索拉菲尼联合齐墩果酸在制备治疗肝癌的药物中的应用
阅读说明：本技术 索拉菲尼联合齐墩果酸在制备治疗肝癌的药物中的应用 (Application of combination of sorafenib and oleanolic acid in preparation of medicine for treating liver cancer ) 是由 朴金花 伊芯 王迪迪 张鹏霞 葛堂栋 商宇 宋琳琳 裴思莹 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了索拉菲尼联合齐墩果酸在制备治疗肝癌的药物中的应用。属于医药技术领域。与现有技术相比,本发明取得的有益效果为：首次提出了OA对SOR的增效作用与mTOR信号通路的关系,OA与SOR联合用药的作用浓度大大降低,解决了SOR耐药性的问题,减轻了患者的经济负担,延长了患者的生存期,为肝癌的临床治疗提供了新方向。(The invention discloses application of combination of sorafenib and oleanolic acid in preparation of a medicine for treating liver cancer. Belongs to the technical field of medicine. Compared with the prior art, the invention has the following beneficial effects: the relation between the synergistic effect of OA on SOR and an mTOR signal pathway is provided for the first time, the effect concentration of the combined administration of OA and SOR is greatly reduced, the problem of SOR drug resistance is solved, the economic burden of a patient is relieved, the life cycle of the patient is prolonged, and a new direction is provided for clinical treatment of liver cancer.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及索拉菲尼联合齐墩果酸在 制备治疗肝癌的药物中的应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一种重要的肝癌组织学分 型。我国肝癌患者在发病原因、生物学行为、临床特征、治疗选择和预后方 面，均与西方国家存在明显的差异。因此，积极探索适合国人HCC的治疗策 略，合理选择和应用，对于进一步提高晚期肝癌的总体疗效十分重要。
多激酶抑制剂索拉非尼(Sorafenib，SOR)是一种能够显著延长晚期HCC 患者生存期的药物，患者的中位生存期可延长平均3～5个月。SOR靶位于 Ras/Raf/Mek/Erk(Ratsarcoma/Rapidly accelerated fibrosarcoma/Methyl Ethyl Ketone/Extracellularsignal-regulated kinase)通路，该通路是mTOR的上游通 路。研究表明，SOR通过抑制ATP、升高ROS水平，导致AMPK被激活，从而 抑制mTOR的表达，进一步下调p-S6的表达。然而，由于SOR的毒性和极易产 生耐药现象的问题，使其在应用过程中也受到一定限制。
综上，如何提供一种克服索拉菲尼耐药性的治疗肝癌的药物是本领域技 术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了索拉菲尼联合齐墩果酸在制备治疗肝癌的药物 中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
索拉菲尼联合齐墩果酸在制备治疗肝癌的药物中的应用。
齐墩果酸(oleanolic acid，OA)具有抗癌、保肝、降低血糖血脂、抗菌 消炎、免疫调节、促进黑色素合成及毛发生长，预防骨质疏松等一系列生物 学功能。并且OA的抗肿瘤作用与抑制mTOR信号通路的激活有关。
联合用药是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先 后应用。联合用药往往会发生体内或体外药物的相互影响，对于某些药物组 合，联合治疗的最佳组合剂量还会使副作用最小化。
优选的，索拉菲尼联合齐墩果酸在制备抑制肝癌细胞增殖药物、阻滞肝 癌细胞周期药物及引起肝癌细胞ROS水平上升药物中的应用。
细胞周期阻滞与肿瘤的发生及发展密切相关，索拉菲尼可诱导多种实体 肿瘤细胞G1期阻滞。本发明研究结果显示，索拉菲尼联合齐墩果酸作用于 BEL-7402细胞也出现了同一结果。并且，索拉菲尼与齐墩果酸在一定浓度范 围内联合，可以产生增效作用，增强索拉菲尼引起BEL-7402细胞G1期阻滞。
细胞内氧化与还原反应处于一种平衡状态，一旦遭到破坏，ROS过量产 生，即可最终引起细胞走向凋亡。OA和SOR均可引起肿瘤细胞ROS水平上 升，且SOR+OA更增强了这一效果。二者联合使用，既能够降低临床用药成 本，又能在一定程度上降低耐药风险。
优选的，所述肝癌细胞为BEL-7402细胞。
体外研究常用的肝癌细胞株包括SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、Huh-7、 MHCC97人肝癌细胞株、HepG2人肝母细胞瘤、PLC/PRF/5人肝癌亚历山大 细胞等，由于BEL-7402细胞是从中国HCC患者手术切除的组织上获取并培 养建立起来的。与正常人类肝癌细胞相比较，BEL-7402细胞内mTOR高度活 化，表现为p-mTOR/p-4EBP1(phospho-eukaryoticinitiation factor 4E binding protein 1)/p-S6蛋白过表达。同时BEL-7402细胞中存在Nrf2的过度激活。 使用该细胞可以让研究结果更接近于我国的临床治疗现状。
优选的，索拉菲尼联合齐墩果酸在制备增加BEL-7402细胞凋亡比例药物 中的应用。
索拉菲尼通过抑制ATP、升高ROS水平，导致AMPK被激活，从而抑 制mTOR的表达，进一步下调p-S6的表达诱导肿瘤细胞凋亡。索拉菲尼和 OA均可引起癌细胞凋亡，由于索拉菲尼的毒性和极易产生耐药现象的问题， 其使用量也受到一定限制。克服索拉菲尼毒性和耐药问题的一种方法就是使 用较低剂量，并与其他互补剂组合以增强介导的肿瘤抑制效果。另外索拉菲 尼的治疗剂量加重，导致治疗成本越高，因而低剂量联合用药的方法也可具有成本效益优势。
优选的，索拉菲尼联合齐墩果酸在制备抑制BEL-7402细胞中mTOR信 号通路药物中的应用。
AMPK/mTOR(5'-磷酸腺苷-激活的蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白)信号通路 被认为是肿瘤形成的关键靶标。mTOR参与真核细胞的生长和代谢。mTOR 在癌细胞中的过度活化，是肿瘤发生发展的重要原因。应激反应性代谢调节 因子AMPK途径以及DNA损伤-应答诱导的p53靶基因途径参与了mTOR信 号通路的上游途径，影响mRNA翻译的核糖体蛋白S6激酶(p70S6K，S6) 是mTOR重要的下游磷酸化底物。即升高AMPK磷酸化水平、抑制mTOR 磷酸化水平，或其下游底物p-S6受抑制，可以抑制肿瘤的发生和发展。
优选的，所述治疗肝癌的药物中索拉菲尼和齐墩果酸的摩尔比为2:1～5。
优选的，所述治疗肝癌的药物中索拉菲尼和齐墩果酸的摩尔比为2:5。
优选的，所述治疗肝癌的药物中索拉菲尼的给药浓度为4μM，齐墩果酸 的给药浓度为2～10μM。
优选的，所述治疗肝癌的药物中索拉菲尼的给药浓度为4μM，齐墩果酸 的给药浓度为10μM。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为： 首次提出了OA对SOR的增效作用与mTOR信号通路的关系，OA与SOR联 合用药的作用浓度大大降低，解决了SOR耐药性的问题，减轻了患者的经济 负担，延长了患者的生存期，为肝癌的临床治疗提供了新方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为实施例2中细胞增殖抑制实验结果，其中A为OA处理组，B 为SOR处理组，C为SOR和SOR联合OA处理组，‘*’表示该组细胞存活率 与相应的SOR单药组细胞存活率作比较，**p<0.01，***p<0.001，n＝3；
图2附图为实施例3中对细胞周期影响实验结果，其中，A为SOR与OA 联合作用引起细胞周期分布的变化，B为各处理组细胞周期柱形图；
图3附图为实施例4活性氧自由基(ROS)实验结果，其中，A为流式 细胞仪检测各组ROS表达水平变化(注：a.空白对照组；b.溶剂对照组；c.SOR 4μM；d.SOR 10μM；e.OA 10μM；f.SOR 4μM+OA 10μM)，B.为ROS表达水 平统计分析(注：‘*’代表样品与空白对照组比较，***p<0.001，n＝3；‘#’代 表样品与SOR 4μM组比较，###p<0.001，n＝3；‘Δ’代表样品与OA 10μM组 比较，ΔΔΔp<0.001，n＝3)；
图4附图为本发明实施例5中流式细胞仪检测凋亡细胞比例结果，其中a 为空白对照组；b为溶剂对照组；c为OA 10μM；d为SOR 4μM；e为SOR 4 μM+OA 10μM；
图5附图为本发明实施例6中转膜液中不同甲醛含量转膜效率结果，其 中A-1为甲醇含量35％、分离胶，A-2为甲醇含量35％、PVDF膜，B-1为甲 醇含量10％、分离胶，B-2为甲醇含量10％、PVDF膜；
图6附图为本发明实施例6中不同转膜时间转膜效率结果，其中C-1为 转膜时间30min、分离胶，C-2为转膜时间30min、PVDF膜，D-1为转膜时 间40min、分离胶，D-2为转膜时间40min、PVDF膜，E-1为转膜时间50min、 分离胶，E-2为转膜时间50min、PVDF膜；
图7附图为实施例6中SOR引起凋亡相关蛋白水平变化结果，其中，a 为采用(0,4,10,20μM)SOR并设置溶剂对照组处理细胞；从b到图e分别 显示了凋亡相关蛋白PARP-1、p53、CASP9-C和CASP3-C水平的灰度分析， ‘*’代表样品与溶剂对照组比较，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，n＝3；‘#’代 表样品与SOR4μM组比较，###p<0.001，##p<0.01，#p<0.05，n＝3；
图8附图为实施例6中OA增强SOR诱导的凋亡相关蛋白水平变化结果， 其中1代表空白对照组；2代表溶剂对照组；3代表OA 10μM；4代表SOR 4 μM；5代表SOR 4μM+OA 10μM；‘*’代表样品与空白对照组比较，*p<0.05，***p<0.001，n＝3；‘#’代表样品与OA 10μM组比较，###p<0.001，n＝3；‘Δ’ 代表样品与SOR 4μM组比较，ΔΔΔp<0.001，n＝3；
图9附图为实施例6中Western Blotting检测mTOR信号通路蛋白水平， 其中，1代表空白对照组；2代表溶剂对照组；3代表OA 10μM；4代表SOR 4μM；5代表SOR 4μM+OA 10μM；6代表雷帕霉素100nM；‘*’代表样品与 OA 10μM组比较，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，n＝3；‘#’代表与SOR 4 μM组比较，###p<0.001，##p<0.01，#p<0.05，n＝3；‘Δ’代表样品与SOR 4μM+OA 10μM组比较，ΔΔΔp<0.001，n＝3；
图10附图为实施例6中WesternBlotting检测mTOR信号通路蛋白水平 随时间变化结果，其中，a为以SOR 4μM+OA 10μM分别处理各组细胞(0,1, 2,3,6,24,36h)后，各组细胞相关蛋白水平；从b到e分别显示了p-AMPK (AMPK)/p-mTOR(mTOR)/p-S6蛋白水平的灰度分析，‘*’代表样品与0h细胞 组比较，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，n＝3；
图11附图为实施例6中Western Blotting检测p-AMPK(AMPK)蛋白水平 结果，其中，1代表空白对照组；2代表溶剂对照组；3代表Compound C 15μM； 4代表SOR 4μM+OA 10μM；5代表SOR 4μM+OA 10μM+Compound C 15 μM；‘*’代表样品与空白对照组比较，***p<0.001，n＝3；‘#’代表样品与 Compound C 15μM组比较，###p<0.001，n＝3；‘Δ’代表样品与SOR 4μM+OA 10 μM组比较，###p<0.001，n＝3；
图12附图为实施例6中Western Blotting检测Nrf2蛋白水平结果；
图13附图为实施例6中OA对SOR增效作用的信号通路机制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
BEL-7402细胞来源于中国医学科学院细胞库。
未提及的材料为常规实验材料，采购自市售渠道；未提及的实验方法为 常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1 BEL-7402细胞培养
采用含10％胎牛血清(FBS)、100×L-谷氨酰胺(L-Glu)、100×HEPES 的RPMI 1640培养基培养BEL-7402。常规取对数生长期BEL-7402细胞40 万接种于60mm平皿内，3ml体系，每2天传代一次。传代时，先去除旧培 养基，然后需使用1:1稀释的胰蛋白酶消化液(Trypsin-EDTA 0.25％与HBSS 体积比1:1)1ml消化2min后，弃胰蛋白酶消化液，加入1ml新鲜培养基， 轻轻吹下贴壁细胞混合均匀，1:4～1:5传代。
实施例2 细胞增殖抑制实验
为了观察SOR与OA合用是否具有协同增效作用，采用实施例1制备的 BEL-7402细胞，进行不同给药处理，CCK-8法检测细胞增殖活性，通过药物 作用对BEL-7402细胞的增殖抑制的程度，从而判断两药联合应用的功效。具 体操作如下：
(1)铺板：规定96孔板内为200μl/孔的总体系。取对数生长期BEL-7402 细胞接种于96孔板(1000个/孔，100μl细胞悬液)，37℃恒温孵育过夜， 待细胞贴壁。
(2)给药处理：设置空孔组(只含培养基100μl)，空白对照组(BEL-7402 细胞，培养基)，溶剂对照(BEL-7402细胞，培养基，溶剂，所述溶剂为体 积比为1:1的DMSO和无水乙醇)，OA单药组(终浓度10,20,40,80,120μM)， SOR单药组(终浓度0.5,1,2,4,6μM)，SOR(终浓度0.5,1,2,4,6μM)分 别与OA 2μM合用组，SOR(终浓度0.5,1,2,4,6μM)分别与OA 10μM合用组。
用1.5ml EP管配制4×终浓度的工作药液，每孔加入50μl相应4×终浓度 工作药液，另外用新鲜培养基(同实施例1)补足200μl体系/孔，使得给药 后的每孔工作药液终浓度如上所设置，37℃恒温培养72小时。
(3)CCK-8法检测细胞增殖活性：从37℃恒温培养箱中取出96孔板，每 孔加入10μlCCK-8试剂，摇床震荡混匀10s，继续37℃恒温孵育2h后，取 出孔板再次震荡混匀10s。将处理好的孔板置于酶标仪中，在450nm波长下， 测OD值。再进行数据分析处理。
(4)两药联合用药指数CDI计算：
CDI＝(Sa+b)/(Sa×Sb),其中：
Sa+b表示药物联合作用后细胞的存活部分与空白对照的百分比，Sa和Sb分别表示A和B两个药物(OA与SOR)的存活部分与空白对照的百分比。
CDI<0.7，CDI<1，CDI＝1，CDI>1分别表示增效、协同、相加和拮抗作 用。
(4)实验结果：实验结果如图1及表1所示。
由图1A、图1B可以看出，在所设置的药物浓度范围内，细胞增殖活性 呈现随着给药浓度的增加而逐渐降低的趋势。OA对BEL-7402细胞的IC50值 为102.6±6.7μM，同时我们可以确定OA在浓度范围低于10μM的情况下， 细胞增殖抑制率均低于20％。SOR对BEL-7402细胞的IC50值为4.0±1.3μM。
由图1C可以看出，SOR单药曲线与SOR+OA 2μM、SOR+OA 10μM两 条合用曲线趋势一致但并不重合。在SOR单药作用基础上，合用的OA浓度 越高，细胞存活率越低。其中，SOR 4μM组与SOR 4μM+OA 2μM组相比 较，细胞存活率由63.0±2.5％降低到32.8±1.0％，结果具有极显著的统计学差 异(p<0.001，n＝3)。SOR与高浓度10μMOA合用后，细胞存活率进一步降低到15.2±2.9％，结果具有极显著的统计学差异(p<0.001，n＝3)。
通过联合用药指数CDI的计算结果如表1所示。
表1.SOR与OA联合用药指数(CDI)
注：CDI<0.7表示增效作用，CDI<1表示协同作用，CDI＝1表示加和作用，CDI>1表示拮抗作 用。
由表1结果可知，在一定用药浓度，OA与SOR联合用药具有增效作用， 其中SOR 4μM+OA 10μM处理组的CDI值最低，为0.491。
实施例3 对细胞周期的影响实验
采用SOR与OA合用，作用于BEL-7402细胞，应用流式细胞仪进行分 析，从而判断两药合用对BEL-7402细胞周期进程的影响。
(一)待测细胞样品制备
(1)取对数生长期BEL-7402细胞接种于6孔板，每孔20万，2ml培养 体系，37℃恒温培养24h。
(2)采用SOR(2,4,10μM)、OA(2,5,10μM)以及SOR 4μM分别与 OA(2,5,10μM)合用，规定工作液最高加入1ml，分别配制(2×)10μM SOR 和(2×)10μM OA工作药液，依次梯度给药，用培养基(同实施例1)补足 2ml总体系，使得给药后的每孔工作药液终浓度如上所设置。37℃恒温处理 24h。
(3)弃培养基，每孔用1ml 0.25％的EDTA在37℃消化30min。吹下贴 壁细胞，转移至1.5ml离心管内，800r/min×5min，弃EDTA，弹开细胞沉淀。
(4)PBS洗一遍，800r/min×5min，弃PBS，弹开细胞沉淀。
(5)每管加入1ml预冷的75％乙醇，盖上盖子，上下混匀，4℃固定，固 定时间大于12h(30min时，将沉淀的细胞重新混匀，确保每个细胞与75％ 乙醇接触固定)并保存，得待测细胞样品。
(二)流式细胞仪检测
(1)取出上述步骤(一)制备的待测细胞样品，离心800r/min×5min，弃 75％乙醇，弹开细胞沉淀。
(2)PBS洗两遍，800r/min×5min，弃PBS，每管剩余100μl PBS，弹开 细胞沉淀。
(3)每管加入RNaseA酶(10mg/ml)5μl，混匀，37℃水浴30min(15min 时弹开沉淀的细胞)。
(4)每管加入PI(2.5mg/ml)20μl，加入PBS补足每管1ml体系，弹开 细胞混合均匀，常温避光染色30min后，800r/min×5min离心弃染液，弹开 细胞沉淀。
(5)每管补足1ml PBS，混匀细胞，300目过滤，流式细胞仪测定荧光强 度。
(三)测定结果在：测定结果如图2所示。
图2A为SOR与OA联合作用引起细胞周期分布的变化结果。经过PI染 色30min后的各组细胞，依照图2A所示顺序，G1期细胞比例分别为50.6％、 49.9％、48.9％、48.9％、48.7％、48.2％、57.7％、63.0％、65.3％、58.9％、53.9％。 可见，OA浓度低于10μM，对BEL-7402细胞周期无影响。而BEL-7402细 胞周期会随着SOR作用浓度的升高，G1期阻滞逐渐增强。联合用药组亦可 以引起BEL-7402细胞G1期阻滞，但G1期细胞比例却随着联合用药浓度的 升高而下降。SOR 4μM+OA 2μM组，G1期比例最高。其中，SOR 4μM+OA 2μM组(65.3％)与SOR 4μM组(57.7％)相比较，G1期比例升高了7.6％。
图2B为各处理组细胞周期柱形图，由图2B可以看出，与CON组相比， OA(2,5,10μM)给药组的G1期BEL-7402细胞比例无统计学差异(p>0.05， n＝3)，即OA作用浓度低于10μM，不会引起BEL-7402细胞G1期阻滞。然 而BEL-7402细胞经过SOR 2μM，SOR 4μM，SOR 10μM处理后，G1期比 例随着SOR给药浓度增加呈递增趋势。当SOR 4μM，分别与OA2μM、OA5 μM、OA10μM合用后，SOR 4μM+OA 2μM组(64.7±4.3％)与SOR 10μM 组(60.2±4.8％)相比较，G1期比例升高了4.5±2.7％(p>0.05，n＝3)。随着 联合作用OA浓度的增加，可见G1期BEL-7402细胞分布比例反而呈递减趋 势，SOR 4μM+OA 2μM组G1期比例最高。说明OA仅在一定的浓度范围内 能够增强SOR引起的细胞G1期阻滞。
实施例4 活性氧自由基(ROS)实验
(一)BEL-7402细胞样品制备及处理
取对数生长期BEL-7402细胞接种于6孔板，每孔20万，2ml培养体系， 37℃恒温培养24h，设置空白对照组(BEL-7402细胞，培养基)、溶剂对照 组(BEL-7402细胞，培养基，溶剂，所述溶剂为体积比为1:1的DMSO和无 水乙醇)、SOR 4μM、SOR 10μM、OA 10μM以及SOR 4μM+OA 10μM组， 按实施例3中相同的给药手法处理各组细胞，恒温37℃处理4h。
(二)ROS荧光强度检测
(1)弃培养基，每孔加入1ml PBS和1μl 1000×H2DCFDA探针，37℃恒 温培养1h。
(2)弃PBS，每孔加入1ml胰酶消化2min，弃胰酶，加1ml无血清培 养基洗两遍(离心800r/min×5min，弃上清，弹开细胞沉淀)。
(3)每管加1ml PBS吹打细胞，300目过滤，流式细胞仪荧光强度检测。
(三)实验结果：实验结果如图3所示。
由图3结果可知，与对照组相比较，SOR 4μM和SOR 10μM组的ROS 水平分别为195.6％(155.2±57.1％)(p>0.05，n＝3)和732.7％(713.9±26.6％) (p<0.001，n＝3)，SOR作用浓度越高，ROS水平越高。当4μM SOR与10μM OA共同处理细胞后，可以观察到ROS水平进一步增加到689.4±97.4％，远高 于4μM SOR或者10μM OA(211.7％,170.4±58.5％)处理组中ROS水平， 结合三次独立重复实验结果可见，结果存在统计学意义(p<0.001，n＝3)。在 ROS水平上，我们也同样鉴证了OA对SOR的增效作用。
实施例5 流式Annexin V/PI双染检测细胞凋亡比例
(1)取对数生长期BEL-7402细胞接种于6孔板，每孔20万，2ml培养 体系，37℃恒温培养24h，再给药处理36h，给药分组如下：
a组：空白对照组(BEL-7402细胞，培养基)；b组：溶剂对照组(BEL-7402 细胞，培养基，溶剂，所述溶剂为体积比为1:1的DMSO和无水乙醇)；c 组：OA 10μM；d组：SOR 4μM；e组：SOR 4μM+OA 10μM。
(2)之后将培养液转移入1.5ml EP管内，800r/min×5min，弃上清，弹 开细胞沉淀。
(3)同时每孔加入1ml 1:1稀释的胰蛋白酶消化液(Trypsin-EDTA 0.25％ 与HBSS体积比1:1)，消化1min，弃胰蛋白酶消化液，每孔加入1ml PBS 吹下贴壁细胞，转移入离心管内800r/min×5min，弃上清。
(4)用去离子水1:3稀释结合缓冲液(4ml 4×结合缓冲液+12ml去离子 水)，每组加入100μl，弹开细胞沉淀。
(5)每组加入5μl AnnexinⅤ/Alexa Fluor 488，混匀后于室温避光染色5 min。加入10μl 20μg/ml的碘化丙锭PI溶液，并加入PBS补足1ml体系。 300目过滤，流式细胞仪检测。
检测结果如图4所示。
由图4结果可知，与含5.5％凋亡细胞的对照组相比较，OA 10μM组内 凋亡细胞比例仅为6.6％，几乎不引起凋亡。SOR 4μM组内凋亡细胞比例仅 为7.7％，同样凋亡量低于10％。然而，当SOR 4μM联合OA 10μM给药后， 凋亡细胞比例高达85％，可见OA对SOR的增效作用。
实施例6 Western Blotting实验
(一)最佳转膜效率条件优化
PVDF(孔径0.2μm)膜转膜效率与转膜液中甲醇含量的关系：
(1)取实施例3(一)中制备的待测细胞样品，应用Western Blotting法进 行SDS-PAGE电泳。
(2)转膜：1号转膜液配方：35％甲醇，20％transfer buffer，45％ ddH2O； 2号转膜液配方：10％甲醇，20％transfer buffer，70％ ddH2O。胶和膜在转膜 前均泡于各自转膜液中20min。恒流0.10A/块，均转膜12min。
(3)凝胶染色：将凝胶置于染胶液中，摇床染色3h。清水冲洗。化学发 光成像仪0.1s曝光。染液配方如表2所示。
表2.染胶液配方
(4)PVDF膜染色：氨基黑浸染1min后，清水冲洗。拍照。
实验结果如图5所示，A组甲醇含量35％，B组甲醇含量10％，A组转 膜效率更高。就A组图片可见，分离胶(图A-1)与PVDF膜(图A-2)对比 观察，分子量大于50kDa的蛋白未转至PVDF膜上，分子量低于50kDa的蛋 白也有少量残留于分离胶上。综上可得，转膜液配方35％甲醇，20％ transfer buffer,45％ ddH2O为佳。
PVDF(孔径0.45μm)膜转膜效率与转膜时间的关系：
(1)取实施例3(一)制备的待测细胞样品，，应用Western Blotting法进 行SDS-PAGE电泳，0.12A/块进行恒流。
(2)转膜：转膜液按照35％甲醇，20％transfer buffer，45％ ddH2O的比例 配制。胶和膜在转膜前均泡于各自转膜液中20min。转膜时间分别为30min、 40min、50min。
(3)凝胶染色：将凝胶置于配制好的染胶液(配方见表2)中，摇床染色 3h。清水冲洗。化学发光成像仪0.1s曝光。
(4)PVDF膜染色：氨基黑浸染1min后，清水冲洗。拍照。
实验结果如图6所示，随着转膜时间增加，分子量大于75kDa的蛋白转 到PVDF膜上的蛋白量逐渐增多，残留于分离胶上的蛋白量相应逐渐减少。 因此大蛋白转膜时间应考虑50min为宜。就分子量低于50kDa的蛋白考虑， 转膜时间30min为宜，时间过长会造成蛋白过转至滤纸上。
(二)Western Blotting实验
SOR和OA均可引起肝癌细胞凋亡，为证明OA可增强SOR引起肝癌细 胞凋亡显著增加，通过检测p53，PARP-1全长蛋白及切割蛋白，CASP9-C和 CASP3-C的蛋白水平，从而判断OA对SOR的增效作用。通过检测p-AMPK (AMPK)/p-mTOR(mTOR)/p-S6信号蛋白表达水平，判断SOR与OA联 合用药，与mTOR信号通路之间的联系。
A：BEL-7402细胞样品制备
(1)细胞接种：接种对数生长期BEL-7402细胞接种于60mm平皿(40 万/孔，3ml体系)，37℃恒温培养36h。
(2)给药处理：设空白对照组(BEL-7402细胞，培养基)，溶剂对照组 (BEL-7402细胞，培养基，溶剂，所述溶剂为体积比为1:1的DMSO和无水 乙醇)，单药组采用SOR(终浓度4,10,20μM)，OA 10μM，合用组采用 SOR 4μM+OA 10μM。给药前吸弃旧培液，用新鲜培液配制(3×终浓度工作 液)，最高浓度组给药达1ml(3×终浓度工作液给药)，依次梯度给药(按 照比例加入不同体积的3×终浓度工作液)，用培养基补足并维持3ml总体系， 使最终给药浓度如上述设置。37℃恒温处理36h。
B：待检测细胞样品的收集
将上述37℃恒温处理36h后的体系转移至2ml离心管内。每孔加入1ml PBS，刮下贴壁细胞后，用微量加样器吹匀后转移至1.5ml离心管内，水平离 心机800r/min×5min，再置于小型高速离心机12000r/min×20s，弃上清。
C：蛋白收集
(1)将收集好的待检测细胞样品置于冰盒内，向1ml RIPA裂解液内加入 25×蛋白酶抑制剂(cOmpleteTM Protease InhibitorCocktail)40μl混匀，得到裂 解液。根据细胞沉淀的量，加60～150μl裂解液。超声裂解10w/5s，间隔5s， 重复一次，共三次后，冰上裂解10min。
(2)使用低温离心机离心，4℃，12000r/min×15min。
(3)离心后，吸出上清装入(提前做好标记)新的1.5ml的EP管中。
(4)取96孔板每孔加入2μl蛋白测定液(试剂盒BIO-RAD)(预留3孔 空白对照)和2μl步骤(3)得到的样品上清，迷你摇床混匀2min，将孔板 置于酶标仪中，于570nm波长下，检测OD值。
(5)根据OD值计算VPIPA和V蛋白。
D：SDS-PAGE电泳
(1)样品制备，10μl Loading buffer，VRIPA和V蛋白，金属浴5min煮步骤 C得到的蛋白，冷却后将蛋白样品离心。向7μl Marker内加入20μl Loading buffer，33μl RIPA，上两个道，以此类推。空道，20μl Loading buffer和40μl RIPA，上两个道，每道28μl样品，以此类推。
(2)电泳：将胶(7.5％、10％和12.5％)装入电泳槽，加入Running buffer， 确定不漏液后，每道上样28μl。积层胶电压60V×20min，后将电压调至160 V，至溴酚蓝出胶，即停止电泳。
E：转膜(半干转)
(1)制备转膜液，20％transfer buffer，20％甲醇，60％去离子水，PH9.2 (7.5％、10％分离胶)。20％transfer buffer，35％甲醇，45％去离子水(12.5％ 分离胶)。一般转一块胶制100ml转膜液，两块制备150ml，三块胶需要200 ml，以此类推。将转膜所需的滤纸、PVDF膜浸泡在转膜液中，放置于4℃冰 箱预冷至少20min。另外待电泳完成后，取出电泳后的分离胶，置于已经预 冷的转膜液中继续于4℃冰箱预冷20min。需要注意的是，PVDF膜需在甲醇 中彻底润湿后再放入转膜液中。
(2)转膜槽中依次铺上厚滤纸，薄滤纸，PVDF膜，胶，薄滤纸，厚滤纸， 每铺一层需要用滚轮赶走气泡。
(3)恒流0.12A，12min，此时恒压40V，38min(蛋白分子量大于40kDa 均适合)。恒流0.10A，15min(蛋白分子量小于20kDa均适合)。
F：封闭及孵抗体
(1)将转完的PVDF膜取出，浸润于甲醇中固定(≦15s)，取出后置于 滤纸上晾干，铺于有保鲜膜的玻璃板上，再盖上一层保鲜膜，根据Marker所 示切取所需的蛋白条带。
(2)将切好的膜放入5％牛奶-PBS封闭液中，在翘板摇床上封闭1小时。
(3)一抗：取相应抗体于5％牛奶-PBS中稀释，PARP-1、p53(1:1000) 室温孵育1h；CleavedCaspase-3/9、p-mTOR(mTOR)、p-AMPK(AMPK)、 p-S6(1:1000)，4℃孵育过夜；β-actin(1:20000)，室温孵育30min。PBS-T 涮膜后，洗膜，3min/次，共3次。
(4)二抗：β-actin和p53分别取(1:2000)和(1:1000)鼠抗；PARP-1、CleavedCaspase-3/9、p-mTOR(mTOR)、p-AMPK(AMPK)、p-S6分别取 (1:1000)兔抗稀释于5％牛奶-PBS中后，室温孵育1h。PBS-T涮膜后，洗 膜，3min/次，共3次。
表3.Western blotting检测过程中使用抗体情况
G：曝光
显色液1:1配制，滴加在PVDF膜上，孵育3～5min后，化学发光成像仪 曝光。图片数据分析处理。
(三)实验结果：
我们通过检测药物诱导的BEL-7402细胞凋亡来证实OA对SOR的增效 作用。用Western Blotting法检测由SOR诱导的相关凋亡蛋白含量变化，结 果如图7所示。由图7可以看出，PARP-1切割蛋白是一种凋亡分子生物标志 物，它以浓度依赖的方式变化。CleavedCaspase-9(CASP9-C)和CleavedC aspase-3(CASP3-C)含量也随着药物浓度的升高而上升，在SOR 20μM组蛋 白含量达到最高(p<0.001,n＝3)。p53是凋亡起始蛋白，它的蛋白含量也随 着药物浓度的升高而提升。然而，当SOR浓度达到20μM，我们观察到p53 蛋白含量的显著增加，但其含量低于SOR 10μM组(p<0.01,n＝3)。
OA增强SOR诱导的凋亡相关蛋白水平变化如图8所示。进一步观察到 OA 10μM组，细胞内PARP-1切割蛋白、p53、CASP9-C和CASP3-C蛋白 水平均无显著变化(p>0.05,n＝3)，SOR 4μM组却引起了p53和CASP9-C 蛋白水平上升。与此同时，OA 10μM联合SOR 4μM表现出了更高水平的凋 亡相关蛋白表达。即联合用药组中的PARP-1切割带，CASP9-C或者CASP3 -C蛋白水平高于任一单药处理组，p53在联合用药组中同样表达显著(p<0.0 5，p<0.01或p<0.001，n＝3)。可见，OA增强了SOR引起BEL-7402细胞内 凋亡相关蛋白水平的变化。
报道指出，雷帕霉素特异性抑制mTOR及其下游信号水平。为证明OA 对SOR的增效作用与mTOR信号通路相关，我们采用特异性mTOR信号通 路抑制剂雷帕霉素100nM作为阳性对照，并运用Western Blotting法检测二 者联合作用后通路中相关蛋白表达水平。结果如图9所示。根据结果，可见 OA 10μM组，与对照组相比，p-AMPK水平未见变化(p>0.05，n＝3)，而 其下游的p-mTOR及更下游的p-S6同样并未显著抑制(p>0.05，n＝3)；SOR 4μM组，p-AMPK已激活(p<0.05，n＝3)，其下游的p-mTOR开始受到抑 制(p<0.05，n＝3)，其更下游的p-S6并未见显著抑制(p>0.05，n＝3)。雷 帕霉素100nM时，由于特异性抑制mTOR信号通路，表现为p-mTOR (p<0.001，n＝3)及p-S6(p<0.001，n＝3)表达水平显著降低。当SOR 4μM 联合OA 10μM后，可见p-AMPK表达显著升高(p<0.01，n＝3)；同时， p-mTOR/p-S6水平与雷帕霉素100nM组无统计学差异(p>0.05，n＝3)。即 SOR 4μM联合OA 10μM作用于BEL-7402细胞，激活了mTOR信号通路上 游的AMPK通路并且抑制了其下游的p-S6信号水平。即OA是通过抑制mTOR信号通路以增强SOR药效。
采用SOR 4μM与OA 10μM联合应用处理BEL-7402细胞不同时长，结 果如图10所示。结果显示p-AMPK在药物作用1h后，即有显著激活(p<0.001， n＝3)，但随着作用时间继续延长，p-AMPK表达会逐渐降低。直到药物作用 于细胞3h，p-AMPK水平仍然高于对照组(p<0.001，n＝3)，作用时间继续 延长到6h，p-AMPK水平已经与对照组差异较小(p<0.05，n＝3)。AMPK 下游的p-mTOR在6h时间点，可见部分抑制(p<0.05，n＝3)，且随时间延 长抑制更为显著；即24h和36h组中的p-mTOR水平受到极显著抑制 (p<0.001，n＝3)。而更下游的p-S6水平分别于24h和36h组中受到极显著 抑制(p<0.001，n＝3)。因此，SOR联合OA抑制mTOR信号通路的强弱与 时间呈正相关。
使用AMPK特异性抑制剂compound C，来证明OA联合SOR特异性作 用于AMPK通路。
实验分组
1.CON；空白对照组(BEL-7402细胞，培养基)；
2.SC溶剂对照组(BEL-7402细胞，培养基，溶剂)；
3.Compound C组(BEL-7402细胞，培养基，Compound C 15μM)处理 细胞2h；
4.SOR 4μM+OA 10μM组(BEL-7402细胞，培养基，SOR 4μM+OA 10μM 组):孵育细胞6h；
5.SOR 4μM+OA 10μM+Compound C 15μM组(BEL-7402细胞，培养基， SOR 4μM+OA10μM+Compound C 15μM组)先用15μM的compoundC预 处理细胞2h，然后用4μM SOR和10μMOA共同孵育细胞6h。
结果如图11所示。由图11可知，单独使用compound C处理细胞，对 AMPK并没有影响，p-AMPK水平显著低于空白对照组(p<0.001，n＝3)。 联合用药组中已经被极显著激活的p-AMPK(p<0.001，n＝3)，在加入了 compoundC后，受到了抑制(p<0.001，n＝3)。
Nrf2(NF-E2-related factor2)是氧化应激反应中的关键因子。采用(5,10, 20,40,80μM)OA作用于BEL-7402细胞24h后，收集细胞进行Western Blotting实验，检测各组细胞Nrf2蛋白表达水平。结果如图12所示。结果显 示，与空白对照组相比较，各组细胞Nrf2蛋白表达水平无差异。这提示我们 OA对SOR的增效作用可能与氧化应激途径无关。
综上，OA是通过特异性抑制mTOR信号通路增强SOR引起BEL-7402 细胞凋亡的。这其中包括了药物对p53靶基因途径的激活，间接激活AMPK， 进一步抑制mTOR及其下游的S6K；又或者OA+SOR直接激活了AMPK途 径，从而引起mTOR/S6K的抑制。而OA+SOR对mTOR通路的抑制作用， 引起了ROS堆积以及核糖核蛋白体的生成受抑制，最终诱导细胞凋亡。随着凋亡细胞的进一步增多，p53蛋白、PARP-1切割蛋白和CASP9-C/CASP3-C 蛋白表达升高。同时，增多的CASP3-C又会协助水解清除p53蛋白。OA对 SOR增效作用的信号通路机制如图13所示。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都 是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。