阅读说明：本技术 一种在基因芯片上形成交联倒置探针的方法 (Method for forming cross-linked inverted probe on gene chip ) 是由 周巍 何沛中 戴小军 简俊涛 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法。本发明还涉及通过本发明的方法获得的带有交联倒置探针的基因芯片以及跨链交叉连接用于在基因芯片上形成交联倒置探针的用途。(The invention provides a method for forming a cross-linked inverted probe on a gene chip by means of cross-chain cross-linking. The invention also relates to a gene chip with cross-linked inverted probes obtained by the method of the invention and the use of cross-chain cross-linking for forming cross-linked inverted probes on a gene chip.)

一种在基因芯片上形成交联倒置探针的方法

技术领域

本发明提供了在基因芯片上形成交联倒置探针的方法及其用途，以及通过所述方法制得的基因芯片。

背景技术

基因芯片技术是半导体工业技术里的微细加工技术和分子生物学的结合，在一个基片表面集成了大量密集排列的基因探针，通过检测每个探针的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，能够短时间内分析大量的基因，使人们迅速地读取和分析生物的基因信息。基因芯片技术不仅为人类基因组测序计划提前完成提供了重要手段，而且已经成为DNA测序和诊断系统的一个核心器件，它和DNA信息读取分析仪以及所得数据的分析软件一起组成了现代遗传学的信息系统和平台。

基因芯片的制备方法多种多样，根据原理主要有三种：原位合成法、合成点样法和微珠芯片。

原位合成法，包括原位光刻合成法和原位喷印合成法，都是把A、G、C、T四种碱基依次连接到基片的序列上，合成所需的寡核苷酸片段。Affymetrix、Centrillion和Agilent是全球最主要的原位合成芯片生产商，其中Affymetrix和Centrillion的原位合成芯片是通过原位光刻合成法生成的，而Agilent的原位合成芯片则是通过原位喷印合成法生成的。原位合成寡核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等；但通过原位合成法得到的芯片上的探针纯度不高，合成时会生成很多的无效/截短探针，而且通过光刻合成法得到的芯片上的探针的长度受到限制，通过喷印合成法得到的芯片上探针密度较低。此外，由于目前成熟的DNA合成技术都是从3’端向5’端合成，因此以上3家公司的基因芯片都是DNA探针5’端朝外，从而导致只能进行单一的杂交，不能直接进行延伸反应。

合成点样法是利用点样仪将事先合成好的探针直接点在芯片上形成微阵列，探针和介质之间的连接主要是利用化学基团之间形成的化学键来完成。不同厂家生产的点样仪基本原理类似，只是点样的方式有所区别。由于探针事先通过成熟的化学方法制成，所以方法简单，容易实现，但是由于点样仪的限制，微阵列的探针个数和密度受到局限，难以实现大密度高通量基因芯片。

微珠芯片是Illumina特有的基因芯片，其将合成完毕的探针通过其5’端连接到微珠上，再将微珠随机铺到芯片上，制得的是3’端朝外芯片，但是这种芯片只能达到中等探针密度。而且由于微珠的随机分布，所以Illumina每片芯片出厂都得先解码和质控，这也增加了其制作成本。

现有的通过光刻合成法生成的原位合成基因芯片具有高密度，但其上的探针长度受到限制，无效探针较多，且探针均为5’端朝外，只能进行单一的杂交检测，需要复杂的样品前处理步骤才能上芯片进行最后的测试。现有的通过合成点样法制得的基因芯片以及Illumina的微珠芯片，虽然是3’端朝外芯片，但只能达到低或中等探针密度，无法实现高通量检测。

因此，本发明所要解决的技术问题是克服现有的基因芯片无法同时实现探针3’端朝外和探针密度高的性能，提供一种3’端朝外的高密度基因芯片，以实现更高通量的检测，简化处理程序。

跨链交叉连接(又称为“链间交联”；interstrand cross-link，ICL)是异常生物活性的DNA损伤。内源性产生基因组DNA的跨链交叉连接可能导致衰老、神经退行性病变和癌症等重大疾病。导致DNA跨链交叉连接损伤的因素有很多，如体内代谢过程中产生的自由基和其它活泼中间体，环境中的紫外线和离子辐射，一些内源和外源化学物质等。其中，亲电烷化剂作为一类重要的化学物质在细胞体内可以分解成活泼的离子，这些离子能够与一条DNA链上的碱基发生烷化反应形成活泼中间体，进而与另一DNA链发生烷化反应，最终在细胞中形成DNA跨链交叉连接。DNA跨链交叉连接能阻止DNA链的分离，完全阻断DNA的复制或转录，若不能及时被修复，DNA跨链交叉连接的最终结果是细胞死亡。多种致癌物质和临床应用的抗癌药物都能够导致DNA跨链交叉连接损伤。环境中、食品中广泛存在的亚硝胺类化合物经过代谢活化后均能够生成烷基正离子与DNA碱基发生反应，导致DNA跨链交叉连接损伤并最终诱发癌症。临床上常用的烷化剂类抗癌药物也是通过导致癌细胞DNA跨链交叉连接损伤而发挥抗癌作用，如用于治疗脑瘤、白血病等的亚硝基脲类烷化剂、用于治疗恶性淋巴瘤等的氮芥类烷化剂等。然而，现有技术中尚未公开或暗示在测序领域中利用人为产生的跨链交叉连接的构思或技术启示。

发明内容

本发明的发明人对现有技术中已知的基因芯片进行了大量理论分析和实验研究，创造性地想到了对基因芯片表面的探针进行改造，借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成3’端朝外的探针。所述探针通过化学交联而非杂交固定在固相支持物上，并且由于3’端朝外而可以方便地直接进行链的延伸反应，从而使得能够大大提升有效探针的浓度，简化芯片的后续处理，更广泛地适用于芯片表面的原位化学反应，拓宽原位合成基因芯片的使用范围，使提取得到的基因组不用经过复杂的前处理步骤就能上芯片进行反应，具有更高的灵敏度和更低的检测限。

因此，本发明创造性地将跨链交叉连接应用于测序领域，在基因芯片上形成3’端朝外的探针。所述探针通过化学交联而非杂交固定在固相支持物上，能实现解决了人们长久以来一直想要克服的传统基因芯片在探针长度、无法进行延伸反应等方面的缺陷。

在第一方面，本发明提供了一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，

b)任选地，进行洗涤，

c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，

d)任选地，进行洗涤，

e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，

f)任选地，进行洗涤，

g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，

h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，

从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。

在另一方面，本发明提供了通过本发明所述的方法获得的带有交联倒置探针的基因芯片。

本发明还涉及一种带有交联倒置探针的基因芯片，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补。

本发明还涉及跨链交叉连接用于在基因芯片上形成交联倒置探针的用途。

附图说明

图1示出了利用aoNao交联制备3’端朝外芯片的原理。其中，在芯片探针5’端合成U碱基，使合成探针与其杂交，该合成探针的组成包括与芯片探针反向互补序列——U碱基——突出序列，而芯片探针和合成探针的U碱基刚好形成U碱基对。使用UDG酶切除U碱基产生空碱基对，然后加入交联剂aoNao使空碱基对交联，洗涤除去未交联上的合成探针，得到3’端朝外的探针芯片。

图2示出了反应顺序对交联效率的影响。左上图、右上图、左下图、右下图分别采用以下组合顺序：杂交切U后洗涤交联；切U杂交后洗涤交联；杂交后洗涤再切U洗涤后交联；切U后边杂交边交联。

图3示出了交联芯片的稳定性结果，其中上方A部分显示了AM1对应位置的荧光，位于深色背景上部的线段表示下方B部分中显示的荧光强度所对应的位置；B部分显示了A部分中线段处的荧光强度。编号1、2、3、4、5、6分别对应于表7中相应的处理条件。

图4示出了对芯片上的AM1探针和AM3探针同步进行特异性杂交，然后进行aoNao交联而得到的3’端朝外芯片的SAPE染色结果，其中位于四个角落的大方框表示针对AM1探针的结果，中间的小方框表示针对AM3探针的结果。

图5示出了所获得的3’端朝外芯片的延伸测试结果。

图6示出了AP对的ICL反应。

图7示出了aoNao的结构式以及利用aoNao交联DNA的反应机理。

具体实施方式

除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。

在本文中使用时，“基因芯片”指的是通过在固相支持物上原位合成寡核苷酸探针或者直接将大量预先制备的探针固化于支持物表面而得到的芯片。通过将基因芯片与样品杂交，然后利用芯片扫描仪和计算机对杂交信号进行检测和分析，能够获得样品的遗传信息。

在本文中使用时，“芯片探针”是指通过原位合成或直接将大量预先制备的探针固化等方式而被固定在固相支持物即芯片上的探针。

在本文中使用时，“U-芯片探针”指的是在基因芯片上的探针的5’端的最后一个碱基之后加上U碱基而获得的探针。

在本文中使用时，“合成探针”指的是从5’端到3’端依次包含至少与U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列的探针，其中U-芯片探针和合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对。

在本文中使用时，“突出序列”指的是位于合成探针中的U碱基的3’端的序列。

在本文中使用时，“倒置探针”指的是位于基因芯片上的3’端朝外的探针。

在本文中使用时，“U碱基”指的是尿嘧啶(uracil)碱基。

在本文中使用时，“跨链交叉连接”指的是两条互补DNA链之间的空碱基对或无碱基对(AP对)的共价连接，在体外通常借助于交联剂来实现。图6示出了AP对的ICL反应，其中“U”指的是脱氧尿苷。“跨链交叉连接”、“链间交联”和“交联”在本文中具有相同的含义，可互换使用。两条互补DNA链之间相互共价连接的空碱基对或无碱基对(AP对)位点称作“跨链交叉连接点”。

在本文中使用时，“带有交联倒置探针的基因芯片”是指这样的基因芯片，其中直接固定在基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向的序列反向互补。“带有交联倒置探针的基因芯片”与“交联芯片”在本文中具有相同的含义，可互换使用。芯片探针与合成探针通过上述跨链交叉连接反应产生的探针总体称作“交联倒置探针”。

在本文中使用时，UDG(uracil DNA glycosylase)指的是尿嘧啶DNA糖基化酶，其能够选择性断裂单链和双链DNA中脱氧尿苷的糖苷键，释放尿嘧啶，从而产生空碱基或无碱基位点。

在本文中使用时，“交联剂”指的是用于实现AP对的共价连接的物质，包括但不限于双官能烷化剂、铂化合物、补骨脂素和不饱和醛类，例如二胺类、N,N'-(萘-1,5-二基)双[2-(氨基氧基)乙酰胺](aoNao)、苯衍生物、其他包含双(氨基氧基)基团的物质等。更优选的交联剂诸如乙二胺、己二胺、癸二胺、aoNao等。本领域常用交联剂的实例参见，例如，Kohei Ichikawa等人,Interstrand cross-link of DNA by covalently linking a pairof abasic sites,Chem.Commun.,2012,48,2143-2145；Zhiyu Yang等人，Interstrandcross-links arising from strand breaks at true abasic sites in duplex DNA,Nucleic Acids Research,2017,Vol.45,No.11 6275–6283；Yu Hirano等人,Synthesisand application of interstrand cross-linked duplexes by covalently linking apair of abasic sites.Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry e63,Volume75；Todor Angelov等人,Generation of DNA Interstrand Cross-Links by Post-Synthetic Reductive Amination.Organic Letters 2009,11(3),661-664中，这些参考文献的全部内容通过引用整体并入本文。图7示出了aoNao的结构式以及利用aoNao交联DNA的反应机理。

在一个方面，本发明提供了一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，

b)任选地，进行洗涤，

c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，

d)任选地，进行洗涤，

e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，

f)任选地，进行洗涤，

g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，

h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，

从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。

应该理解的是，步骤c)、步骤e)和步骤g)的顺序可互换或者可同时进行。例如，可在步骤c)之前或之后进行步骤e)。例如，可在步骤e)之后进行步骤c)，并在步骤c)之后进行步骤g)或者同时进行步骤c)和步骤g)。

在本发明的一些实施方式中，步骤c)在步骤e)之前进行。

在本发明的一些实施方式中，步骤c)在步骤e)之后进行。

在本发明的一些实施方式中，步骤c)和步骤g)同时进行。

在根据本发明第一方面的方法的一种实施方式中，本发明提供了一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法依次包括以下步骤：

1)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，

2)任选地，进行洗涤，

3)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，

4)任选地，进行洗涤，

5)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，

6)任选地，进行洗涤，

7)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，

8)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，

从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。

在根据本发明第一方面的方法的另一种实施方式中，本发明提供了一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法依次包括以下步骤：

1)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，

2)任选地，进行洗涤，

3)向所述U-芯片探针和合成探针中加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，

4)任选地，进行洗涤，

5)使所述合成探针与所述U-芯片探针杂交，

6)任选地，进行洗涤，

7)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，

8)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，

从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。

在根据本发明第一方面的方法的另一种实施方式中，本发明提供了一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法依次包括以下步骤：

1)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，

2)任选地，进行洗涤，

3)向所述U-芯片探针和合成探针中加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，

4)任选地，进行洗涤，

5)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，同时使所述合成探针与所述U-芯片探针杂交，

6)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，

从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。

在本发明的实施方式中，在交联步骤中所使用的交联剂可以是本领域技术人员已知的能够用于链间交联的交联剂。在本发明的优选的实施方式中，所使用的交联剂是二胺类、aoNao、苯衍生物或其他包含双(氨基氧基)基团的物质。在本发明的更优选的实施方式中，所使用的交联剂是乙二胺、己二胺、癸二胺、aoNao。在本发明的最优选的实施方式中，所使用的交联剂是aoNao。

在本发明的一些实施方式中，交联在0℃-37℃下进行。在本发明的一些实施方式中，交联在4℃-37℃下进行。在本发明的一些实施方式中，交联在4℃-25℃下进行。在本发明的一些实施方式中，交联在25℃下进行。在本发明的一些实施方式中，交联在37℃下进行。

在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行4小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行6小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行8小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行10小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至4小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至2小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至1小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至4小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至2小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时至6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时至4小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行4小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行4小时至6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行6小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行10小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行4小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时。

上文针对本发明方法的各个步骤所述的各种实施方式和优选项可以相互组合(只要它们彼此之间不是内在矛盾的)，由此组合而形成的各种实施方式都视为本申请公开的一部分。

本发明还涉及一种带有交联倒置探针的基因芯片，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并非直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向的序列反向互补。

本发明还涉及通过本发明所述的方法获得的带有交联倒置探针的基因芯片。

本发明还涉及跨链交叉连接用于在基因芯片上形成交联倒置探针的用途。

此外，本发明还提供了以下实施方案：

实施方案1、一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，

b)任选地，进行洗涤，

c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，

d)任选地，进行洗涤，

e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，

f)任选地，进行洗涤，

g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，

h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，

从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。

实施方案2、如实施方案1所述的方法，其中所述用于跨链交叉连接的交联剂选自aoNao、二胺类。

实施方案3、如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述步骤c)在所述步骤e)之前或之后进行。

实施方案4、如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述步骤c)和所述步骤g)同时进行。

实施方案5、如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述步骤g)在室温或37℃下进行。

实施方案6、如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述步骤g)进行2小时至过夜、4小时至过夜、6小时至过夜、8小时至过夜、6小时、8小时或过夜。

实施方案7、如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述反向互补序列的长度为5-30个碱基、10-25个碱基或15-25个碱基。

实施方案8、通过前述实施方案中任一项所述的方法获得的带有交联倒置探针的基因芯片。

实施方案9、一种带有交联倒置探针的基因芯片，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点下游3’方向的序列反向互补。

实施方案10、如实施方案9所述的带有交联倒置探针的基因芯片，其中反向互补序列的长度为5-30个碱基、10-25个碱基或15-25个碱基。

实施方案11、跨链交叉连接用于在基因芯片上形成交联倒置探针的用途。

下面将结合附图和实施例以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不旨在限制本发明的保护范围。本发明的保护范围仅通过权利要求来限定。

实施例

除非另有说明，否则以下实施例中所采用的探针购买自上海捷瑞生物工程有限公司，酶及其buffer购买自New England Biolabs(NEB)公司。实施例中使用的芯片均是获自生捷科技(杭州)有限公司的Banff芯片，其是一种利用原位合成法合成的具有5’端朝外探针的基因芯片，但本领域技术人员应当理解，任何具有5’端朝外探针的基因芯片都适用于本发明。分子生物学中的常规操作流程可见例如《分子克隆实验指南》。实施例中所使用的探针或DNA片段的序列信息如下表1中所示。所述探针或DNA片段仅为了对本发明作出示例性的展示，而非限制本发明的探针或DNA片段。本领域技术人员应当理解，符合本发明探针设计和配对原则的任何探针或DNA序列均适用于本发明。

表1：所用探针或DNA片段的序列信息

实施例1：带有交联倒置探针的基因芯片的制备

1.1用二胺作为交联剂

1.1.1确定二胺种类对交联效率的影响

位于Banff芯片上的芯片探针的5’末端添加U碱基的方法以及合成含有U碱基且与芯片探针的5’端互补杂交的合成探针的方法均是本领域公知的。使添加U碱基后的Banff芯片与合成探针杂交，用1μL UDG酶(M0280S，购自NEB)在37℃下进行酶切1h，然后转移至50μLpH＝6.0的磷酸缓冲液中，加入3μL 5mM二胺、3μL 0.5M NaCNBH₃，室温交联过夜。对于对照，只进行芯片探针与合成探针的杂交步骤但不进行交联步骤，其它反应条件与使用二胺实验组相同。在表2中所述的洗涤条件下进行洗涤，其中对于使用二胺的实验组，在1mL的0.2MNaOH中洗涤5min(强碱洗涤)；对于对照，在1mL的4×SSC中洗涤5min(温和洗涤，不会破坏芯片探针与合成探针的杂交)。然后将芯片放入装有1μL 1μM的AMT-P和50μL 4×SSC的PCR管中，50℃杂交30min。将杂交后的芯片用1mL的4×SSC漂洗一次后置于50μL SAPE(链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白)溶液中避光染色30min。用1mL的4×SSC漂洗一次后，使用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)来检测荧光强度，以确定交联效率。结果显示：使用不同二胺时得到的荧光强度相似，其中乙二胺最优，可达到40％左右的交联效率。

表2：二胺种类对交联效率的影响

1.1.2确定乙二胺浓度对交联效率的影响

用乙二胺作为交联剂，根据1.1.1中所述的流程和条件进行交联。乙二胺的浓度和相应的荧光强度如表3中所示。结果显示：使用不同浓度的乙二胺时得到的荧光强度相似，其中50mM乙二胺最优，可达到70％左右的交联效率。

表3：乙二胺浓度对交联效率的影响

1.1.3确定交联时间对交联效率的影响

用乙二胺作为交联剂，根据1.1.1中所述的流程和条件进行交联，其中使用如表4中所列出的浓度和交联时间。结果显示：提高乙二胺浓度对荧光强度影响不大，而延长交联时间对荧光强度影响很大。其中，37℃下的荧光强度较低，推测原因可能是杂交探针脱落造成的。

表4：交联时间对交联效率的影响

乙二胺浓度	交联时间	荧光强度
			5mM	室温，5h	1800
50mM	室温，5h	1800
			5mM	室温，过夜	4400
5mM	37℃，过夜	2500

1.2用aoNao作为交联剂进行交联

1.2.1确定交联温度和交联时间对交联效率的影响

根据1.1.1中所述的流程和条件进行交联，其中使用aoNao作为交联剂，使用如表5中所列出的aoNao终浓度、温度和交联时间。结果显示：在37℃下的荧光强度略高于在25℃下的荧光强度，而在4℃下的荧光强度很低；交联2小时时荧光强度很低，交联在6小时时大致达到饱和。

表5：交联温度和交联时间对交联效率的影响

aoNao终浓度	温度	反应时间	荧光强度
				0.22mM	4℃	8h	800
0.22mM	25℃	8h	7000
				0.22mM	37℃	8h	7600
0.22mM	25℃	2h	3000
				0.22mM	25℃	4h	6400
0.22mM	25℃	6h	8200
				0.22mM	25℃	8h	8100

1.2.1确定反应顺序对交联效率的影响

在其他条件均相同的情况下，调整芯片探针与合成探针杂交(杂交)、利用UDG酶切除U碱基(切U)、洗涤以及芯片探针与合成探针交联(交联)的组合顺序，以确定反应顺序对交联效率的影响。分别采用以下组合顺序：①杂交切U后洗涤交联；②切U杂交后洗涤交联；③杂交后洗涤再切U洗涤后交联；④切U后边杂交边交联。结果如表6和图2中所示，其中采用反应顺序③时获得的实验背景最干净，在以下实施例中将采用该反应顺序。

表6：反应顺序对交联效率的影响

实施例2：其上的AM1探针已与AM1-U链内交联的芯片的稳定性

在200μL PCR管中加入49μL 4×SSC、1μL合成探针AM1-U，并加入U-Banff芯片。置于50℃烘箱30min。将芯片取出并在1mL的4×SSC中漂洗一次，然后在200μL PCR管中加入44μL ddH₂O、5μL UDG缓冲液、1μL UDG酶，将芯片放入后置于37℃烘箱1h。在200μL PCR管中加入41μL pH＝6的PBS缓冲液、6.5μL 2M aoNao，将芯片放入后置于室温下交联过夜。将芯片置于1mL的0.2M NaOH中清洗3min，并用1mL的4×SSC漂洗一次，得到了其上的AM1探针已进行链内交联的芯片。

使通过上述方法获得的芯片和未经任何处理的芯片经受下表7中所述的处理条件，然后放入装有1μL 1μM的AMT-P和50μL 4×SSC的PCR管中，50℃杂交30min。将杂交后的芯片用1mL的4×SSC漂洗一次后置于50μL SAPE溶液中避光染色30min。用1mL的4×SSC漂洗一次后，利用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)进行荧光信号检测。结果如表7和图3中所示。结果显示：交联芯片在强碱性条件下稳定性良好，且具有一定的耐高温性能。

表7：交联芯片的稳定性

编号	芯片	处理条件	荧光强度
				1	交联芯片	95℃5min	4800
2	交联芯片	95℃20min	3300
				3	交联芯片	0.2M NaOH 5min	8000
4	交联芯片	4×SSC 5min	8800
				5	未交联芯片	95℃5min	0
6	未交联芯片	0.2M NaOH 5min	0

实施例3：其上的AM1、AM3探针已分别与AM1-U、AM3-U链内交联的芯片的制备

在200μL PCR管中加入48μL 4×SSC、1μL合成探针AM1-U、1μL合成探针AM3-U，并加入U-Banff芯片。置于50℃烘箱30min。将芯片取出并在1mL的4×SSC中漂洗一次，然后在200μL PCR管中加入44μL ddH₂O、5μL UDG缓冲液、1μL UDG酶，将芯片放入后置于37℃烘箱1h。在200μL PCR管中加入41μL pH＝6的PBS缓冲液、6.5μL2M aoNao，将芯片放入后置于室温下交联过夜。将芯片置于1mL的0.2M NaOH中清洗3min，并用1mL的4×SSC漂洗一次。

将制备好的交联芯片放入装有1μL 1μM的AMT-P和50μL 4×SSC的PCR管中，50℃杂交30min。将杂交后的芯片用1mL的4×SSC漂洗一次后置于50μL SAPE溶液中避光染色30min。用1mL的4×SSC漂洗一次后，利用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)进行荧光信号检测。结果如图4中所示。结果显示：通过使用本发明的方法，能够实现对芯片上的多个探针同时进行特异性杂交交联，从而制备3’端朝外的芯片。

实施例4：芯片延伸测试

向49μL 4×SSC中加入如上所述制备的其上的AM1探针已与AM1-U链内交联的芯片以及1μL 1μM的延伸模板(AM1-T)，然后在50℃下杂交0.5h，用1mL的4×SSC清洗5min，接着加入Klenow exo-(M0212S，购自NEB)和dNTP(含有biotin-dUTP)(dCTP、dATP、dGTP浓度为1mM，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；biotin-dUTP为购自ThermoFisher的R0081，浓度为1mM)进行延伸测试(37℃，30min)。延伸完成后芯片用1mL的4×SSC漂洗一次后置于50μL SAPE溶液中避光染色30min。用1mL的4×SSC漂洗一次后，利用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)进行荧光信号检测，结果显示：仅芯片的AM1位置有荧光信号。这表明：通过本发明的方法所获得的带有交联倒置探针的基因芯片能够直接进行延伸反应。这样不仅能够简化SNP检测的流程、降低试剂成本和提高准确性，还能将本发明的交联芯片用于靶向测序等应用领域。

虽然已经阐明并描述了本发明的特定实施方式，但并不意味着这些实施方式阐明了并描述了本发明的所有可能形式。更确切地，用在本说明书中的文字仅仅是描述性的文字并非限制性的。对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本公开的一般范围的情况下，可以进行各种其他改变和修改。因此，在所附权利要求中，旨在包括在本发明范围内的所有这些改变和修改。