						7	-	47.447	7329.811	675278.313	1.2129
总计	-	-	428655.480	55675050.313	100.0000

由表2可知，目标峰02保留时间为33.173，色谱图积分相对含量49.26％，说明经过本发明吸附的尿激酶纯度较之硅胶(纯度10％以下)有很大提高。

对图2谱图进行分析，如表3所示：

表3.

峰号	峰名	保留时间	峰高	峰面积	含量
						1	-	21.542	99471.438	10422151.000	24.9912
2	-	28.504	89094.477	9665433.000	23.1767
						3	02	33.273	158751.172	20800140.000	49.8766
4	-	40.010	5182.828	745367.688	1.7873
						5	-	45.213	1431.538	70125.602	0.1682
总计	-	-	353931.452	41703217.289	100.0000

由表3可知，数据重复性与表二完全吻合，证明本发明的重复性很好，可以用于放大生产。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。