阅读说明：本技术 luminal型和HER2型乳腺癌诊断及预后的标志物、治疗用PPARγ抑制剂 (Diagnostic and prognostic marker for luminal and HER2 breast cancers, and therapeutic PPAR γ inhibitor ) 是由 程金科 郑铨 曹颖 屠俊 王田实 贺兼理 周炜 于 2020-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了成纤维细胞生长因子21FGF21或其编码基因、SENP2蛋白或其编码基因、SENP2蛋白第123位的丝氨酸、和/或脂肪酸转运受体CD36蛋白或其编码基因在作为诊断乳腺癌及其迁移或转移能力,预测乳腺癌的迁移或转移能力、以及乳腺癌病人生存率的标志物中的应用。luminal型和HER2型乳腺癌病人血清中FGF21的浓度与乳腺癌的转移成正相关性,所述FGF21通过ERK1/2磷酸化激活SENP2,促进乳腺癌细胞的脂质代谢过程,导致乳腺癌细胞侵袭和转移的能力增强。本发明利用中和抗体降低FGF21的浓度或者抑制乳腺癌细胞中SENP2的磷酸化激活等干预措施,可以有效抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。本发明利用PPARγ的抑制剂可以显著地抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移和转移。(The invention discloses application of fibroblast growth factor 21FGF21 or a coding gene thereof, SENP2 protein or a coding gene thereof, 123 th serine of SENP2 protein and/or fatty acid transport receptor CD36 protein or a coding gene thereof as a marker for diagnosing breast cancer and migration or metastasis capacity thereof, predicting migration or metastasis capacity of the breast cancer and survival rate of breast cancer patients. The concentration of FGF21 in the serum of a luminal breast cancer patient and a HER2 breast cancer patient is in positive correlation with breast cancer metastasis, and the FGF21 activates SENP2 through ERK1/2 phosphorylation to promote the lipid metabolic process of breast cancer cells, so that the invasion and metastasis capacity of the breast cancer cells are enhanced. The invention utilizes the intervention measures of reducing the concentration of FGF21 or inhibiting phosphorylation activation of SENP2 in breast cancer cells and the like by using a neutralizing antibody, and can effectively inhibit invasion and metastasis of the breast cancer cells. The invention can obviously inhibit the invasion, migration and metastasis of breast cancer cells by utilizing the inhibitor of PPAR gamma.)

luminal型和HER2型乳腺癌诊断及预后的标志物、治疗用PPAR γ抑制剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及用于luminal型和HER2型乳腺癌诊断、治疗及预后的标志物和组合物，具体涉及FGF21和SENP2蛋白在作为luminal型和HER2型乳腺癌标志物中的应用。

背景技术

众所周知乳腺癌是困扰西方女性健康的首要癌症，在中国的发病率要略低于西方发达国家。但从上世纪90年代开始，中国乳腺癌发病率的增长速度超过了全球平均水平。据不完全的数据统计，目前中国每年新增乳腺癌的病例超过17万起，每年因乳腺癌死亡的病例超过5万起，占到全球乳腺癌发病人数的12.2％和死亡人数的9.6％(Fan et al.,2014)。乳腺癌的临床表现形式并不单一，不同亚型之间的生物学和临床学特征存在着明显的区别。临床和病理上评估乳腺癌等级的传统指标包括病人年龄、肿瘤大小、组织学特征和叶腋处***的转移数目。目前乳腺癌分级最重要的鉴定指标是通过免疫组化方法检测三个标志物蛋白的表达，分别是***受体(oestrogen receptor，ER)，孕酮受体(progesteronereceptor，PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)。根据乳腺癌细胞表达标志物蛋白量的不同，乳腺癌一般被分为luminal A型、luminal B型、HER2型和基底样型(三阴性型)。针对不同类型的乳腺癌，其临床治疗措施也各不相同。LuminalA和B型主要是内分泌治疗，部分患者需加用化疗；HER2型乳腺癌患者除了化疗还需加用抗HER2药物治疗；基底样型乳腺癌的恶性程度最高，目前的主要治疗方法是化疗。尽管通过手术或药物治疗后，大部分乳腺癌患者的病情能够得到大大改善甚至完全根除，但针对转移性乳腺癌(metastatic breast cancer)的治疗仍然缺乏有效的靶向性手段，患者的生存状况仍然极其严峻，总体平均生存时间仅为2到3年。肿瘤细胞从原发灶扩散到其他器官的转移过程是十分精细复杂的，这一系列的过程包括原发肿瘤细胞侵袭浸润周围组织，渗透进入循环系统运输并且仍能存活下来，穿透血管壁进入新的组织形成微转移灶，细胞增殖形成新的肿瘤块(Lambert et al.,2017)。目前关于肿瘤转移的分子基础仍未阐明。现如今解析肿瘤转移最被广泛接受的理论是上皮-间质转换(epithelial–mesenchymal transitions，EMT)模型，即上皮细胞状的肿瘤细胞可以获得***的特性，如分解细胞外基质，侵袭转移等，从而使肿瘤细胞扩散转移。大量的实验证明调控EMT的分子基础主要涉及到几个重要的转录因子，包括Snail,Slug,Twist和Zeb1等(Lamouilleet al.,2014)。尽管EMT模型对大多数肿瘤的转移和扩散都是十分关键的，但至今仍有一些根本性的问题没有解决，例如：在生理病理条件下，这么多种异质性的信号分子如何同时汇聚在一起激活原本沉默的EMT通路；在肿瘤发展过程中EMT被激活的程度是否足够引发肿瘤转移；以及在启动EMT以后，又是何种胞外和胞内信号维持EMT的持续激活。另一方面，越来越多的研究发现在多样化异质性的原发肿瘤组织中不仅仅有肿瘤干细胞(cancer stemcells，CSCs)，也存在着一群转移起始细胞(metastasis-initiating cells)，发挥启动肿瘤转移的关键作用。学者们认为如果把这群细胞的来源途径和作用机制分析透彻，便能进行有效的干预，以达到控制肿瘤转移的目的，因此，针对肿瘤转移起始细胞的研究备受关注。

2017年，西班牙的Benitah研究组首次证明脂质代谢在肿瘤转移中的重要作用(Pascual et al.,2017)。他们将标记上荧光的口腔鳞状癌细胞原位注射到小鼠中，随着癌细胞的增殖，单个细胞的荧光信号会逐渐减弱，而增殖缓慢的细胞则会保留荧光强度。通过流式分选CD44⁺中不同荧光信号强度的细胞，作者比较了荧光信号强和弱两组细胞的基因表达谱，发现荧光信号弱的这组细胞中高表达与细胞增殖和***相关的基因，与此相反，荧光信号强的这组细胞中高表达与肿瘤转移和脂质代谢相关的基因。在这些变化的基因中，作者着重强调了脂肪酸转运受体CD36是转移起始细胞的一个关键标志物蛋白，分别利用RNA干扰以及中和抗体等实验论证CD36能够显著促进癌细胞的转移，更进一步证明CD36是通过摄取脂肪酸增强脂肪酸β氧化从而促进癌细胞的转移。此外，作者还分析了肺癌、膀胱癌和乳腺癌，同样能得到CD36具有促进这些肿瘤细胞转移的重要作用。因此，针对调控CD36和脂质代谢的机制研究将有助于我们寻找抑制肿瘤转移的作用靶点。

乳腺组织本身也是一个富含脂肪细胞的器官，非哺乳时期女性的乳腺组织中，脂肪细胞的量可以占到所有细胞的56％，即使在哺乳期，脂肪细胞也达到总量的35％，因此，作为组成成分最多的脂肪细胞被认为与乳腺癌的发生发展有着密不可分的关系。乳腺癌中脂肪细胞不仅仅为邻近的癌细胞提供脂肪酸等能量物质，它们还可以主动调控乳腺癌细胞的侵袭，转移以及耐药等过程。脂肪细胞释放的脂肪因子例如leptin、adiponectin、TNFα、IL-6等都对乳腺癌细胞的生命活动起到重要的调节作用(Choi et al.,2017)。近些年，由于在肥胖和胰岛素抵抗方面的特殊功效，脂肪因子FGF21愈发受到关注。FGF21属于成纤维生长因子家族，肝脏、脂肪、胰腺和软骨组织都能表达FGF21，其作用的受体是由具有酪氨酸激酶活性的FGF受体(FGFR)和β-Klotho组成。FGF21在葡萄糖代谢和脂质代谢过程中发挥着重要的调节作用。FGF21可以显著地降低肥胖或胰岛素抵抗小鼠的血糖浓度，促进白色脂肪棕色化(browning ofwhite adipocytes)，减轻体重，增强机体产热和能量消耗，提高胰岛素敏感性(Kharitonenkov et al.,2005)。此外，FGF21也能降低血清中甘油三酯和游离脂肪酸的水平，部分原因是通过增强脂肪组织摄取更多的脂肪酸(Schlein et al.,2016)。分子机制上，FGF21能够以自分泌或旁分泌的形式被脂肪细胞吸收，降低胞内PPARγ的SUMO化修饰，激活PPARγ的转录活性，从而促进PPARγ下游参与脂肪酸摄取与合成等相关下游基因的表达，降低血液中的游离脂肪酸水平，增强肌肉等器官对葡萄糖的吸收利用，提高胰岛素敏感性(Dutchak et al.,2012)。值得关注的是，本发明人课题组前期的一项研究已经证明在脂肪细胞内FGF21是通过SENP2来抑制PPARγ的SUMO化修饰，但这条通路是否在其他细胞中也发挥作用尚属未知。

SUMO化修饰是真核生物细胞中一种重要的蛋白质翻译后修饰，SENP2属于介导SUMO蛋白成熟以及蛋白质去SUMO化修饰的特异性蛋白酶家族成员之一。本发明人课题组之前围绕SENP2的生理功能展开了一系列的研究，例如心脏发育和肌肉形成等。近期本发明人课题组发表的研究则明确了脂肪细胞中的SENP2在脂质代谢中的重要调控功能(Zheng etal.,2018)。在肥胖过程中，SENP2主要通过促进转录因子PPARg和C/EBPα的表达以及降低PPARγ的SUMO化修饰水平，增强脂肪酸摄取、甘油三酯合成和存储等过程；而在脂肪组织SENP2特异性缺失的小鼠中，虽然高脂饮食喂养后的小鼠的体重相较于野生型更轻，但由于脂肪细胞不能有效地储存脂类物质，导致SENP2缺失小鼠出现高血脂、脂肪肝和胰岛素抵抗等现象，凸显出SENP2正调控脂质代谢的关键作用。

发明内容

本发明首次创新提出了成纤维细胞生长因子21(FGF21)或其编码基因在作为诊断luminal型和HER2型乳腺癌及其迁移或转移能力，预测luminal型和HER2型乳腺癌的迁移或转移能力、以及luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率的标志物中的应用。

本发明还提出了SENP2蛋白或其编码基因在作为诊断luminal型和HER2型乳腺癌及其迁移或转移能力，预测luminal型和HER2型乳腺癌的迁移或转移能力、以及luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率的标志物中的应用。

本发明还提出了SENP2蛋白第123位丝氨酸的磷酸化修饰在作为诊断luminal型和HER2型乳腺癌及其迁移或转移能力，预测luminal型和HER2型乳腺癌的迁移或转移能力、以及luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率的标志物中的应用。

本发明还提出了脂肪酸转运受体CD36蛋白或其编码基因在作为诊断luminal型和HER2型乳腺癌及其迁移或转移能力，预测luminal型和HER2型乳腺癌的迁移或转移能力、以及luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率的标志物中的应用。

本发明还提出了SENP2蛋白和CD36蛋白或其编码基因联合作为诊断luminal型和HER2型乳腺癌及其迁移或转移能力，预测luminal型和HER2型乳腺癌的迁移或转移能力、以及luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率的标志物中的应用。

本发明还提出了成纤维细胞生长因子21(FGF21)或其编码基因的检测试剂或抑制剂在制备luminal型和HER2型乳腺癌相关产品中的应用；其中，所述抑制剂包括FGF21中和抗体及其受体KLB的拮抗抗体，筛选抑制SENP2 S123磷酸化修饰的化合物。

本发明还提出了SENP2蛋白或其编码基因的检测试剂或抑制剂在制备luminal型和HER2型乳腺癌相关产品中的应用；其中，所述抑制剂包括抑制SENP2 S123磷酸化修饰的化合物。

本发明还提出了SENP2蛋白第123位丝氨酸磷酸化的检测试剂或去磷酸化修饰试剂在制备luminal型和HER2型乳腺癌相关产品中的应用。

本发明还提出了脂肪酸转运受体CD36蛋白或其编码基因的检测试剂或抑制剂在制备luminal型和HER2型乳腺癌相关产品中的应用。

本发明还提出了SENP2蛋白和CD36蛋白或其编码基因的联合检测试剂或联合抑制剂在制备luminal型和HER2型乳腺癌相关产品中的应用。

本发明还提出了蛋白激酶ERK1/2抑制剂在制备预防和/或治疗luminal型和HER2型乳腺癌的药物中的应用。其中，所述抑制剂用于预防或抑制luminal型和HER2型乳腺癌的迁移、转移能力，以及提高luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率。

本发明还提出了能够抑制脂肪酸代谢相关基因或蛋白的表达水平的抑制剂在制备预防和/或治疗luminal型和HER2型乳腺癌的药物中的应用。其中，所述抑制剂包括抑制脂肪酸摄取的化合物，抑制脂肪酸合成的化合物，抑制脂肪酸氧化的化合物；所述脂肪酸代谢相关基因或蛋白参与脂肪酸摄取、吸收及氧化磷酸化。

本发明还提出了转录因子PPARγ的三个抑制剂(GW9662、T0070907和GinsenosideRh1之任意的一种或几种)在制备治疗luminal型和/或HER2型乳腺癌(抗luminal型和/或HER2型乳腺癌)的药物中的应用。其中，所述抑制剂用于抑制luminal型和HER2型乳腺癌的侵袭、迁移、转移能力，以及提高luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率。

本发明中，所述转移包括骨转移、肺转移、淋巴转移等等，优选地为骨转移。

本发明中，所述检测试剂用于诊断luminal型和HER2型乳腺癌及其迁移或转移能力；本发明中，所述检测试剂是检测相关基因mRNA、DNA的寡核苷酸。

本发明中，所述抑制剂用于预防或抑制luminal型和HER2型乳腺癌的迁移、转移能力，以及提高luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率。

本发明中，所述去磷酸化修饰试剂用于预防或抑制luminal型和HER2型乳腺癌的迁移、转移能力，以及提高luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率。

本发明还提出了一种组合物，其包括如上所述的检测试剂或抑制剂或去磷酸化修饰试剂。所述组合物用于预测luminal型和HER2型乳腺癌发生转移的风险的几率；或用于预测luminal型和HER2型乳腺癌病人的生存率。

本发明提出了SENP2能够提高luminal型和HER2型乳腺癌细胞的脂肪酸摄取和氧化功能，促进luminal型和HER2型乳腺癌细胞的转移能力。SENP2高表达的luminal型和HER2型乳腺癌病人其术后生存率更低。成纤维细胞生长因子21(细胞因子或脂肪因子)FGF21能够促进luminal型和HER2型乳腺癌细胞的脂质代谢和转移能力，并且这种作用是依赖于SENP2的。成纤维细胞生长因子21(FGF21)通过蛋白激酶ERK1/2磷酸化SENP2蛋白的第123位的丝氨酸，突变该位点能够抑制成纤维细胞生长因子21(FGF21)对luminal型和HER2型乳腺癌细胞的作用。

本发明通过检测luminal型和HER2型乳腺癌病人标本切片中SENP2的表达情况，发现SENP2特异性地只表达在具有侵袭和转移倾向的肿瘤细胞中。本发明进一步以脂肪酸转运受体CD36作为转移起始细胞的标志物，发现SENP2和CD36在乳腺癌标本中具有一致的定位表达；在对luminal型和HER2型乳腺癌的临床病例进行分析后，也发现SENP2和CD36高表达的乳腺癌患者其生存率分别显著低于SENP2和CD36低表达的乳腺癌病人。

本发明在luminal型乳腺癌细胞系MCF-7中敲低SENP2能够显著抑制CD36及与脂肪酸氧化相关的基因表达，同时减弱MCF-7细胞的耗氧水平和迁移能力。本发明利用成纤维细胞生长因子21(FGF21)刺激MCF-7细胞，发现成纤维细胞生长因子21(FGF21)能够显著提升CD36及与脂质代谢相关基因的表达，促进脂肪酸摄取和氧化，增强MCF-7细胞的迁移能力，但这些现象在SENP2敲低的MCF-7细胞中被明显阻滞，说明成纤维细胞生长因子21(FGF21)发挥作用是依赖SENP2的功能。

本发明通过进一步研究发现成纤维细胞生长因子21(FGF21)通过蛋白激酶ERK1/2对SENP2蛋白第123位的丝氨酸进行磷酸化修饰，进而促进脂肪酸摄取和氧化，增强MCF-7细胞的迁移能力；突变该位点(SENP2蛋白第123位的丝氨酸)能够抑制成纤维细胞生长因子21(FGF21)促进MCF-7细胞转移的作用。因此，针对FGF21-SENP2通路设计防治luminal型和HER2型乳腺癌转移的靶点具有一定的应用前景。

本发明还进一步提供了一种诊断luminal型和HER2型乳腺癌及其迁移或转移能力，预测luminal型和HER2型乳腺癌的迁移或转移能力、以及预测luminal型和HER2型乳腺癌病人生存率的方法，以成纤维细胞生长因子21FGF21或其编码基因、SENP2蛋白或其编码基因、SENP2蛋白第123位的丝氨酸、脂肪酸转运受体CD36蛋白或其编码基因、或，SENP2蛋白和CD36蛋白或其编码基因为标志物，进行相关诊断和预测。

本发明还进一步提供了一种筛选抑制SENP2 S123磷酸化修饰的化合物的方法，以FGF21和SENP2 S123磷酸化修饰为标志，来制备FGF21中和抗体及其受体KLB的拮抗抗体，筛选抑制SENP2 S123磷酸化修饰的化合物。

与现有技术相比，本发明显著的有益效果在于：

本发明首次发现：鉴定了去SUMO化蛋白酶SENP2的磷酸化修饰位点，发现了FGF21-SENP2轴的信号调控路径，研究了该通路在脂肪酸代谢及乳腺癌转移方面的意义。本发明将进一步促进对于脂肪酸代谢与肿瘤转移的认识。本发明解析了FGF21-SENP2轴对luminal型和HER2型乳腺癌转移的作用与机制，能够启发新的抑制肿瘤转移的策略。本发明证明PPARγ的三个抑制剂(GW9662、T0070907和Ginsenoside Rh1)能够显著抑制luminal型和HER2型乳腺癌侵袭、迁移和转移。

本发明提出了SENP2第123位的丝氨酸(S123)发生磷酸化是FGF21影响luminal型和HER2型乳腺癌脂质代谢和转移所必需的。本发明提出了一种调控luminal型和HER2型乳腺癌转移的全新机制：以FGF21和SENP2 S123磷酸化修饰为标志，来制备FGF21中和抗体及其受体KLB的拮抗抗体，筛选抑制SENP2S123磷酸化修饰的化合物，这些抗体及化合物可以通过FGF21-SENP2信号通路调控luminal型和HER2型乳腺癌脂代谢和转移，从而具有应用前景。

综上，本发明公开的FGF21-SENP2轴的信号调控路径对luminal型和HER2型乳腺癌细胞的脂质代谢的影响，对于luminal型和HER2型乳腺癌转移的防治具有重要意义。

本发明中，对各术语的解释如下：

成纤维细胞生长因子21(FGF21)是指Fibroblast growth factor 21，是一个存在于哺乳动物中由FGF21基因编码的蛋白质，属于成纤维生长因子家族内分泌亚科的一员。

SENP2蛋白是指Sentrin-specific protease 2，是由人源SENP2基因编码的特异性SUMO蛋白酶。

脂肪酸转运受体CD36是指由人源CD36基因编码的蛋白质，是细胞表面蛋白B类清道夫受体家族的成员。SMA蛋白是指Smooth muscle actin，是由人源ACTA2基因编码的平滑肌肌动蛋白。

ACSL蛋白是指Acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member 1，是由人源ACSL1基因编码的连接酶，负责将游离的脂肪酸催化为脂肪酰辅酶A酯。

FA2H蛋白是指FattyAcid 2-Hydroxylase，是由人源FA2H基因编码的脂肪酸羟化酶，负责催化合成2-羟基鞘磷脂。

ERK蛋白是指extracellular signal-regulated kinase，是由人源MAPK基因编码的促***原活化蛋白激酶。

GAPDH蛋白是指Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，是由人源GAPDH基因编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

TUBULIN蛋白是指Tubulin Beta Class I，是由人源TUBB基因编码的细胞骨架微管蛋白。

PPAR蛋白是指Peroxisome Proliferator Activated Receptor，是由人源PPAR基因编码的过氧化物酶体增殖因子激活受体。

SCH772984(SCH)是指特异性抑制ERK1/2磷酸激酶活性的化合物。

GW9662是指一种特异性抑制PPARγ转录活性的化合物，其分子式为C₁₃H₉ClN₂O₃，分子量为276.68，化学结构式如下式A所示：

T0070907是指一种特异性抑制PPARγ转录活性的化合物，其分子式为C₁₂H₈ClN₃O₃，分子量为277.66，化学结构式如下式B所示：

Ginsenoside Rh1是指一种特异性抑制PPARγ转录活性的化合物，其分子式为C₃₆H₆₂O₉，分子量为638.87，化学结构式如下式C所示：

附图说明

图1为SENP2在HER2型乳腺癌标本中的表达定位的示意图；a图显示SENP2在非侵袭性乳腺癌巢中表达水平较低，且没有细胞特异性；b图显示SENP2在侵袭性癌巢中特异性并且高水平地表达在侵袭前缘处的细胞；c图显示表达SMA的肌上皮细胞完整地包裹住乳腺癌细胞；d图显示侵袭出来的癌细胞突破肌上皮细胞的包围。

图2为SENP2影响乳腺癌细胞迁移能力的示意图；其中，a图为敲低阴性对照、敲低SENP2和过表达SENP2的luminal型乳腺癌细胞MCF-7迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图；b图为a图中细胞计数的统计图。敲低SENP2抑制MCF-7细胞的迁移能力，反之，过表达SENP2能够促进MCF-7细胞的迁移。

图3为SENP2影响MCF-7细胞在裸鼠体内转移的示意图；其中，a图敲低阴性对照组luminal型乳腺癌细胞MCF-7经尾静脉注射裸鼠6周后，活体成像显示裸鼠肺部和脊柱有转移癌巢的形成；b图为敲低SENP2组乳腺癌细胞MCF-7经尾静脉注射裸鼠6周后，活体成像显示没有转移癌巢的出现；c图为过表达SENP2组乳腺癌细胞MCF-7经尾静脉注射裸鼠6周后，活体成像显示肺部和脊柱有转移癌巢的形成。敲低乳腺癌细胞中的SENP2完全抑制MCF-7细胞在裸鼠体内的转移，反之，过表达SENP2能够促进MCF-7细胞在裸鼠体内的转移。

图4为SENP2表达水平与luminal型和HER2型乳腺癌患者生存情况相关性示意图。癌组织中SENP2表达更高的luminal型和HER2型乳腺癌患者其整体生存率要显著低于SENP2低表达的患者。其中，“表达低”是指SENP2表达水平低，“表达高”是指SENP2表达水平高。

图5为SENP2调控luminal型乳腺癌细胞MCF-7脂肪酸代谢通路的示意图；将敲低阴性对照和敲低SENP2的MCF-7细胞中表达量不相同的基因进行分析，在敲低SENP2的MCF-7细胞表达水平显著下降的基因中，脂肪酸代谢通路和PPAR信号通路是下调最显著的两个信号通路。

图6为SENP2调控脂肪酸代谢通路关键基因表达的示意图。在敲低SENP2的luminal型乳腺癌细胞MCF-7中，参与脂肪酸摄取及氧化的关键基因表达均显著减少；反之，在过表达SENP2的MCF-7细胞中，参与脂肪酸摄取及氧化的关键基因的表达均明显升高。

图7为SENP2蛋白和CD36蛋白在HER2型乳腺癌病人标本中共定位的示意图；其中，a图显示SENP2蛋白在乳腺癌组织中特异性地表达在侵袭性细胞；b图显示CD36蛋白在乳腺癌组织中也特异性地表达在相同的侵袭性细胞。SENP2与脂肪酸摄取关键蛋白CD36均表达在具有转移倾向的乳腺癌细胞中。

图8为SENP2影响luminal型乳腺癌细胞MCF-7的脂肪酸摄取和氧化功能；其中，a图为敲低阴性对照组、敲低SENP2和过表达SENP2的MCF-7细胞摄取外源性脂肪酸的能力示意图；b图为敲低阴性对照组、敲低SENP2和过表达SENP2的MCF-7细胞的氧气消耗能力示意图。敲低SENP2的MCF-7细胞其摄取脂肪酸和线粒体的氧化磷酸化水平均被下调，反之，过表达SENP2后能够显著增强MCF-7细胞的脂肪酸摄取和氧化磷酸化能力。

图9为FGF21促进脂肪酸摄取及氧化过程关键基因表达的示意图。由图9可知，FGF21可以显著地增加luminal型乳腺癌细胞MCF-7中CD36,ACSL1和FA2H的基因表达水平。

图10为FGF21依赖SENP2促进CD36蛋白表达的示意图。FGF21可以促进CD36的蛋白表达，但在SENP2敲低的乳腺癌细胞中，FGF21对CD36的作用被显著削弱。

图11为FGF21促进luminal型乳腺癌细胞MCF-7摄取和氧化脂肪酸的能力依赖于SENP2的示意图；其中，a图为MCF-7细胞经过对照试剂或FGF21处理后摄取外源性脂肪酸能力的示意图；b图为MCF-7细胞经过对照试剂或FGF21处理后消耗氧气速率的示意图。FGF21可以促进luminal型乳腺癌细胞MCF-7摄取和氧化脂肪酸的能力，但在SENP2敲低的MCF-7细胞中，FGF21的这种作用被显著削弱。

图12为FGF21促进luminal型乳腺癌细胞MCF-7迁移作用依赖于SENP2的示意图；a图中(i)为敲低阴性对照组MCF-7细胞在阴性对照试剂处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(ii)为敲低阴性对照组MCF-7细胞在FGF21处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(iii)为敲低SENP2的MCF-7细胞在阴性对照试剂处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(iv)为敲低SENP2的MCF-7细胞在FGF21处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图；b图为a图中四组细胞计数的统计学分析结果。FGF21可以促进MCF-7细胞的迁移能力，但在SENP2敲低的MCF-7细胞中，FGF21的这种作用被显著削弱。

图13为FGF21通过ERK1/2信号通路影响CD36表达的示意图。FGF21可以促进luminal型乳腺癌细胞MCF-7中CD36的表达，而在添加ERK1/2抑制剂SCH之后便能阻断FGF21对CD36的促进作用。

图14为质谱鉴定第123位丝氨酸是SENP2的磷酸化位点的示意图。

图15为FGF21通过ERK1/2信号通路影响SENP2 S123磷酸化修饰的示意图。ERK1/2的抑制剂可以阻断FGF21对SENP2 S123的磷酸化修饰的促进作用。

图16为FGF21通过SENP2 S123磷酸化修饰影响CD36蛋白表达的示意图。当把SENP2S123突变为不能发生磷酸化修饰的S123A时，FGF21促进CD36蛋白表达的作用被明显阻断。

图17为FGF21通过SENP2 S123磷酸化修饰影响luminal型乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的示意图；a图中(i)为敲低SENP2的MCF-7细胞在阴性对照试剂处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(ii)为敲低SENP2的MCF-7细胞在FGF21处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(iii)为敲低SENP2再回补野生型SENP2的MCF-7细胞在阴性对照试剂处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(iv)为敲低SENP2再回补野生型SENP2的MCF-7细胞在FGF21处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(v)为敲低SENP2再回补突变型SENP2的MCF-7细胞在阴性对照试剂处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(vi)为敲低SENP2再回补突变型SENP2的MCF-7细胞在FGF21处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图；b图为a图中六组细胞计数的统计学分析结果。当把SENP2S123突变为不能发生磷酸化修饰的S123A时，FGF21促进乳腺癌细胞转移的作用被明显阻断。

图18为luminal型和HER2型乳腺癌患者的血清FGF21浓度与乳腺癌转移的相关性示意图；其中，a图显示非转移性和转移性luminal型和HER2型乳腺癌患者血清中FGF21浓度值；b图为统计分析血清中FGF21浓度分别在低于或高于50pg/ml时，非转移性和转移性患者数量所占的比例示意图。在luminal型和HER2型乳腺癌患者中，非转移性的乳腺癌患者血清中FGF21的平均浓度比要低于转移性的乳腺癌患者，并且当血清中FGF21浓度小于50pg/ml时，只有40％左右的乳腺癌患者发生了肿瘤转移，而当血清中FGF21大于50pg/ml时，接近80％的乳腺癌患者都发生了肿瘤转移。

图19为PPARγ的三种抑制剂显著地减缓/抑制luminal型乳腺癌细胞的迁移和转移的结果图；其中，a图中(i)为MCF-7细胞在阴性对照试剂和空白试剂处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(ii)为MCF-7细胞在阴性对照试剂和GW9662(1μM)处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(iii)为MCF-7细胞在阴性对照试剂和T0070907(1μM)处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(iv)为MCF-7细胞在阴性对照试剂和Ginsenoside Rh1(100μM)处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(v)为MCF-7细胞在FGF21(200ng/ml)和空白试剂处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(vi)为MCF-7细胞在FGF21(200ng/ml)和GW9662(1μM)处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(vii)为MCF-7细胞在FGF21(200ng/ml)和T0070907(1μM)处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图，(viii)为MCF-7细胞在FGF21(200ng/ml)和GinsenosideRh1(100μM)处理后迁移穿过transwell小室的结晶紫染色图；b图为a图中八组细胞计数的统计学分析结果；c图中(i)MCF-7经尾静脉注射裸鼠，再给予腹腔注射阴性对照试剂6周后，活体成像显示的裸鼠肺部的转移癌巢，(ii)为MCF-7经尾静脉注射裸鼠，再给予腹腔注射FGF21和空白试剂6周后，活体成像显示的裸鼠肺部的转移癌巢，(iii)为MCF-7经尾静脉注射裸鼠，再给予腹腔注射FGF21和GW9662试剂6周后，活体成像显示的裸鼠肺部的转移癌巢，(iv)为MCF-7经尾静脉注射裸鼠，再给予腹腔注射FGF21和T0070907试剂6周后，活体成像显示的裸鼠肺部的转移癌巢，(v)为MCF-7经尾静脉注射裸鼠，再给予腹腔注射FGF21和Ginsenoside Rh1试剂6周后，活体成像显示的裸鼠肺部的转移癌巢，其中c图下方数字从左至右依次为10000、20000、30000、40000、50000。结果显示，三种PPARγ的抑制剂(GW9662、T0070907、Ginsenoside Rh1)都能有效地抑制乳腺癌细胞MCF-7的体外迁移和体内转移。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

以下具体实施例中，涉及的乳腺癌细胞MCF-7分为以下5种：

敲低阴性对照(shNC)，其是指使用不针对任何基因序列的干扰RNA建立的稳定表达细胞系；

敲低SENP2(shSENP2)，其是指使用针对SENP2编码基因序列设计的干扰RNA建立的稳定表达细胞系；

过表达SENP2(OE-SENP2)，其是指使用慢病毒感染的方法建立的稳定表达SENP2蛋白的细胞系；

敲低SENP2回补SENP2野生型(shSENP2-WT)，其是指在敲低SENP2(shSENP2)细胞的基础上再使用慢病毒感染的方法建立的稳定表达SENP2野生型蛋白的细胞系；

敲低SENP2回补SENP2突变型(shSENP2-S123A)，其是指在敲低SENP2(shSENP2)细胞的基础上再使用慢病毒感染的方法建立的稳定表达SENP2突变型蛋白的细胞系；

“OE-SENP2”和“shSENP2-WT”、“shSENP2-S123A”的关系：

OE-SENP2是指在不清除细胞内源性SENP2的情况下，通过慢病毒感染的方法大量表达外源性SENP2野生型蛋白的细胞系；shSENP2-WT是指在清除细胞内源性SENP2的情况下，再通过慢病毒感染的方法大量表达外源性SENP2野生型蛋白的细胞系；shSENP2-S123A是指在清除细胞内源性SENP2的情况下，再通过慢病毒感染的方法大量表达外源性SENP2突变型蛋白的细胞系。

实施例1免疫组织化学方法鉴定SENP2和CD36等蛋白在乳腺癌标本中的表达定位

乳腺癌组织通过穿刺或手术等途径获得后，经过4％多聚甲醛固定48小时后，梯度酒精(75％酒精24小时，85％酒精2小时，95％酒精2小时，100％酒精2小时)和二甲苯脱水以及石蜡浸泡包埋，切成5μm厚的薄片贴附于载玻片上，用二甲苯和梯度酒精脱蜡，10％过氧化氢处理，通过柠檬酸盐溶液进行抗原修复，10％山羊血清封闭后再分别加入CD36(Abcam，ab133625)和SENP2(Genetex，GTX111245)抗体在4℃孵育过夜，用生物素标记的羊抗兔抗体和辣根过氧化物酶标记的抗羊抗体各室温孵育1小时，DAB显色后再用苏木精染核，脱水后封片，用倒置显微镜观察并拍摄。

如图1所示，在非侵袭性的乳腺癌巢中，SENP2蛋白表达水平较低，且没有细胞特异性(图1a)；而在侵袭性癌巢中，SENP2蛋白特异性地表达在侵袭前缘处的细胞(图1b)。

如图7所示，CD36蛋白在乳腺癌组织中也特异性地表达在侵袭前缘处的癌细胞。SENP2蛋白与CD36蛋白在乳腺癌组织中具有一致的表达定位。

实施例2乳腺癌细胞迁移能力的鉴定

(2.1)敲低SENP2，FGF21对乳腺癌细胞迁移的影响

上述5种MCF-7细胞在正常条件时培养在含10％胎牛血清的高糖培养基中，在实验条件时，将培养基更换为无血清的高糖培养基饥饿培养12小时后，用0.1％的胰蛋白酶消化细胞，再收集到离心管中，800rpm速度离心获得细胞沉淀，用无血清的高糖培养基将细胞吹散混匀，通过细胞计数仪测量细胞数目，按每20000个细胞在100ul无血清的培养基中种植于24孔transwell板的上层小室中，添加FGF21是指在培养基中加入适量体积的FGF21溶液，使FGF21的终浓度为200ng/ml；添加阴性对照是指在培养基中加入等量体积的蒸馏水，下层添加650ul含10％血清的培养基，将24孔transwell板置于37℃细胞培养箱培养24-48小时，对上层小室的细胞进行固定和结晶紫染色，用倒置显微镜观察并拍摄。

如图2所示，与敲低阴性对照组(shNC)相比，敲低SENP2的MCF-7细胞(shSENP2)其迁移能力显著减弱，反之，过表达SENP2(OE-SENP2)能够促进乳腺癌细胞的迁移。

如图12所示，相对于阴性对照试剂蒸馏水，FGF21能够促进MCF-7细胞的迁移能力，但FGF21的这种促进作用在敲低SENP2的MCF-7细胞上显著减弱，说明FGF21促进MCF-7细胞迁移的过程是依赖SENP2的。

如图17所示，FGF21对敲低SENP2的MCF-7细胞(shSENP2)没有明显地促进迁移作用；在敲低SENP2后回补野生型SENP2的MCF-7细胞(shSENP2-WT)中，FGF21可以显著促进细胞的迁移能力(P＝0.0053)；而在敲低SENP2后回补突变型SENP2的MCF-7细胞(shSENP2-S123A)中，FGF21不能提高MCF-7细胞的迁移水平。

(2.2)PPARγ抑制剂对乳腺癌细胞迁移的影响

MCF-7细胞在正常条件时培养在含10％胎牛血清的高糖培养基中，在实验条件时，将培养基更换为无血清的高糖培养基饥饿培养12小时后，用0.1％的胰蛋白酶消化细胞，再收集到离心管中，800rpm速度离心获得细胞沉淀，用无血清的高糖培养基将细胞吹散混匀，通过细胞计数仪测量细胞数目，按每20000个细胞在100ul无血清的培养基中种植于24孔transwell板的上层小室中，按比例分别添加阴性对照试剂(剂量为：1微升)，阴性对照试剂(剂量为：1微升)加终浓度为1μM的GW9662，阴性对照试剂(剂量为：1微升)加终浓度为1μM的T0070907，阴性对照试剂(剂量为：1微升)加终浓度为100μM的Ginsenoside Rh1，终浓度为200ng/ml的FGF21，终浓度为200ng/ml的FGF21加终浓度为1μM的GW9662，终浓度为200ng/ml的FGF21加终浓度为1μM的T0070907，终浓度为200ng/ml的FGF21加终浓度为100μM的Ginsenoside Rh1。添加阴性对照是指在培养基中加入1微升的二甲基亚砜(DMSO)。下室添加650ul含20％血清的培养基，将24孔transwell板置于37℃细胞培养箱培养24-48小时，对上层小室的细胞进行固定和结晶紫染色，用倒置显微镜观察并拍摄。

如图19a和19b所示，FGF21能明显地增强乳腺癌细胞MCF-7的迁移能力，而三种PPARγ的抑制剂GW9662、T0070907、Ginsenoside Rh1显著地抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移能力。其中，a图中(ii)、(iii)和(iv)组中的转移细胞数目小于(i)组，(v)组的转移细胞数目大于(i)组，(vi)、(vii)和(viii)组的转移细胞数目小于(i)和(v)组。

实施例3小鼠乳腺癌转移模型

在6周龄雌性裸鼠的背面颈部皮下植入***药片，三天后通过尾静脉分别注射50万个敲低阴性对照、敲低SENP2和过表达SENP2的乳腺癌MCF-7细胞，经过6周饲养后用活体成像仪观察并拍摄乳腺癌细胞在裸鼠体内的转移情况。

如图3所示，与敲低阴性对照组相比，敲低SENP2的乳腺癌细胞几乎没有在裸鼠体内的发生转移现象，相反地，过表达SENP2能够恢复乳腺癌细胞在裸鼠体内的转移。

在6周龄雌性裸鼠的背面颈部皮下植入***药片，3天后通过尾静脉分别注射50万个乳腺癌MCF-7细胞，由此开始每3天分别腹腔注射一次，注射溶液分别为阴性对照试剂(剂量为：10毫升/千克)、FGF21(剂量为：1.5毫克/千克)加阴性对照试剂(剂量为：10毫升/千克)、FGF21(剂量为：1.5毫克/千克)加GW9662(剂量为1毫克/千克)、FGF21(剂量为：1.5毫克/千克)加T0070907(剂量为1毫克/千克)和FGF21(剂量为：1.5毫克/千克)加GinsenosideRh1(剂量为20毫克/千克)。注射6周后，用活体成像仪观察并拍摄乳腺癌MCF-7细胞在裸鼠体内的转移情况。

如图19c所示，与阴性对照相比，FGF21促进乳腺癌MCF-7细胞在裸鼠肺部的转移能力，而三种PPARγ的抑制剂GW9662、T0070907、Ginsenoside Rh1显著地减缓/抑制乳腺癌MCF-7细胞在裸鼠肺部的转移能力。其中(ii)组的肺部转移肿瘤大于(i)组，(iii)、(iv)和(v)组的肺部转移肿瘤小于(i)和(ii)组。

实施例4乳腺癌组织SENP2的表达与病人的存活率关系

利用TCGA数据库下载乳腺癌病人的基因表达和临床信息，依据SENP2的表达高低将病人进行排序，比较高表达组和低表达组病人的存活时间和状态。

如图4所示，癌组织中SENP2表达更高的乳腺癌患者其整体生存率要显著低于SENP2低表达的患者。

实施例5RNAsequence分析乳腺癌细胞基因表达差异

收集敲低阴性对照和敲低SENP2的乳腺癌细胞MCF-7的总RNA，经过高通量测序，分析并筛选出不同处理组之间表达差异的基因，通过GO或者GESA分析差异基因所属的生物学途径和信号通路，如图5所示，信号通路分析发现敲低SENP2的MCF-7细胞中与脂肪酸代谢相关的基因表达水平显著下调，PPAR信号通路基因的表达也显著下调。

实施例6逆转录和实时定量PCR检测乳腺癌基因表达

敲低阴性对照、敲低SENP2、过表达SENP2(OE-SENP2)的乳腺癌细胞MCF-7，经过阴性对照试剂蒸馏水或FGF21处理24小时后用Trizol抽提法获取总RNA，经过逆转录酶反转成cDNA，通过荧光探针PCR反应来检测目的基因的表达。

如图6所示，与敲低阴性对照相比，敲低SENP2的乳腺癌细胞中参与脂肪酸摄取(CD36)及氧化(ACSL1,FA2H)的关键基因表达均显著减少；反之，在回补SENP2的乳腺癌细胞中，参与脂肪酸摄取及氧化的关键基因的表达均明显升高。

如图9所示，与阴性对照试剂蒸馏水相比，FGF21处理能够显著提高CD36，ACSL1和FA2H的表达。

实施例7乳腺癌细胞摄取游离脂肪酸

敲低阴性对照、敲低SENP2或过表达SENP2的乳腺癌细胞MCF-7经过阴性对照试剂蒸馏水或FGF21处理24小时后，用0.1％的胰蛋白酶消化，800rpm速率离心后用完全培养基重悬，通过细胞计数仪对细胞数量计数按50000个细胞每100ul铺种在96孔板中，12小时后更换无血清的培养基，2小时后添加阴性对照试剂蒸馏水或FGF21处理4小时，加入带标记的游离脂肪酸，37℃培养1小时后用酶标仪检测波长Ex/Em＝485/515nm的荧光值。

如图8a所示，与敲低阴性对照(shNC)相比，敲低SENP2的MCF-7细胞(shSENP2)其摄取脂肪酸的能力显著减弱，反之，过表达SENP2后能够显著增强MCF-7细胞的脂肪酸摄取能力。

如图11a所示，与阴性对照试剂蒸馏水相比，FGF21可以促进MCF-7细胞摄取脂肪酸的能力，但在敲低SENP2的MCF-7细胞中，FGF21的这种作用被显著削弱。

实施例8Seahorse实验鉴定乳腺癌细胞的氧化磷酸化水平

敲低阴性对照、敲低SENP2或过表达SENP2的乳腺癌细胞MCF-7经过阴性对照试剂蒸馏水或FGF21处理24小时后，用0.1％的胰蛋白酶消化，800rpm速率离心后用完全培养基重悬，通过细胞计数仪对细胞数量计数按10000个细胞每100ul铺种在XF96-well微型板中，同时添加阴性对照试剂蒸馏水或FGF21，将96孔板置于37℃培养箱中培养12小时后更换基础培养基，配制2μM oligomycin、0.25μM FCCP和0.5μM rotenone及antimycin反应液，分别用于检测备用呼吸能力、最大呼吸值和ATP生成情况，利用XF96分析仪读取和记录细胞消耗氧气的速率。

如图8b所示，与敲低阴性对照相比，敲低SENP2的MCF-7细胞其氧化脂肪酸的能力显著减弱，反之，过表达SENP2后能够显著增强MCF-7细胞的氧化脂肪酸的能力。

如图11b所示，与阴性对照试剂蒸馏水相比，FGF21可以促进MCF-7细胞氧化脂肪酸的能力，但在敲低SENP2的MCF-7细胞中，FGF21的这种作用被显著削弱。

实施例9Western blot实验检测乳腺癌细胞的蛋白表达水平

敲低阴性对照、敲低SENP2或敲低SENP2后回补野生型SENP2和敲低SENP2后回补突变型SENP2的乳腺癌细胞MCF-7分别在添加阴性对照试剂蒸馏水或添加FGF21或添加SCH772984的完全培养基中贴壁生长24小时后，用PBS漂洗一遍，1％SDS溶液裂解细胞，95℃加热15分钟，将制备好的蛋白样品进行Western blot实验。

如图10所示，用FGF21分别处理敲低阴性对照和敲低SENP2的乳腺癌细胞MCF-71小时，收集蛋白样，通过westernblot实验，检测CD36、SENP2和GAPDH的蛋白水平，结果表明，敲低SENP2会降低CD36的蛋白水平，FGF21可以增加CD36的蛋白水平，但在敲低SENP2的MCF-7细胞中FGF21对CD36的作用被显著削弱。

如图13所示，分别用FGF21和SCH772984处理乳腺癌细胞MCF-71小时，收集蛋白样品，通过westernblot实验，检测CD36、磷酸化的ERK1/2、ERK1/2和TUBULIN的蛋白水平，结果表明在MCF-7细胞中添加ERK1/2的抑制剂SCH772984后，FGF21促进CD36表达的作用被显著抑制。

如图15所示，在乳腺癌细胞MCF-7中过表达FLAG-SENP2，然后分别用FGF21和SCH772984处理细胞1小时，通过免疫共沉淀方法，再用westernblot实验检测FLAG、S123位磷酸化的SENP2、磷酸化的ERK、ERK和GAPDH的蛋白水平，结果表明ERK1/2的抑制剂可以阻断FGF21对SENP2 S123的磷酸化修饰的促进作用。

如图16所示，在敲低SENP2的乳腺癌细胞MCF-7中，分别回补对照(Vec)、野生型(WT)和磷酸化位点突变(S123A)的SENP2，用FGF21分别处理三组细胞1小时，通过westernblot实验检测CD36、FLAG、P-ERK、ERK和GAPDH的蛋白水平，结果表明FGF21通过SENP2 S123磷酸化修饰影响CD36的表达，当把SENP2 S123突变为不能发生磷酸化修饰的S123A时，FGF21对CD36的促表达作用被明显阻断。

实施例10SENP2磷酸化位点鉴定方法

在乳腺癌细胞MCF-7中过表达FLAG-SENP2质粒36小时后，收集细胞，在冰上用裂解液[50mM Tris-HCl(pH 7.4),400mM NaCl,1％Triton X-100,0.1％SDS,1mM PMSF,PhosSTOP cocktail andprotease inhibitors]裂解细胞30分钟，超声波破碎3次，每次10秒种，14000rpm离心10分钟后取上清，加入FLAG beads在4℃免疫沉淀3个小时，用裂解液小心地洗涤3次beads，沉淀蛋白，用胰酶酶解成肽段，用质谱仪分析磷酸化的肽段和位点，如图14所示，质谱结果显示第123位丝氨酸是SENP2的磷酸化位点。

实施例11乳腺癌病人的血清中检测FGF21浓度

收集luminal型和HER2型乳腺癌病人的血清样品，依据临床诊断，将这些病人分为两组：未发生转移(非转移性)和已经发生转移(转移性)的，用商品化的人源FGF21 ELISA试剂盒(Abcam，ab125966)检测血清中FGF21的浓度，如图18所示，在luminal型和HER2型乳腺癌患者中，非转移性的乳腺癌患者血清中FGF21的平均浓度要低于转移性的乳腺癌患者，并且当血清中FGF21浓度小于50pg/ml时，40％左右的乳腺癌患者发生了肿瘤转移，而当血清中FGF21大于50pg/ml时，接近80％的乳腺癌患者都发生了肿瘤转移，说明FGF21浓度升高到50pg/ml以上时，患者发生转移的概率显著提高。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。