阅读说明：本技术 一种天然免疫活化剂、til细胞促进剂及其应用 (Natural immune activator, TIL cell promoter and application thereof ) 是由 李慧灵 陈桂 周金林 张利民 卢宇靖 林丽薇 林育成 叶德晓 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种天然免疫活化剂和一种天然TIL细胞促进剂,均包括淫羊藿次苷I；其中天然免疫活化剂可以提高外周血中多种免疫细胞亚群比例,同时提高外周血中CD8<Sup>+</Sup>/CD4<Sup>+</Sup>比值,激活免疫系统；天然TIL细胞促进剂可促进外周血免疫细胞向肿瘤组织浸润,提高肿瘤中TIL细胞的比例,特别是增强CD8<Sup>+</Sup>细胞在肿瘤组织的浸润,提高CD8<Sup>+</Sup>/CD4<Sup>+</Sup>比值,增加T细胞抑制肿瘤生长。本发明还公开了上述天然免疫活化剂和天然TIL细胞促进剂在肿瘤免疫治疗中的应用,可以提高肿瘤患者体内免疫细胞的含量,解决目前肿瘤免疫治疗中,肿瘤微环境中CD8<Sup>+</Sup>细胞浸润和/或积累不足的难题,提高肿瘤免疫治疗疗效。(The invention discloses a natural immune activator and a natural TIL cell promoter, both of which comprise icariside I; the natural immune activator can increase the ratio of multiple immune cell subsets in peripheral blood, and increase CD8 in peripheral blood + /CD4 + Ratio, activating the immune system; the natural TIL cell promoter can promote infiltration of peripheral blood immunocyte to tumor tissue, increase TIL cell proportion in tumor, especially enhance CD8 + Infiltration of cells in tumor tissue increases CD8 + /CD4 + In ratio, increasing T cells inhibited tumor growth. The invention also discloses the application of the natural immune activator and the natural TIL cell promoter in tumor immunotherapy, which can improve the content of immune cells in the body of a tumor patient and solve the problem that tumor micro-rings exist in the current tumor immunotherapyEnvironmental CD8 + The difficulty of insufficient cell infiltration and/or accumulation, and the curative effect of tumor immunotherapy is improved.)

一种天然免疫活化剂、TIL细胞促进剂及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种天然免疫活化剂、TIL促进剂及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是人类的主要死因之一，世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告2014》预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人；2015年全球有880万人死于癌症，占全球死亡病例的六分之一。目前的癌症治疗方法极大程度的依赖于具有细胞毒性的化学药物疗法和放射疗法，这些疗法对正常细胞有毒副作用，并且容易产生肿瘤细胞的耐药性，增加肿瘤治疗的难度，这严重限制了化学药物疗法和放射疗法的应用。

目前，肿瘤免疫疗法为***打开了一片新天地。肿瘤免疫疗法是通过提升机体的主动或被动免疫力，依靠机体自身免疫系统来监督和杀伤肿瘤细胞的。最常见的为细胞免疫治疗即将患者体内受抑制的免疫细胞(主要是淋巴细胞和抗原提呈细胞)取出，经过体外复制、激活过程，使它们的数量和活性得到大幅度提高，然后再回输到患者体内，从而发挥抗病毒、抗肿瘤的效应。但是，目前的免疫治疗技术存在诱导肿瘤微环境中CD8⁺细胞浸润能力不足的难题，即在患者体内得不到一定数量靶向性强的免疫细胞，如肿瘤微环境中CD8⁺，如果从患者体内提取数量较低的免疫细胞进行体外培养，无疑增加了细胞免疫治疗时间，严重影响抗肿瘤免疫治疗的疗效。

淫羊藿次苷I(Icariside I)，是中药材淫羊藿中的一种微量黄酮苷类化合物，目前有关淫羊藿次苷I的药理活性研究报道较少，在已有报道中，淫羊藿类药物能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效。近年来淫羊藿提取物被报道具有调节机体免疫系统的功能和具有抗肿瘤活性，但是对于淫羊藿次苷I应用研究仍不多。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种天然免疫活化剂，包括淫羊藿次苷I，可以提高外周血中多种免疫细胞亚群比例，同时提高外周血中CD8⁺/CD4⁺比值，激活免疫系统；

本发明的目的之二在于提供一种上述天然免疫活化剂在肿瘤免疫治疗中的应用，提高肿瘤患者体内免疫细胞的含量，提高肿瘤免疫治疗疗效；

本发明的目的之三在于提供一种天然TIL细胞促进剂，包括淫羊藿次苷I，可促进外周血免疫细胞向肿瘤组织浸润，提高肿瘤中TIL细胞的比例，特别是增强CD8⁺细胞在肿瘤组织的浸润，提高CD8⁺/CD4⁺比值，增加T细胞抑制肿瘤生长；

本发明的目的之四在于提供一种上述天然TIL细胞促进剂在肿瘤免疫治疗中的应用，解决目前肿瘤免疫治疗中，肿瘤微环境中CD8⁺细胞浸润和/或积累不足的难题。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种天然免疫活化剂，包括淫羊藿次苷I。

进一步地，所述淫羊藿次苷I为天然淫羊藿提取物，所述淫羊藿次苷I的纯度大于90％。

进一步地，所述免疫活化剂用于提高外周血中免疫细胞亚群的比例。

所述免疫细胞亚群包括CD4⁺细胞、CD8⁺细胞、NK细胞。

进一步地，所述免疫活化剂用于提高外周血中的CD8⁺/CD4⁺比值。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种天然免疫活化剂在肿瘤免疫治疗中的应用，其中，所述淫羊藿次苷I的使用剂量为5-80mg/kg·bw。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

一种天然TIL细胞促进剂，包括淫羊藿次苷I。

进一步地，所述淫羊藿次苷I为天然淫羊藿提取物，所述淫羊藿次苷I的纯度大于90％。

所述TIL细胞促进剂用于促进外周血免疫细胞亚群向肿瘤组织浸润，提高肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞的比例。

优选地，所述TIL细胞促进剂用于增强CD8⁺细胞在肿瘤组织的浸润，提高肿瘤组织中CD8⁺/CD4⁺比值。

本发明的目的之四采用如下技术方案实现：

一种天然TIL细胞促进剂在肿瘤免疫治疗中的应用，其中，所述淫羊藿次苷I的使用剂量为5-80mg/kg·bw。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明天然免疫活化剂和肿瘤浸润淋巴细胞促进剂的有效成分为天然的药物淫羊藿次苷I，是淫羊藿中的稀有成分，不仅可以激活人体免疫系统，提高人体外周血中CD4⁺细胞、CD8⁺细胞及NK细胞的比例，同时还能提高外周血中CD8⁺/CD4⁺比值。更重要的是，淫羊藿次苷I还可促进外周血中的免疫细胞向肿瘤组织浸润，提高肿瘤环境中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的比例，增强T细胞免疫功能，特别是增强肿瘤微环境中CD8⁺细胞的浸润或T细胞抗肿瘤功能。

2、本发明的天然免疫活化剂和肿瘤浸润淋巴细胞促进剂能够提高免疫力，同时能够增强T细胞免疫功能进而预防和/或***，可以用与目前的癌免疫疗法，有效解决目前肿瘤免疫治疗中，肿瘤微环境中CD8阳性杀伤性T细胞浸润和/或积累不足的难题，有效提高肿瘤免疫治疗疗效，为淫羊藿次苷I的用途开辟了一个新的方向。

附图说明

图1为实施例1淫羊藿次I的毒性评价试验结果分析图；

图2为实施例2A-E组小鼠外周血中CD4⁺细胞的数量分析图；

图3为实施例2A-E组小鼠外周血中CD8⁺细胞的数量分析图；

图4为实施例2A-E组小鼠外周血中NK细胞的数量分析图；

图5为实施例2A-E组小鼠外周血中NKT细胞的数量分析图；

图6为实施例2淫羊藿次I对小鼠外周血中CD4⁺细胞和CD8⁺细胞的影响图；

图7为实施例2B-E组小鼠肿瘤组织中TIL细胞的数量分析图；

图8为实施例2B-E组小鼠肿瘤组织中CD8⁺细胞的数量分析图；

图9为实施例2淫羊藿次I对小鼠肿瘤组织中CD4⁺细胞和CD8⁺细胞的影响图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

一种天然免疫活化剂，包括淫羊藿次苷I。用于提高外周血中免疫细胞亚群的比例，其中，免疫细胞亚群主要为CD4⁺细胞、CD8⁺细胞、NK细胞。

其中，淫羊藿次苷I为天然淫羊藿提取物，淫羊藿次苷I的纯度大于90％。

进一步地，上述免疫活化剂用于提高外周血中的CD8⁺/CD4⁺比值。

一种天然免疫活化剂在肿瘤免疫治疗中的应用，其中，淫羊藿次苷I的使用剂量为5-80mg/kg·bw。

一种天然TIL细胞促进剂，包括淫羊藿次苷I。用于促进外周血免疫细胞亚群向肿瘤组织浸润，提高肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞的比例。特别是增强CD8⁺细胞在肿瘤组织的浸润，提高CD8⁺/CD4⁺比值，增加T细胞抑制肿瘤生长。

其中，淫羊藿次苷I为天然淫羊藿提取物，淫羊藿次苷I的纯度大于90％。

一种天然TIL细胞促进剂在肿瘤免疫治疗中的应用，其中，所述淫羊藿次苷Ι的使用剂量为5-80mg/kg·bw。可以解决目前肿瘤免疫治疗中，肿瘤微环境中CD8⁺T细胞浸润和/或积累不足的难题。

在不损及其效果的范围内，根据特定的目的，本发明天然免疫活化剂和TIL细胞促进剂中可以添加矫味剂、赋形剂、增稠剂、甜味剂、植物提取物、维生素类等外源添加成分。本发明的天然免疫活化剂和TIL细胞促进剂的剂型可以是液体制剂、粉末制剂、颗粒制剂、胶囊制剂、混悬制剂、其他的任意一种剂型。本发明天然免疫活化剂和TIL细胞促进剂主要通过经口给药的方式服用，也可以加入体外免疫细胞培养液中作为促进剂使用，用于肿瘤免疫治疗方法中，能显著提高免疫治疗的疗效。本发明天然免疫活化剂和TIL细胞促进剂也可以用于日常的保健使用，用以提高人体免疫力，降低疾病的患病率，日常服用时剂量可以根据人身体状况、年龄等进行调整。

实施例1

淫羊藿次苷I的毒性评价试验

选取21只SPF级C57雌性小鼠，随机分成A、B、C、D、E、F、G组共7组，每组三只。采用灌胃方式进行给药，其中，A组为对照组(control)，采用0.2ml/kg·bw玉米油灌胃，B组到G组分别给5mg/kg·bw、20mg/kg·bw、80mg/kg·bw、160mg/kg·bw、320mg/kg·bw、640mg/kg·bw的淫羊藿次苷I，连续给药7天后，杀死小鼠，观察小鼠各脏器情况，并收取小鼠的脏器和血浆进行分析，结果如图1所示。

本实例中淫羊藿次苷I提取***羊藿，纯度大于90％。

从图1可以看出，与未灌胃淫羊藿次苷I的小鼠相比，淫羊藿次苷I在高剂量的给药情况下，小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺各脏器的重量无明显的差异，说明高剂量淫羊藿次苷I对宿主的各脏器影响较小，即说明淫羊藿次苷I对宿主的毒性较小。

实施例2

淫羊藿次苷I对肝癌小鼠体内免疫激活、TIL促进的影响试验

(1)造模：以小鼠肝癌HepG2细胞构造肝癌小鼠模型。

(2)分组：以未造模的正常小鼠为A组正常组，将步骤(1)造好的肝癌小鼠模型随机分为B、C、D、E组，共5组，每组三只小鼠。

(3)给药：采用灌胃方式给药，其中，A组和B组给予0.2ml/kg·bw玉米油；C组为低剂量组，给予5mg/kg·bw的淫羊藿次苷I；D组为中剂量组，给予20mg/kg·bw的淫羊藿次苷I；E组为高剂量组，给予80mg/kg·bw的淫羊藿次苷I，连续给药7天。

(4)观察与检测：给药期间，每日观察小鼠食欲、排便、尿液、活动等情况；给药7天后采用流式细胞仪的技术，对肝癌小鼠外周血免疫亚群细胞进行分析，检测CD4⁺细胞、CD8⁺细胞、NK细胞以及NKT细胞的数量，同时对癌组织中浸润淋巴细胞(TIL)的相对数量做分析，特别检测与抑制肿瘤相关的CD4⁺细胞、CD8⁺细胞的数量，结果如图2-9所示。

从图2-5可以看出，服用不同剂量的淫羊藿次苷I，对肝癌小鼠免疫细胞的影响不同，效果最好的是中剂量的淫羊藿次苷I，在中剂量下(D组)，小鼠外周血中CD4⁺、CD8⁺、NK、NKT细胞的数量和肝癌小鼠相比都具有显著的上调作用。从图6可以看出淫羊藿次苷I提高了外周血中CD8⁺/CD4⁺比值。因此可以得出，淫羊藿次苷I可以活化肝癌小鼠的免疫系统，增强肝癌小鼠的免疫力。

从图7-8可以看出中剂量(D组)的淫羊藿次苷I对肝癌组织中淋巴浸润细胞的影响作用最大，与未用淫羊藿次苷I干预的肝癌小鼠相比，中剂量(D组)的淫羊藿次苷I干预后的肝癌小鼠癌组织中TIL的比例明显提高，CD8⁺细胞有显著性的升高。从图9可以看出肝癌组织中CD8⁺/CD4⁺比值也明显升高。说明淫羊藿次苷I可促进外周血免疫细胞向肿瘤组织浸润，提高肿瘤组织中TIL的比例，特别是增强CD8⁺细胞在肿瘤组织的浸润，提高CD8⁺/CD4⁺比值，可以作为肿瘤浸润细胞促进剂使用。

本发明通过安全性实验证明淫羊藿次苷I对宿主的毒性影响很小，通过肝癌小鼠的体内实验，证明了淫羊藿次苷I对肝癌小鼠外周血中免疫细胞的影响，可以提高CD4⁺、CD8⁺、NK、NKT细胞数量，提高外周血中CD8⁺/CD4⁺比值，因此具有活化肝癌小鼠的免疫系统，增强肝癌小鼠的免疫力的作用；同时，淫羊藿次苷I对小鼠癌组织中TIL的比例有明显的上调作用，CD8⁺细胞也显著性的升高，同时提高了CD8⁺/CD4⁺比值。根据以上实施例证明，淫羊藿次苷I可以作为肿瘤免疫活化剂和肿瘤浸润细胞促进剂使用，与肿瘤免疫治疗法组合使用能够很好的起到***的作用。

上述实施方式仅为本发明专利的优选实施方式，不能以此来限定本发明专利保护的范围，本领域的技术人员在本发明专利的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明专利所要求保护的范围。