阅读说明：本技术 红花黄色素在制备II型5α-还原酶抑制剂中的应用 (Application of safflower yellow in preparation of II-type 5 alpha-reductase inhibitor ) 是由 沈志滨 胡锡昌 张衍湖 ***榕 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了红花黄色素在制备II型5α-还原酶抑制剂中的应用,同时,红花黄色素还能够应用于制备治疗雄激素依赖型疾病的药物,所述雄激素依赖型疾病包括前列腺增生、多毛症、雄激素源性脱发和痤疮。红花黄色素具有较强的II型5α-还原酶抑制活性,其体外最低有效抑制浓度可达69μM；在多种中药活性成分中,红花黄色素具有较好的与II型5α-还原酶蛋白对接的效果,且其效果高于目前常用的II型5α-还原酶抑制剂——非那雄胺,说明其与II型5α-还原酶的结合能力强,具有较好的II型5α-还原酶抑制活性。(The invention discloses application of safflower yellow in preparing a II-type 5 alpha-reductase inhibitor, and meanwhile, the safflower yellow can also be applied to preparing a medicament for treating androgen-dependent diseases, wherein the androgen-dependent diseases comprise prostatic hyperplasia, hirsutism, androgen-induced alopecia and acne. The safflower yellow has stronger II-type 5 alpha-reductase inhibition activity, and the minimum effective inhibition concentration in vitro can reach 69 mu M; among a plurality of traditional Chinese medicine active ingredients, the safflower yellow has better docking effect with II type 5 alpha-reductase protein, and the effect is higher than that of the currently common II type 5 alpha-reductase inhibitor, namely finasteride, which shows that the safflower yellow has strong binding capacity with II type 5 alpha-reductase and better II type 5 alpha-reductase inhibition activity.)

红花黄色素在制备II型5α-还原酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及红花黄色素在制备II型5α-还原酶抑制剂中的应用。

背景技术

红花(Carthamus tinctorius L.)，别名：红蓝花、刺红花，属于菊科、红花属植物。红花具有活血通经、散瘀止痛等疗效，有助于治疗经闭、痛经、恶露不行、胸痹心痛、瘀滞腹痛、胸胁刺痛、跌打损伤、疮疡肿痛等疾病。

红花是一种安全性高、具有多种活性潜力的中草药。红花中含有多种活性化学成分，包括黄酮类、木脂素类、生物碱类和亚油酸类等。红花黄色素是中药红花中的黄酮类化合物，具有抗凝血、抗血栓、抗氧化、免疫调节及抗肿瘤等作用(刘世军,唐志书,崔春利,等.中药红花化学成分的研究进展[J].河南中医,2017(1))。红花黄色素的化学结构式如下所示：

5α-还原酶(5α-reductase，5αR)是一种位于微粒体上，依赖还原性辅酶II催化还原类固醇激素的膜蛋白酶，包括I型(5αR1)和II型(5αR2)两种同工酶。其中，5αR1主要分布在人体中雄激素非依赖性器官，例如肝脏和脑中；5αR2则大量存在于毛囊毛根鞘、***、附睾等雄激素依赖性器官中(Inui S,Itami S.Androgen actions on the human hairfollicle:perspectives[J].Experimental Dermatology,2013,22(3):168-171)。在人体内，5α-还原酶是催化睾酮(testosterone，T)为活性更强的二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)的关键酶，高水平DHT易引起雄激素依赖型疾病(潘继升,王永晨,蔡丽敏.5α-还原酶在相关疾病中的作用[J].医学综述,2011,17(17):2571-2573)，例如***增生、多毛症、雄激素源性脱发、痤疮等。通过抑制5α-还原酶来降低雄激素水平已成为治疗良性***增生、雄激素性脱发等雄激素依赖型疾病的重要方法(刘本,常忆凌,陈科力.5α还原酶作为天然药物筛选靶的研究进展[J].药物生物术,2006(06):468-470)。

目前，临床上常用的5α-还原酶抑制剂主要为如非那雄胺、度他雄胺等甾体类药物，但此类药物均存在较强的不良反应，如***功能障碍、性功能异常、***降低、男性***女性化等(Banday AH,Shameem S A,Jeelani S.Steroidal pyrazolines and pyrazolesas potential5α-reductase inhibitors:Synthesis and biological evaluation[J].Steroids,2014,92:13-19)，因此，从中草药中寻找高活性且副作用少的新型抑制剂尤为必要。目前还未见报道红花黄色素对II型5α-还原酶的抑制作用。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明红花黄色素在制备II型5α-还原酶抑制剂中的应用，研究显示红花黄色素具有良好的II型5α-还原酶的抑制作用。

在本发明的第一方面，提供了红花黄色素在制备II型5α-还原酶抑制剂中的应用。

根据本发明的一些实施例，红花黄色素在体外能够抑制II型5α-还原酶的生物活性。

在本发明的第二方面，提供了红花黄色素在制备治疗雄激素依赖型疾病的产品中的应用。

根据发明的一些实施例，所述雄激素依赖型疾病包括***增生、多毛症、雄激素源性脱发和痤疮中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述产品的剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。

在本发明的第三方面，提供了红花黄色素在制备防脱固发产品中的应用。

II型5α-还原酶抑制剂常用于***增生、多毛症、雄激素源性脱发和痤疮等雄激素依赖型疾病的治疗。其中，雄激素源性脱发(又称为脂溢性脱发)是一种雄性激素分泌导致的脱发，是由于毛囊中有大量的5α-还原酶，会将男性荷尔蒙转换而生成大量代谢物双氢睾酮，毛囊就开始萎缩退化而开始掉发。目前，雄激素源性脱发的治疗方式和治疗效果有限，无法满足人群对脱发治疗的需求；本发明由于发现红花黄色素具有较好的II型5α-还原酶抑制，因此将红花黄色素作为雄激素源性脱发治疗的活性成分，制备出一种含有红花黄色素的防脱固发产品，能够广泛应用于雄激素源性脱发的预防和治疗，具有较好的防脱固发效果。

在本发明的第四方面，提供了一种II型5α-还原酶抑制剂，其活性成分包含红花黄色素。

在本发明的第五方面，提供了一种治疗雄激素依赖型疾病的药物，其活性成分包含红花黄色素。

根据本发明的一些实施例，证明红花黄色素具有较强的II型5α-还原酶抑制活性，在相关雄激素依赖型疾病的治疗中具有应用前景；根据本发明实施例中的安全性数据，证明红花黄色素的安全性高、毒性低，符合制备相关药物的要求。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗雄激素依赖型疾病的药物组合物，其活性成分包含红花黄色素。

在本发明的第七方面，提供了一种防脱固发产品，其活性成分包含红花黄色素。

根据本发明的一些实施例，所述红花黄色素的以重量份计的含量为0.01％～0.5％。

本发明中，所述产品包括药物或化妆品。

本发明中，所用术语“治疗”，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制并发症的产生：改善或预防潜在代谢综合征；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退；减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防或治疗由疾病或症状引起的征兆。如本文所用，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药，可以归因于给药有关的情况。

本发明的有益效果在于：

1、红花黄色素具有较强的II型5α-还原酶抑制活性，其体外最低有效抑制浓度可达69μM；在多种中药活性成分中，红花黄色素具有较好的与II型5α-还原酶蛋白对接的效果，且其效果高于目前常用的II型5α-还原酶抑制剂——非那雄胺，说明其与II型5α-还原酶的结合能力强，具有较好的II型5α-还原酶抑制活性；

2、红花黄色素是来源于天然植物红花中的活性成分，其安全性高、毒性低且副作用少；

3、本发明制备得到的含有红花黄色素的产品在治疗雄激素引起的脱发上有很好的防脱固发的作用效果。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例1中的最优模型拉式图；

图2为本发明实施例1中的3D模型结构图；

图3为本发明实施例1中的红花黄色素与II型5α-还原酶结合模式图；

图4为本发明实施例2中的II型5α-还原酶的氨基酸骨架原子随时间变化的RMSD值；

图5为本发明实施例2中的配体-蛋白复合物氨基酸骨架原子的RMSF值波动图；

图6为本发明实施例5中红花黄色素及相关产品的鸡胚绒毛***(CAM)的血管反应性实验结果示意图；

图7为本发明实施例5中红花黄色素的斑贴试验结果图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

材料与仪器：LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；色谱柱(COSMOSIL 5C18-MS-II柱(250mm*2.6，5μm))；TGL-16型高速低温离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；SB-1200型恒温水浴锅(上海爱朗仪仪器有限公司)。

红花黄色素(CAS：36383-96-2，98％，成都埃法生物科技有限公司，批号AF8030707)；还原性辅酶II(NADPH，>98％，上海麦克林生化科技有限公司，批号C10526802)；二硫苏糖醇(DTT，>98％，上海麦克林生化科技有限公司，批号C10182317)；苯甲基磺酰氟(PMSF，>98％，上海麦克林生化科技有限公司，批号C10090911)；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯，水为去离子水。

SD大鼠，9周龄，体重260-280g，SPF级，10只，雄性，由广东省动物中心提供[合格证号：SCXK(粤)2018-0002]，SPF级[广东药科大学动物实验中心，合格证号：SYXK(粤)2017-0125]。

统计数据分析：本实施例中所得数据采用SPASS 23.0软件进行分析。各组数据均以`x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐性采用LSD法进行检验，方差不齐时采用Dunnett T3法检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

实施例1：基于分子对接技术筛选中药来源的的II型5α-还原酶抑制剂

分子对接技术(molecular docking method)是一种虚拟高通量筛选手段，主要研究配体与受体分子间的相互作用，并对配体受体的结合模式、结合强度及结合效应进行预测。在药物的前期设计中常使用分子对接技术进行大规模药物的活性筛选以降低研究的盲目性，节省大量工作时间，已经成为计算机辅助药物设计发展中一项重要技术，本研究即采用此技术对中药化学成分进行抑制II型5α-还原酶的活性进行筛选，对于活性较好的化合物再进行分子动力学模拟(Molecular dynamics Simulation，MD)技术进行活性评价，最后采用体外酶活性测定体系进行实验验证。

1.小分子数据库的建立

实验室在前期工作中对20种中药进行了II型5α-还原酶抑制活性筛选研究，结果显示白鲜皮、木香、麦冬、红花、苦参、透骨草、人参具有一定的的抑制活性，本实验在此基础上，选取中药提取物中主要活性成分，通过ChemBioDraw14.0画出其2D结构图，构建二维数据库，采用LigPrep模块进行配体准备，pH值设置为7.0±2，互变异构体状态由Epik程序确定，其余参数均为默认设置，使用Macromodel程序在OPLS2005力场下对分子进行优化。

选取的中药中的活性成分(单体化合物)包括：红花黄色素、羟基红花黄色素、杨梅素、人参皂苷、木犀草素、香叶木素、苦参碱、木香烃内酯、山奈酚、槲皮素、甲基麦冬黄烷酮、汉黄岑素、梣酮、阿魏酸、麦冬高异黄酮、孕烯醇酮、白桦酯醇和亚油酸。

2.II型5α-还原酶结构的同源建模

1)同源建模方法：由于II型5α-还原酶蛋白晶体结构未知，依据参考文献(王寅磊,卢轩,曹洪玉,等.荨麻属化合物抗良性***增生活性受体分子对接及其药代动力学性质研究[J].中国临床药理学杂志,2019(18))通过同源建模方法获取受体蛋白3D晶体结构。运用BLAST工具在Protein Data Bank(PDB)数据库中进行序列相似性搜寻，根据II型5α-还原酶氨基酸序列，选用序列同源性最高的蛋白作为模版使用MODELLER 9.23软件进行同源建模，蛋白的优化由Schrodinger软件中Protein preparation Wizard程序在OPLS-2005力场下完成。

2)同源建模结果：以3CMF蛋白为模版在MODELLER产生的五个同源模型(GA341score：0.122794；GA341score：0.257079；GA341score：0.113738；GA341score：0.125828；GA341score：0.110722)，选择GA341score最高的模型进行优化，RamachandranPlot如图1所示，该模型96.7％的残基处于合理范围内，说明所构建的蛋白结构可靠合理，经优化后的模型如图2所示，用于分子对接。

3.分子对接

1)实验方法：对接程序根据Schrodinger Glide 2015-2中Maestro 10.2执行。使用Receptor Grid Generation程序确定对接区域，以默认框大小设置Grid，对具有部分原子电荷小于或等于0.25的蛋白质原子的范德华半径进行1.0的缩放，Grid文件设置完成后采用Glide XP(高精度模式的Glide算法)对接方案，将配体(中药中单体化合物)依次对接到受体蛋白活性口袋中，对接过程中，II型5α-还原酶蛋白构象固定，配体构象灵活可变。

打分函数G-score＝0.065×vdW+0.130×Coul+Lipo+Hbond+Metal+BuryP+RotB+Site

式中G-score：Glide评分(综合)；vdW：分子间作用能评分；Coul：库伦作用能评分；Lipo：亲脂性评分；Hbond：氢键评分；Metal：金属配位键评分；BuryP：隐藏极性基团罚分；RotB：旋转键能罚分；Site：蛋白质活性位点极性相互作用评分。

2)分子对接打分结果：

将上述选取的中药中单体化合物和非那雄胺(阳性对照)与II型5α-还原酶蛋白进行对接，打分结果见表1。在Glide对接中，打分G-score均为负值，其绝对值的大小说明配体与受体结合的作用力，绝对值越大，结合能力越强，对接效果越好。非那雄胺的打分结果为-6.112kcal/mol，在选取的中药单体化合物中，红花黄色素G-score高于非那雄胺，说明红花黄色素与II型5α-还原酶结合能力强，具有潜在的II型5α-还原酶抑制活性。

表1化合物与II型5α-还原酶蛋白对接打分结果

3)分子对接模式分析：根据对接打分结果，做出红花黄色素与蛋白的结合模式图，可直观观察活性化合物与靶点的结合模式以及与周围氨基酸残基的相互作用，结果见图3。

红花黄色素与受体蛋白对接时占据了由残基Arg233、Ala117、Leu226、Ile112、Thr120、Asn122、Pro108、Glu57、Trp201、Phe61、Agr227、Pro106、Asn160、Glu197、Asn193、Phe194、Asn102、Arg105、Thr95、Phe92等形成的活性口袋，化合物与受体蛋白对接作用分析见表2。

表2化合物与II型5α-还原酶蛋白对接作用分析

红花黄色素与蛋白的结合模式为与5个氨基酸以氢键作用结合，通过分子中的-OH与氨基酸Glu197、Asn122中的O形成氢键作用，除此之外红花黄色素可以与Glu57、Tyr91、Arg227通过分子中的H或O与氨基酸中的O或H形成氢键；而在疏水作用中，红花黄色素分别与Phe92、Phe61、Ile112、Leu226、Phe219、Phe118通过疏水作用相结合。在与蛋白质结合过程中，红花黄色素主要通过形成较多的氢键作用和疏水作用与之相结合，因此，与蛋白结合作用较强，其可能的5α-还原酶抑制活性较强。

实施例2：红花黄色素的II型5α-还原酶抑制作用分子动力学研究

1.分子动力学模拟

1)实验方法：使用GROMACS 5.1.1进行分子动力学模拟(Davood A,HarcheganiAB,Khamesipour A,et al.Molecular Dynamics Simulation and Docking Studies ofSelenocyanate Derivatives as Anti-Leishmanial Agents[J].CombinatorialChemistry&High Throughput Screening,2016,19(10))。化合物拓扑文件由Acpype(http://bio2byte.be/acpype/)产生。II型5α-还原酶蛋白的拓扑由PDB2GMX工具获得，水模型为SPC/E溶剂模型，钠离子中和系统电荷，使系统呈电中性。采用周期性边界的方式进行模拟，首先在300K的温度下对蛋白和小分子配体复合物进行1000步的能量最小化，接着对优化后的体系分别进行100ps的NVT系综平衡和100ps的NPT系综平衡，在此过程中对于体系位置进行限制，最后整个系统温度保持在300K进行50ns的动力学模拟，时间间隔为2fs，每隔10ps保存一次坐标轨迹文件。从30ns-50ns稳定的动力学轨迹中提取150帧动力学轨迹文件，使用MM/PBSA方法计算体系稳定后的结合自由能。

2)分子动力学模拟结果：本研究选取红花黄色素进行50ns的分子动力学模拟，通过计算模拟轨迹50ns时间内的均方根偏差值(RMSD)检验体系稳定性。结果如图4所示，红花黄色素体系在20ns之后，其RMSD值均基本不变，基本达到了平衡状态；所有体系的RMSD波动值都稳定在0.2nm以下，模拟的分析动力学模拟体系均达平衡。

本研究通过计算红花黄色素与受体蛋白复合物氨基酸骨架原子在动力学模拟过程中的均方根波动值(RMSF)，分析II型5α-还原酶与三种化合物中骨架氨基酸在模拟过程中的波动性。结果见图5：红花黄色素-II型5α-还原酶体系在氨基酸40-57,80-95,100-125，140-195出现了较低的波动性(RMSF<0.2nm)，该体系中RMSF波动较小的氨基酸与关键氨基酸相吻合，这可能与化合物和II型5α-还原酶之间产生了较为稳定的氢键、疏水作用或π-π堆积作用有关，将化合物与结合口袋周围的氨基酸相互连接在一起，形成了较为稳定的复合物。红花黄色素与II型5α-还原酶结合后使关键氨基酸更加稳定，有利于配体和受体的相互作用。

2.结合亲和力分析

进一步研究红花黄色素与II型5α-还原酶受体之间的结合亲和力差异，采用MM/PBSA方法计算红花黄色素与II型5α-还原酶受体复合物的结合自由能，分析了红花黄色素与II型5α-还原酶受体结合的作用。结果如表3所示：

表3红花黄色素与II型5α-还原酶蛋白的结合自由能

由表4结果分析可知，范德华力和静电势能最有利于红花黄色素与II型5α-还原酶受体结合，表面溶剂化作用也有利于结合，但与范德华力和静电势能的数值相比作用较弱，而极性溶剂化作用不利于体系结合。红花黄色素在与蛋白质结合过程中由于溶剂中的极性相互作用很大程度上抵消了静电势能，所以体系的非极性相互作用更有利于配体和受体的结合，其中范德华力起主导作用，影响化合物与II型5α-还原酶蛋白结合自由能。结合自由能数值越小，表示结合所需能量越低，越有利于配体与蛋白的结合。

实施例3：红花黄色素的5α-还原酶抑制活性验证

1.红花黄色素的II型5α-还原酶抑制活性测试

1)实验步骤：参照参考文献方法(Bei Zhang，Rong-weng Zhang，Xi-quan,etal.Inhibitory activities of some traditional Chinese herbs againsttestosterone 5α-reductase and effects of Cacumen platycladi on hair re-growthin testosterone-treated mice[J].Journal of Ethnopharmacology,2016,177)，选取红花黄色素进行生物活性验证。实验步骤为：取雄性SD大鼠10只，禁食不禁水12h后脱颈处死，取出腹侧***及附睾称重并在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.5)，1mmol/L DTT，1mmol/L PMSF)在玻璃匀浆器中制成1:5匀浆液(g/mL)，离心后合并上清液得II型5α-还原酶粗酶。以睾酮为底物，加入II型5α-还原酶粗酶和还原型辅酶II(NADPH)组成酶反应体系，体系组成见表4：

表4II型5α-还原酶的抑制活性研究反应体系

表中，“–”表示该项未添加。

37℃孵育1h后加入2.5mL二氯甲烷后终止反应，混匀，离心15min(5000r/min)，取有机层旋干后，加入甲醇溶解定容至1mL，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测睾酮消耗量。II型5α-还原酶活性以60min内每mg酶液转化睾酮的量[μmol/L(mg protein·60min)]表示；II型5α-还原酶的抑制率计算公式：抑制率＝(空白对照组睾酮浓度的变化值-受试药物组睾酮浓度的变化值)/空白对照组睾酮浓度的变化值×100％。实验重复三次，采用SPASS 23.0软件对浓度的对数和抑制率的关系进行线性分析。

色谱条件：色谱柱(COSMOSIL 5C18-MS-II柱(4.6×250mm，5μm))；柱温为30℃；流动相为甲醇-水(70/30，v/v)；流速1mL/min；进样量为20μL；检测器为紫外检测器，检测波长242nm。

2)实验结果:

红花黄色素进行生物活性验证，结果见表5：

表5红花黄色素对II型5α-还原酶的抑制作用(

n＝3)

与空白组相比较**P＜0.01；***P＜0.001。

随着浓度的提高，红花黄色素对II型5α-还原酶活性的抑制率随之提高，说明红花黄色素对酶的抑制活性在一定浓度范围内呈现明显的量效关系。通过对比IC₅₀值可知抑制活性与分子对接和分子动力学模拟得出结论相吻合，说明通过分子对接及分子动力学模拟能够快速筛选出具有潜在抑制II型5α-还原酶活性的单体成分，且在生物活性验证实验中均呈现一定程度的抑制活性。

红花黄色素主要通过分子中的-OH和-O-与II型5α-还原酶中的氨基酸形成氢键和疏水作用，产生较强的结合作用；分子动力学模拟结果表明红花黄色素与II型5α-还原酶均能较稳定的结合，体系结合强弱与分子对接结果一致；在体外实验中红花黄色素呈现出较强的对II型5α-还原酶的抑制活性。

2.红花提取物II型5α-还原酶活性的对照实验

1)实验步骤：

红花提取物的制备：称取中药干燥粉末20g，置于圆底烧瓶中，采用水煎煮法加入去离子水提取2次，料液比分别为1:10、1:8；提取时间分别为2h、1.5h；合并两次滤液，浓缩后，冷冻干燥制成冻干粉，得到中药水提物，4℃冷藏备用。

将上述红花提取物根据预实验结果选取1mg/mL作为测定样品浓度，进行II型5α-还原酶抑制活性测试，测试方法同上，得到红花提取物对II型5α-还原酶的抑制活性结果，如下表6所示：

表6红花提取物对II型5α-还原酶的抑制作用(

n＝3)

注：与空白对照组相比较*P<0.05，**P<0.01。

从上述红花提取物的对照结果可知，红花黄色素IC₅₀为69.06±6.35μmol/L，红花提取物在1mg/mL浓度下才有65％左右的抑制率。因此，使用红花黄色素的II型5α-还原酶抑制效率远高于红花提取物，证明红花黄色素是红花中对II型5α-还原酶起抑制作用的重要活性成分。

实施例4：红花黄色素在制备相关产品中的应用

一种含红花黄色素的防脱固发产品，组分配方如下表7所示：

表7含红花黄色素的防脱固发产品配方

按上述配方制备得到一种防脱固发的护发精油产品，上述配方仅为实验使用的准确配方组成，红花黄色素作为主要的防脱固发活性成分在化妆品中的质量占比可为0.01％～0.5％，均具有较好的效果；配方中的其他组分是化妆品组分中常用添加的成分及辅料，可使用具有相近功能的辅料进行常规组合或替换。

人体使用实验：将上述制备得到的防脱固发产品分发至20名志愿者进行产品使用效果实验，得到产品使用效果的频数分析结果如表8，对产品的防脱、控油等效果进行分析：

表8产品使用效果的频数分析结果

根据上表结果可以看出，本实施例中制备得到的产品改善脱发的效果高达85％，在大部分在使用15天内即可起效，且该产品在使用过程中均不会产生过敏，亦无过敏反应；因此说明该产品具有较好的防脱固发效果和较高的安全性。

实施例5：红花黄色素及其相关产品的安全性试验

试验药品：红花黄色素(CAS：36383-96-2，98％，成都埃法生物科技有限公司)，实施例4中制备的防脱固发产品；下述实验中红花黄色素配制成0.4mg/ml的溶液。

1.鸡胚绒毛***实验

绒毛膜***(chorioallantoic membrane，CAM)试验是眼刺激性试验替代方法中广泛使用的模型之一。鸡胚绒毛膜***是鸡胚的一种体外循环系统，具有丰富血管的完整组织，利用CAM与结膜结构相似的特性，通过观察CAM暴露于化学物质后血管的变化(充血、出血、凝血)，检测化学物质对CAM的损伤，可以评价化学物可能的刺激性。

1)品系和来源：

白莱杭鸡(White Leghorn chicken)受精鸡胚，应选用SPF鸡胚，供应商应具有农业部门认可的《兽药生产、检验用SPF鸡(蛋)定点生产企业》资格，鸡胚质量应符合国家标准的要求。

鸡胚应新鲜、干净、完好，重量50g～60g。孵化至9d龄时，应进行照蛋检查，未受精、无活性或者有缺失的鸡胚应弃去，严重畸形、破壳或者薄壳鸡胚也不能使用。

孵化条件：室温20℃～25℃，相对湿度45％～70％。孵化温度37.5℃±0.5℃，相对湿度55％～70％，转盘频率3次/h～6次/h。9d龄的鸡胚孵化时不必旋转。

2)鸡胚***(HET-CAM)试验步骤：

9d龄鸡胚进行照蛋检查，在蛋壳表面标记气室位置；用牙科锯齿弯镊刀剥去蛋壳部分，完整暴露白色蛋膜，用吸管滴加1～2mL的0.9％NaCl溶液使蛋膜湿润，小心用弯镊去除内膜，暴露出绒毛***(CAM)，避免血管膜受损，如有破损则不用于实验。

根据SNT 2329-2009商检标准，采用终点评价法检测灵芝肽多糖的眼刺激性，选用生理盐水(0.9％NaCl，NS)为阴性对照，1％脂肪醇醚硫酸钠盐混合物(Texapon ASV)溶液为阳性对照。取0.3mL受试样品直接作用于CAM，确保至少50％的CAM表面被受试样品覆盖，作用5min后用生理盐水轻轻冲洗CAM，冲洗后30s后观察CAM的出血、血管溶解和凝血反应，并分别按轻、中、重度记1分、2分和3分，每个鸡胚的最高积分为9分。每个受试样品均用6个鸡胚进行试验，计算6个鸡胚的刺激反应评分(endpoint score，ES)总和，按表9所示的分级标准，对受试样品的眼刺激性进行分级评价。

表9终点评价法受试样品眼刺激性分级标准

3)实验结果：

实验结果如下表10所示：

表10 HET-CAM试验的眼刺激性评价结果

实验结果表明：0.9％NaCl溶液在接触CAM后5分钟内均未见出血、血管溶解或凝血反应，血液流通清晰可见，如图6A所示。1％Texpon ASV溶液接触CAM后出现出血，血管融解，反应积分在18分以上，如图6B所示。红花黄色素组、防脱固发产品组接触CAM后未出现任何血管刺激反应，如图6C、图6D所示，刺激积分均为0分，刺激性分级结果见表9所示。红花黄色素组、防脱固发产品组作用于鸡胚绒毛***未见毒性效应，说明红花黄色素、防脱固发产品组无刺激性，可应用于药物或化妆品中作为预防和治疗脱发的功能性外用成分使用。

2.斑贴试验

本实验仅测试黄花红色素的致敏性，实验浓度为0.4mg/ml。

斑贴试验(Patch Test)是确定化妆品致敏原一个简单、可靠的方法。斑贴试验是人为地将可疑的致敏原配置成一定浓度，放置在一特制的小室内敷贴于人体遮盖部位(常在后背、前臂屈侧)，经过一定时间，根据有否阳性反应来确定受试物是否系致敏原(即致敏物质)。

1)试验部位：上背部脊柱两侧的正常皮肤。

2)去除斑试器的保护纸、将准备好的变应原按顺序置于铝制斑试器内。斑试物排练顺序为自上至下，自左至右并做标记。斑试剂用量，软膏制剂用25μl，直接放入斑试器中，液体制剂用25μl滴在放入斑试器中的滤纸片上。注意加斑试物时尽量不要沾到斑试器边缘。

3)将加有斑试物的斑试器胶带自下向上贴牢、贴平并用手掌轻轻压几下，以便排出空气。

4)斑贴试验时间：48小时。

5)观察结果时间：贴敷后48小时，首先去除斑试器，为避免斑试器压迫皮肤所可能造成的反应，应在去除斑试器至少，30分钟后观察结果。

图7为本斑贴试验的试验结果，左侧为实验开始、右侧为实验结束的照片图；结果表明，红花黄色素没有表现出刺激性和***反应的特征性表现，可判定为该样品安全无刺激。

本实施例的试验结果证明黄花红色素以及实施例4制备的防脱固发产品具有刺激性小和过敏反应低等优点，因此，均具有较高的安全性。

综上所述，红花黄色素具有潜在抑制II型5α-还原酶活性，可以用于制备II型5α-还原酶抑制剂，制备抑制II型5α-还原酶的药物或化妆品，用于治疗和预防雄激素依赖型疾病，其作用效果好，且安全性高、副作用小，尤其是在治疗雄激素引起的脱发上有很好的作用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。