抗trem2抗体和相关方法
阅读说明：本技术 抗trem2抗体和相关方法 (anti-TREM 2 antibodies and related methods ) 是由 M·斯特雷利 V·斯里拉姆 A·帕尔 L·G·普雷斯塔 于 2018-12-11 设计创作，主要内容包括：本文提供了抗TREM2抗体以及制备和使用抗TREM2抗体的相关方法。还提供了用于使免疫应答增强和/或用于治疗个体的免疫相关疾患例如癌症,包括使用抗TREM2抗体或其抗原结合片段杀灭非刺激性骨髓细胞,使非刺激性骨髓细胞丧失能力或消减的方法和组合物。(Provided herein are anti-TREM 2 antibodies and related methods of making and using anti-TREM 2 antibodies. Also provided are methods and compositions for enhancing an immune response and/or for treating an immune related disorder, such as cancer, in an individual, comprising killing, incapacitating, or depleting non-stimulatory myeloid cells using an anti-TREM 2 antibody or antigen binding fragment thereof.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月12日提交的美国临时专利申请62/597,827和2018年3月26日提交的美国临时专利申请62/648,089的权益，所述美国临时专利申请中的每一者据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请含有已通过EFS网提交，并且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。所述ASCII拷贝于20XX年某月XX日创建，名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，并且大小是X,XXX,XXX字节。
背景技术
免疫性在阻止肿瘤外生长方面起作用。复杂微环境可在病变内产生，并且尽管存在对T细胞的募集，但经常不存在对发展中的团块的有效控制。了解肿瘤消除与肿瘤逃逸之间的平衡可依赖于对骨髓细胞在肿瘤微环境中所起的差异性作用的理解。
肿瘤微环境的骨髓性群体主要包括单核细胞和嗜中性白细胞(有时宽松地分组为骨髓源性抑制细胞)、巨噬细胞和树突细胞。尽管肿瘤内骨髓性群体作为一个整体已长期被视为是非刺激性的或抑制性的，但更新近地，已了解并非所有肿瘤浸润性骨髓细胞都等同。
在正常组织中，这些骨髓细胞中的许多为先天性免疫性与适应性免疫性两者发挥适当功能，并且特别是为伤口修复所必需。然而，在癌症的环境下，通常描述巨噬细胞处于显著过量以及这些和其他细胞类型的群体处于功能异常或偏移状态。当被视为由单一标志物诸如CD68或CD163定义的集合群体时，“巨噬细胞”浸润与跨越多个肿瘤类型的情况下在受试者中获得更糟糕结果相关联((de Visser,Cancer Immunol Immunother,2008；57:1531–9)；(Hanada等,Int J Urol 2000；7:263–9)；(Yao等Clin Cancer Res,520,2001；7:4021–6)；(Ruffell等,PNAS,523 2012；109:2796–801))。但来自肿瘤微环境的巨噬细胞的表型性和功能性子环境由于巨噬细胞和树突细胞的类似性而变复杂，并且在肿瘤生物学中是疑难的。形态学准则已经常被应用于所述问题；一种用以试图区分树突细胞与巨噬细胞的方法基于树突细胞更具刺突或树突形态，而巨噬细胞更具隐蔽或球状形态(Bell等,JExp Med 555,1999；190:1417–26)。其他小组正试图基于遗传和细胞表面标志物进行区分。
在肿瘤内在抗原递呈区室中存在多样性，并且T细胞可区分抗原递呈细胞(APC)的特征。因为T细胞是肿瘤免疫性的主要驱动者，所以了解它们的同源APC的确切特征将是重要的。在能够向T细胞递呈肿瘤源性抗原，以及由此维持T细胞处于活化状态的细胞之中，骨髓细胞是突出的。抗原递呈发生在肿瘤自身内，并且可能影响肿瘤细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能。由抗原递呈细胞(APC)达成的T细胞活化是抗原特异性免疫应答和肿瘤细胞杀灭中的重要组成部分。因为这些骨髓性群体代表主要T细胞相互作用配偶体和抗原递呈细胞以获得接着到来的肿瘤反应性细胞毒性T淋巴细胞，所以了解它们的差别可引导治疗途径。
相关专利申请包括：2015年9月28日提交的PCT/US2015/052682；以及2016年9月28日提交的PCT/US2016/054104；所述专利申请中的每一者出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物、文件和文章都以引用的方式整体并入本文。
发明内容
本文描述一种结合人TREM2(SEQ ID NO:15)，并且与37017抗体(SEQ ID NO:31和32)竞争结合小鼠TREM2(SEQ ID NO:17)的经分离抗体。
在一些实施方案中，抗体含有包含以SEQ ID NO:9阐述的序列的CDR-H1、包含以SEQ ID NO:10阐述的序列的CDR-H2、包含以SEQ ID NO:11阐述的序列的CDR-H3、包含以SEQID NO:12阐述的序列的CDR-L1、包含以SEQ ID NO:13阐述的序列的CDR-L2和包含以SEQ IDNO:14阐述的序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，抗体是无海藻糖基化抗体，并且包含以SEQ ID NO:1显示的VH序列；以SEQ ID NO:2显示的VL序列；和活性人IgG1 Fc区。
在一些实施方案中，抗体包含以SEQ ID NO:7显示的序列的所有3个重链CDR和以SEQ ID NO:8显示的序列的所有3个轻链CDR。
在一些实施方案中，抗体包含在以SEQ ID NO:7显示的序列的位置97处的A至T取代；以及在以SEQ ID NO:7显示的序列的位置98处的K至R取代。
在一些实施方案中，抗体包含以SEQ ID NO:1、3或5显示的VH序列。
在一些实施方案中，抗体包含以SEQ ID NO:1、3或5显示的VH序列和以SEQ ID NO:2、4或6显示的VL序列。
在一些实施方案中，抗体包含以SEQ ID NO:1显示的VH序列。
在一些实施方案中，抗体包含以SEQ ID NO:1显示的VH序列和以SEQ ID NO:2显示的VL序列。
在一些实施方案中，抗体是37012抗体。
在一些实施方案中，抗体包含以SEQ ID NO:25显示的重链序列和以SEQ ID NO:26显示的轻链序列。
在另一方面，本文描述一种结合人TREM2(SEQ ID NO:15)的经分离抗体，其中所述抗体与37017抗体(SEQ ID NO:31和32)竞争结合小鼠TREM2(SEQ ID NO:17)；并且包含活性人Fc区。
在一些实施方案中，抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，抗体以小于或等于约1、2、3、4或5x10-9的KD结合人TREM2，如通过表面等离子体共振(SPR)测定所测量。
在一些实施方案中，抗体能够对TREM2+骨髓细胞；任选地对非刺激性骨髓细胞进行特异性杀灭、消减，或使TREM2+骨髓细胞；任选地使非刺激性骨髓细胞丧失能力。
在一些实施方案中，抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，抗体具有抗体介导的细胞吞噬(ADCP)活性。在一些实施方案中，抗体具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
在一些实施方案中，抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体介导的细胞吞噬(ADCP)活性或补体依赖性细胞毒性(CDC)杀灭骨髓细胞，使骨髓细胞丧失能力或消减。
在一些实施方案中，抗体是以下中的至少一者：单克隆抗体、中和抗体、拮抗性抗体、激动抗体、多克隆抗体、IgG1抗体、IgG3抗体、无海藻糖基化抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体以及它们的抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体。
在一些实施方案中，抗体是无海藻糖基化抗体。
在一些实施方案中，抗体是其抗原结合片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、(scFv)2,、单链抗体分子、双可变结构域抗体、单可变结构域抗体、线性抗体或V结构域抗体。
在一些实施方案中，抗体包含骨架，任选地，其中所述骨架是Fc，任选地是人Fc。
在一些实施方案中，抗体包含选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的类别的重链恒定区。
在一些实施方案中，抗体包含IgG类别和选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的子类的重链恒定区。
在一些实施方案中，抗体包含IgG1的重链恒定区。
在一些实施方案中，Fc包含一个或多个修饰，其中所述一个或多个修饰导致相较于不具有所述一个或多个修饰的Fc，半衰期增加，ADCC活性增加，ADCP活性增加，或CDC活性增加。
在一些实施方案中，Fc结合选自由以下组成的组的Fcγ受体：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb。
在另一方面，本文描述一种用于治疗癌症的经分离抗体，其中所述癌症选自实体肿瘤和血液肿瘤。
在另一方面，本文描述一种与本文所述的抗体竞争结合人TREM2的经分离抗体。
在另一方面，本文描述一种结合由本文所述的抗体结合的人TREM2表位的经分离抗体。
在另一方面，本文描述编码本文所述的抗体、其VH、其VL、其轻链、其重链、或其抗原结合部分的一种经分离多核苷酸或一组经分离多核苷酸；任选地是cDNA。
在另一方面，本文描述包含如本文所述的一种多核苷酸或一组多核苷酸的一种载体或一组载体。
在另一方面，本文描述一种包含如本文所述的一种多核苷酸或一组多核苷酸或本文所述的一种载体或一组载体的宿主细胞。
在另一方面，本文描述一种产生抗体的方法，所述方法包括用本文所述的宿主细胞表达所述抗体，以及分离所表达抗体。
在另一方面，本文描述一种包含本文所述的抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在另一方面，本文描述一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗体或药物组合物。
在一些实施方案中，疾病或疾患是癌症。
在一些实施方案中，抗体结合TREM2+骨髓细胞上TREM2的细胞外结构域，任选地，其中所述骨髓细胞在肿瘤内。在一个实施方案中，抗体结合骨髓细胞上TREM2的细胞外结构域，其中所述骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-非刺激性骨髓细胞，其中所述抗体通过ADCC、CDC和/或ADCP杀灭所述非刺激性骨髓细胞，使所述非刺激性骨髓细胞丧失能力或消减，以达到水平小于在所述非刺激性骨髓细胞与所述抗体接触之前，存在于癌症中的非刺激性骨髓细胞的水平，其中所述非刺激性骨髓细胞存在于包含CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+刺激性骨髓细胞和所述非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中，并且其中杀灭所述非刺激性骨髓细胞，使所述非刺激性骨髓细胞丧失能力或消减可治疗所述癌症。
在一些实施方案中，抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体介导的细胞吞噬(ADCP)活性或补体依赖性细胞毒性(CDC)杀灭骨髓细胞，使骨髓细胞丧失能力或消减。在一些实施方案中，抗体具有受体-配体阻断活性、激动活性或拮抗活性。
在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，癌症是液体癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肾癌、肝胆癌、头颈部鳞状癌(HNSC)、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、***癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、食道癌、肾脏癌、黑素瘤和间皮瘤。在一些实施方案中，癌症是结肠癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，接触使受试者中的免疫应答增强。在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天性免疫应答。
在一些实施方案中，受试者已先前接受，正并行接受，或将随后接受免疫疗法。在一些实施方案中，免疫疗法是以下中的至少一者：检查点抑制剂；T细胞的检查点抑制剂；抗PD1抗体；抗PDL1抗体；抗CTLA4抗体；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞与抗原递呈细胞两者的抗原结合蛋白；BiTE双抗原结合蛋白；toll样受体配体；细胞因子；细胞毒性疗法；化学疗法；放射疗法；小分子抑制剂；小分子激动剂；免疫调节剂；和表观遗传调节剂。在一些实施方案中，免疫疗法是抗PD1抗体。
在另一方面，本文描述杀灭患有癌症的受试者的TREM2+骨髓细胞，使所述TREM2+骨髓细胞丧失能力或消减的方法，所述方法包括使所述骨髓细胞与本文所述的抗TREM2抗体或本文所述的药物组合物接触，任选地，其中所述骨髓细胞在肿瘤内。
在一些实施方案中，抗体结合TREM2的细胞外结构域，其中TREM2+骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-非刺激性骨髓细胞，其中所述抗体通过ADCC、CDC和/或ADCP杀灭所述非刺激性骨髓细胞，使所述非刺激性骨髓细胞丧失能力或消减，以达到水平小于在所述非刺激性骨髓细胞与所述抗体接触之前，存在于癌症中的非刺激性骨髓细胞的水平，其中所述非刺激性骨髓细胞存在于包含CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+刺激性骨髓细胞和所述非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中，其中所述接触不实质上杀灭存在于所述癌症的外部的骨髓细胞和/或存在于所述癌症中的刺激性骨髓细胞，不实质上使存在于所述癌症的外部的骨髓细胞和/或存在于所述癌症中的刺激性骨髓细胞丧失能力或消减，并且其中杀灭所述非刺激性骨髓细胞，使所述非刺激性骨髓细胞丧失能力或消减通过使对所述癌症的免疫应答增强来治疗所述癌症。
在一些实施方案中，抗体通过ADCC、CDC和ADCP中的至少一者杀灭骨髓细胞。在一些实施方案中，抗体通过ADCC、CDC和ADCP中的至少一者使骨髓细胞丧失能力。在一些实施方案中，抗体通过ADCC、CDC和ADCP中的至少一者使骨髓细胞消减。在一些实施方案中，抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，抗体具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施方案中，抗体具有抗体介导的吞噬(ADCP)活性。在一些实施方案中，抗体具有受体-配体阻断活性、激动活性或拮抗活性。
在一些实施方案中，骨髓细胞是刺激性骨髓细胞。在一些实施方案中，骨髓细胞是非刺激性骨髓细胞。在一些实施方案中，骨髓细胞包括树突细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、嗜中性白细胞或单核细胞中的至少一者。在一些实施方案中，骨髓细胞是嗜中性白细胞。在一些实施方案中，骨髓细胞是肿瘤相关巨噬细胞。在一些实施方案中，骨髓细胞在肿瘤内。在一些实施方案中，骨髓细胞在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。
在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，癌症是液体癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肾癌、肝胆癌、头颈部鳞状癌(HNSC)、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、***癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、食道癌、肾脏癌、黑素瘤和间皮瘤。在一些实施方案中，癌症是结肠癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，接触使受试者中的免疫应答增强。在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天性免疫应答。
在一些实施方案中，受试者已先前接受，正并行接受，或将随后接受免疫疗法。在一些实施方案中，免疫疗法是以下中的至少一者：检查点抑制剂；T细胞的检查点抑制剂；抗PD1抗体；抗PDL1抗体；抗CTLA4抗体；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞与抗原递呈细胞两者的抗原结合蛋白；BiTE双抗原结合蛋白；toll样受体配体；细胞因子；细胞毒性疗法；化学疗法；放射疗法；小分子抑制剂；小分子激动剂；免疫调节剂；和表观遗传调节剂。在一些实施方案中，免疫疗法是抗PD1抗体。
在另一方面，本文描述一种检测患有或被怀疑患有疾病或疾患的受试者中的TREM2的方法，所述方法包括：(a)接收来自所述受试者的样品；和(b)通过使所述样品与本文所述的抗体接触来检测TF在所述样品中的存在性或水平。
在一些实施方案中，疾病或疾患是癌症。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用检查点抑制剂，任选地，其中所述检查点抑制剂是PD1:PDL1轴的抑制剂，任选地，其中所述抑制剂是抗体，并且任选地，其中所述抗体是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。
在另一方面，本文描述一种包括本文公开的抗体或药物组合物和使用说明的药盒。
附图说明
图1A-图1C.在CT-26同种同基因小鼠肿瘤模型中，在与抗PD-1抗体组合的情况下，抗TREM2 PI-7012介导的抗肿瘤活性。(A)PI-7012的无海藻糖基化与抗PD-1抗体组合使抗肿瘤活性改进。显示的是平均肿瘤体积(10只小鼠/组)。显示了(B)关于PI-7012的单个肿瘤体积和(C)关于无海藻糖基化PI-7012(afuc-PI-7012)的单个肿瘤体积。
图2在组合治疗的情况下无显著体重减轻。将每个组中十只小鼠用所指示抗体治疗，并且在频繁间隔下记录体重。将每个组的平均体重相对于研究天数绘图。
图3.除H&E染色之外，还使用抗CD68抗体对组织的巨噬细胞进行染色。细胞内标志物CD68已在文献中作为可靠细胞化学标志物用于对发炎组织和肿瘤中的单核细胞/巨噬细胞进行免疫染色。在肺(图版E)中，以及在分析的其他组织中，相较于对照，在任何治疗组中都未观察到CD68+巨噬细胞数目的可辨别变化，从而指示抗TREM2介导的消减特异性地发生在TME中。
图4A-图4B.(A)对来自所指示治疗组的FFPE肺组织的抗CD68染色。(B)每个切片的八至九个视野用于通过光学显微术进行定量。
图5.在所选组织中的细胞上，TREM2表达是不存在的或极低的。阴影化直方图来自TREM2KO，并且空心直方图来自野生型小鼠。用于抗TREM2染色的抗体是来自R&D Systems的克隆237920。
图6.相较于MC38肿瘤与CT26肿瘤两者内的粒细胞性或单核细胞性MDSC，在TAM上，TREM2的细胞表面表达(空心直方图)是显著更高的。淋巴细胞不表达TREM2。同种型对照染色显示于灰色填充直方图中。
图7.相较于任何PBMC子组，在CD14源性巨噬细胞上，TREM2的细胞表面表达(空心直方图)是显著更高的。人PBMC或巨噬细胞关于TREM2(空心直方图)或同种型对照(灰色直方图)加以表面染色。使用预先验证的多色FACS组套，将PBMC子组辨别为嗜中性白细胞、单核细胞或T细胞。
图8.相较于其他浸润物或非CD45阳性细胞，在TAM上，TREM2的细胞表面表达(空心直方图)是显著更高的。来自人肿瘤组织的单细胞混悬液关于TREM2(空心直方图)或同种型对照(灰色直方图)加以表面染色。使用预先验证的多色FACS组套，对免疫子组和非免疫子组进行辨别。
图9A-图9F.抗TREM2 mAb afuc-PI7012与抗PD-1 mAb组合在Panc-02胰腺肿瘤模型中导致显著抗肿瘤活性。(A)在用Panc-02肿瘤细胞植入并且用所指示mAb治疗的雌性C57BL/6J小鼠中，随时间追踪肿瘤体积。Y轴代表每个组中10只小鼠的平均肿瘤体积的平均值+/-标准偏差。(B)来自用同种型对照mAb治疗的单个动物的肿瘤体积。(C)来自用抗TREM2mAb afuc-PI7012治疗的单个动物的肿瘤体积。(D)来自用抗PD-1抗体治疗的单个动物的肿瘤体积。(E)来自用抗TREM2 mAb afuc-PI7012和抗PD-1抗体治疗的单个动物的肿瘤体积。(F)对每个治疗组的在植入之后第32天的群组平均肿瘤体积的统计分析。
图10.在抗TREM2 mAb加抗PD-1 mAb治疗之后无肿瘤的BALB/c小鼠在三个月后用CT26肿瘤细胞再激发(方块符号)。年龄匹配的治疗原初性小鼠(圆形符号)接受等同数目的CT26细胞，并且在研究时期期间追踪肿瘤生长。在研究时期期间不对小鼠提供额外治疗。
具体实施方式
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且每当适当时，以单数使用的术语还将包括复数，并且反之亦然。在以下阐述的任何定义与以引用的方式并入本文的任何文件冲突的情况下，应以阐述的定义为准。
应了解本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”方面和实施方案。
对于本文所述的所有组合物以及使用本文所述的组合物的所有方法，组合物可包含所列组分或步骤，或可“基本上由所列组分或步骤组成”。当组合物被描述为“基本上由所列组分组成”时，所述组合物含有所列组分，并且可含有不实质上影响所治疗疾患的其他组分，但不含有除明确列出的那些组分以外的实质上影响所治疗疾患的任何其他组分；或如果所述组合物确实含有除那些所列组分以外的实质上影响所治疗疾患的额外组分，那么所述组合物不含有足以实质上影响所治疗疾患的浓度或数量的所述额外组分。当方法被描述为“基本上由所列步骤组成”时，所述方法含有所列步骤，并且可含有不实质上影响所治疗疾患的其他步骤，但所述方法不含有除明确列出的那些步骤以外的实质上影响所治疗疾患的任何其他步骤。作为一非限制性特定实例，当组合物被描述为‘基本上由某一组分组成’时，所述组合物可另外含有任何数量的药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂以及不实质上影响所治疗疾患的其他所述组分。
术语“任选地”在连续使用时意图包括列举组合中的一者至全部，并且涵盖所有子组合。
如本文所用的“有效量”或“治疗有效量”是指治疗性化合物诸如抗TREM2抗原结合剂或抗TREM2抗体的以单次剂量形式或作为一系列剂量的一部分单独或与另一治疗模态组合向个体施用的有效产生或促进所需治疗作用的量。所需治疗作用的实例是使免疫应答增强，减缓或延迟肿瘤发展；使疾病稳定；改善一种或多种症状。有效量可以一次或多次剂量给与。
如本文所用的术语“治疗”是指延缓或逆转疾患诸如癌症的进展。如本文所用的术语“治疗”是指治疗疾患诸如癌症的行动。
如本文所用的“个体”或“受试者”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物、以及动物园动物、运动动物或玩赏动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，个体是小鼠。
术语“调节(modulate/modulation)”是指降低或抑制，或替代地，活化或增加所叙述变量。
术语“增加”和“活化”是指所叙述变量增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，增加至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大。
术语“降低”和“抑制”是指所叙述变量降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，降低至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100，或降低更多。
术语“激动”是指使受体信号传导活化以诱导与受体的活化相关的生物应答。“激动剂”是结合受体以及使受体激动的实体。
术语“拮抗”是指使受体信号传导抑制以抑制与受体的活化相关的生物应答。“拮抗剂”是结合受体以及使受体拮抗的实体。
如本文所用的术语“约”是指相应值的易于为本技术领域中的熟练人士所知的通常误差范围。一示例性误差范围是加上或减去5％。在本文中提及“约”某一值或参数包括(并且描述)有关那个值或参数本身的实施方案。
必须注意的是，除非上下文另外明确规定，否则如说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”包括复数个指示物。
对于本文所述的结构和功能特征中的任一者，确定这些特征的方法在本领域中是已知的。
抗体
结构
本申请提供了抗体和包含结合TREM2蛋白的抗体的组合物，包括使非刺激性骨髓细胞丧失能力的抗体。
术语“抗体”在本文中以它的最广泛意义使用，并且包括包含一个或多个特异性结合抗原或表位的抗原结合结构域的某些类型的免疫球蛋白分子。抗体特定地包括完整抗体(例如完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。
认定的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及数万种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。抗体或免疫球蛋白的“类别”是指由它的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可进一步分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
一示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每个链的N末端结构域界定主要负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链结构域。IgG1重链从N末端至C末端分别包含VH、CH1、CH2和CH3结构域。轻链从N末端至C末端包含VL和CL结构域。IgG1重链在CH1结构域与CH2结构域之间包含铰链。在某些实施方案中，免疫球蛋白构建体包含至少一个来自IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的免疫球蛋白结构域连接于治疗性多肽。在一些实施方案中，见于本文提供的抗体中的免疫球蛋白结构域来自或源于基于免疫球蛋白的构建体诸如微型双功能抗体或纳米抗体。在某些实施方案中，本文所述的免疫球蛋白构建体包含至少一个来自重链抗体诸如骆驼科动物抗体的免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文提供的免疫球蛋白构建体包含至少一个来自哺乳动物抗体诸如牛抗体、人抗体、骆驼科动物抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的免疫球蛋白结构域。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含重链。在一个实施方案中，重链是IgA重链。在一个实施方案中，重链是IgD重链。在一个实施方案中，重链是IgE重链。在一个实施方案中，重链是IgG重链。在一个实施方案中，重链是IgM重链。在一个实施方案中，重链是IgG1重链。在一个实施方案中，重链是IgG2重链。在一个实施方案中，重链是IgG3重链。在一个实施方案中，重链是IgG4重链。在一个实施方案中，重链是IgA1重链。在一个实施方案中，重链是IgA2重链。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的在序列方面高度可变和/或形成结构确定的环(“高变环”)的区域中的每一者。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，所述互补决定区具有最高序列可变性和/或涉及于抗原识别中。除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语关于可变区的形成抗原结合区的部分在本文中可互换使用。这个特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequencesof Proteins of Immunological Interest(1983)以及由Chothia等,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中当相对于彼此加以比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子组。然而，将任一定义应用来指代抗体或其变体的CDR意图在如本文所定义和所用的所述术语的范围内。涵盖特定CDR的确切残基数目将视CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规方式确定哪些残基构成特定CDR。
CDR的氨基酸序列边界可由本领域技术人员使用许多已知编号流程中的任一者来确定，所述编号流程包括由Kabat等(上文)(“Kabat”编号流程)；Al-Lazikani等,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号流程)；MacCallum等,1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“接触”编号流程)；Lefranc等,Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号流程)；以及Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号流程)描述的那些；所述文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。
表A提供如通过Kabat流程和Chothia流程鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的位置。对于CDR-H1，提供了使用Kabat编号流程与Chothia编号流程两者的残基编号。
CDR可例如使用抗体编号软件诸如可在www.bioinf.org.uk/abs/abnum/处获得，并且描述于以引用的方式整体并入本文的Abhinandan和Martin,Immunology,2008,45:3832-3839中的Abnum加以指定。
表A.CDR中的根据Kabat编号流程和Chothia编号流程的残基。
*当使用Kabat编号惯例加以编号时，视CDR的长度而定，CDR-H1的C末端在H32与H34之间变化。
当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号流程”(例如如Kabat等(上文)中所报道)。除非另外陈述，否则EU编号流程用于提及本文所述的抗体重链恒定区中的残基。
如本文所用，术语“单链”是指包含由肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在一特定所述实施方案中，在单链Fab分子中，Fab轻链的C末端连接于Fab重链的N末端。如本文更详细所述，scFv具有轻链的可变结构域(VL)从它的C末端由多肽链连接于重链的可变结构域(VH)的N末端。或者，scFv包含其中VH的C末端由多肽链连接于VL的N末端的多肽链。
“Fab片段”(也被称为抗原结合片段)含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)以及分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含抗原结合中涉及的互补决定环(CDR，也被称为高变区)。Fab′片段与Fab片段由于在重链CH1结构域的羧基末端添加有少许残基而不同，所述残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。
“F(ab’)2”片段含有两个在铰链区附近由二硫键接合的Fab’片段。F(ab’)2片段可例如通过重组方法或通过胃蛋白酶消化完整抗体来产生。F(ab’)片段可例如通过用β-巯基乙醇处理来解离。
“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接二聚体。
“单链Fv”或“scFv”包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽接头。对于scFv的综述，参见Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段描述于WO93/16185；美国专利号5,571,894；以及美国专利号5,587,458中。
“scFv-Fc”片段包含scFv连接于Fc结构域。举例来说，Fc结构域可连接于scFv的C末端。视scFv中的可变结构域的定向(即VH-VL或VL-VH)而定，Fc结构域可在VH或VL之后。可使用本领域中已知或本文所述的任何适合Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域包括IgG4 Fc结构域。
术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指其中抗体的一个可变结构域在不存在另一可变结构域下特异性结合抗原的分子。单结构域抗体及其片段描述于Arabi Ghahroudi等,FEBS Letters,1998,414:521-526以及Muyldermans等,Trends in Biochem.Sci.,2001,26:230-245中，所述文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。单结构域抗体也被称为sdAb或纳米抗体。Sdab十分稳定，并且易于作为融合配偶体与抗体的Fc链一起表达(Harmsen MM,De Haard HJ(2007)."Properties,production,and applications ofcamelid single-domain antibody fragments".Appl.Microbiol Biotechnol.77(1):13-22)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换用于指代具有与天然存在的抗体结构大致上类似的结构，以及具有包含Fc区的重链的抗体。举例来说，当用于指代IgG分子时，“全长抗体”是包含两个重链和两个轻链的抗体。
术语“表位”意指抗原的特异性结合抗体的部分。表位常常由表面可及氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于在变性溶剂存在下，与前者而非与后者的结合可丧失。表位可包含直接涉及于结合中的氨基酸残基以及不直接涉及于结合中的其他氨基酸残基。抗体结合的表位可使用用于表位确定的已知技术来确定，诸如像测试抗体与具有不同点突变的TREM2变体或与嵌合TREM2变体的结合。
“多特异性抗体”是包含两个或更多个共同地特异性结合两个或更多个不同表位的不同抗原结合结构域的抗体。两个或更多个不同表位可为同一抗原(例如由细胞表达的单一TREM2分子)上或不同抗原(例如由同一细胞表达的不同TREM2分子、或TREM2分子和非TREM2分子)上的表位。在一些方面，多特异性抗体结合两个不同表位(即“双特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合三个不同表位(即“三特异性抗体”)。
“单特异性抗体”是包含一个或多个特异性结合单一表位的结合位点的抗体。单特异性抗体的一实例是天然存在的IgG分子，所述IgG分子尽管是二价的(即具有两个抗原结合结构域)，但在两个抗原结合结构域中的每一者处识别相同表位。结合特异性可以任何适合效价存在。
术语“单克隆抗体”是指来自大致上同质抗体的群体的抗体。大致上同质抗体的群体包含大致上类似，并且结合一种或多种相同表位的抗体，例外之处是可通常在单克隆抗体的产生期间产生的变体。所述变体通常仅少量存在。单克隆抗体通常通过包括从多种抗体选择单一抗体的方法获得。举例来说，选择方法可为从多种克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其他重组DNA克隆的汇合物选择独特克隆。所选抗体可加以进一步改变，例如以使对靶标的亲和力改进(“亲和力成熟”)，以使抗体人源化，以使它在细胞培养中的产生改进，和/或以使它在受试者中的免疫原性降低。
“效应功能”是指由抗体的Fc区介导的那些生物活性，所述活性可视抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括用以使补体依赖性细胞毒性(CDC)活化的C1q结合、用以使抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞性吞噬(ADCP)活化的Fc受体结合、受体配体阻断、激动或拮抗。
抗TREM2抗体可包括本文所述的那些，诸如表格中阐述的克隆。在一些实施方案中，抗体包含替代性骨架。在一些实施方案中，抗体由替代性骨架组成。在一些实施方案中，抗体基本上由替代性骨架组成。在一些实施方案中，抗体包含抗体片段。在一些实施方案中，抗体由抗体片段组成。在一些实施方案中，抗体基本上由抗体片段组成。“TREM2抗体”、“抗TREM2抗体”或“TREM2特异性抗体”是特异性结合抗原TREM2的如本文提供的抗体。在一些实施方案中，抗体结合TREM2的细胞外结构域。在某些实施方案中，本文提供的TREM2抗体结合TREM2的在来自不同物种的TREM2蛋白之间保守的表位。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源于不同来源或物种的抗体。
非人抗体的“人源化”形式是含有源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大体上是人抗体(接受者抗体)，其中来自一个或多个CDR的残基由来自非人抗体(供者抗体)的一个或多个CDR的残基替换。供者抗体可为具有所需特异性、亲和力或生物作用的任何适合非人抗体，诸如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物抗体。当它向人受试者施用时，相较于非人物种抗体，人源化抗体诱导免疫应答的可能性较小，和/或诱导较小严重程度的免疫应答。在一些情况下，接受者抗体的所选框架区残基由来自供者抗体的相应框架区残基替换。人源化抗体还可包含不见于接受者抗体或供者抗体中的残基。可进行所述修饰以进一步改进抗体功能。如何制备人源化抗体的实例可见于美国专利号6,054,297、5,886,152和5,877,293中，所述专利中的每一者以引用的方式整体并入本文。对于其他细节，参见Jones等,Nature,1986,321:522-525；Riechmann等,Nature,1988,332:323-329；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，所述文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，来自人抗体的一个或多个恒定结构域融合于非人物种的一个或多个可变结构域。在另一实施方案中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以使当它向人受试者施用时，所述非人抗体的可能的免疫原性降低，其中改变的氨基酸残基对于抗体与它的抗原的免疫特异性结合来说不是关键的，或所进行的对氨基酸序列的改变是保守性改变，以致相比于所述非人抗体与抗原的结合，人源化抗体与抗原的结合不显著更糟。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生或源于非人来源的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体，所述非人来源利用人抗体谱系或人抗体编码序列(例如从人来源获得或重新设计)。人抗体明确排除人源化抗体。在一个实施方案中，可变结构域和恒定结构域全都源于人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。这些抗体可以多种方式制备，包括通过用目标抗原使被遗传修饰来表达由人重链和/或轻链编码基因产生的抗体的小鼠免疫。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含抗体片段。在一些实施方案中，本文提供的抗体由抗体片段组成。在一些实施方案中，本文提供的抗体基本上由抗体片段组成。在一些实施方案中，抗体片段是Fv片段。在一些实施方案中，抗体片段是Fab片段。在一些实施方案中，抗体片段是F(ab’)2片段。在一些实施方案中，抗体片段是Fab’片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv(sFv)片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv-Fc片段。在一些实施方案中，抗体片段是单结构域抗体的片段。
TREM2抗体的序列
VH结构域
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:1的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:3的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:5的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:7的VH序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含与以SEQ ID NO:1、3、5和7提供的说明性VH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含以SEQ ID NO:1、3、5和7提供的VH序列，具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
VL结构域
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:2的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:4的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:6的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:8的VL序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含与以SEQ ID NO:2、4、6和8提供的说明性VL序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含以SEQ ID NO:2、4、6和8提供的VL序列，具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
VH-VL组合
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH序列；和选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ ID NO:2的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:3的VH序列和SEQ ID NO:4的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:5的VH序列和SEQ ID NO:6的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列。在某些方面，SEQ ID NO:1、3、5和7中的任一者可与SEQ ID NO:2、4、6和8中的任一者组合。举例来说，SEQ ID NO:1可与SEQ ID NO:2、4、6或8中的任一者组合。作为另一实例，SEQID NO:2可与SEQ ID NO:1、3、5或7中的任一者组合。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含与以SEQ ID NO:1、3、5和7提供的说明性VH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VH序列；和与以SEQ IDNO:2、4、6和8提供的说明性VL序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含以SEQ ID NO:1、3、5和7提供的VH序列，具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代，以及以SEQ ID NO:2、4、6和8提供的VL序列，具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
CDR
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的三个CDR。在一些方面，CDR是示例性CDR。在一些方面，CDR是Kabat CDR。在一些方面，CDR是Chothia CDR。在一些方面，CDR是AbM CDR。在一些方面，CDR是接触CDR。在一些方面，CDR是IMGT CDR。
在一些实施方案中，CDR是与SEQ ID NO:1、3、5和7的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的CDR。在一些实施方案中，CDR-H1是选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的CDR-H1，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR-H2是选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的CDR-H2，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR-H3是选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的CDR-H3，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的三个CDR。在一些方面，CDR是示例性CDR。在一些方面，CDR是Kabat CDR。在一些方面，CDR是Chothia CDR。在一些方面，CDR是AbM CDR。在一些方面，CDR是接触CDR。在一些方面，CDR是IMGT CDR。
在一些实施方案中，CDR是与SEQ ID NO:2、4、6和8的CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的CDR。在一些实施方案中，CDR-L1是选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的CDR-L1，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR-L2是选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的CDR-L2，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR-L3是选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的CDR-L3，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的一个至三个CDR以及选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的两个至三个CDR以及选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、3、5和7的VH结构域的三个CDR以及选自SEQ ID NO:2、4、6和8的VL结构域的三个CDR。在一些方面，CDR是示例性CDR。在一些方面，CDR是Kabat CDR。在一些方面，CDR是Chothia CDR。在一些方面，CDR是AbM CDR。在一些方面，CDR是接触CDR。在一些方面，CDR是IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:11的所选CDR-H3。在一些方面，CDR-H3与SEQ ID NO:11的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是SEQ ID NO:11的所选CDR-H3，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:10的CDR-H2。在一些方面，CDR-H2与SEQ ID NO:10的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H2是SEQ ID NO:10的CDR-H2，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:9的CDR-H1。在一些方面，CDR-H1与SEQ ID NO:9的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H1是SEQ ID NO:9的CDR-H1，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:11的CDR-H3和SEQ ID NO:10的CDR-H2。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:11的CDR-H3、SEQ ID NO:10的CDR-H2和SEQ ID NO:9的CDR-H1。在一些实施方案中，CDR-H3与SEQ ID NO:11的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H2与SEQ ID NO:10的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且CDR-H1与SEQ ID NO:9的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是SEQ IDNO:11的CDR-H3，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H2是SEQ ID NO:10的CDR-H2，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；并且CDR-H1是SEQ ID NO:9的CDR-H1，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:14的CDR-L3。在一些方面，CDR-L3与SEQ ID NO:14的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L3是SEQ ID NO:14的CDR-L3，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:13的CDR-L2。在一些方面，CDR-L2与SEQ ID NO:13的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L2是SEQ ID NO:13的CDR-L2，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:12的CDR-L1。在一些方面，CDR-L1与SEQ ID NO:12的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L1是SEQ ID NO:12的CDR-L1，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:14的CDR-L3和SEQ ID NO:13的CDR-L2。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:14的CDR-L3、SEQ ID NO:13的CDR-L2和SEQ ID NO:12的CDR-L1。在一些实施方案中，CDR-L3与SEQ ID NO:14的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-L2与SEQ ID NO:13的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且CDR-L1与SEQ ID NO:12的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L3是SEQID NO:14的CDR-L3，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L2是SEQ ID NO:13的CDR-L2，具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且CDR-L1是SEQ ID NO:12的CDR-L1，具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:11的CDR-H3、SEQ ID NO:10的CDR-H2、SEQ ID NO:9的CDR-H1、SEQ ID NO:14的CDR-L3、SEQ ID NO:13的CDR-L2和SEQID NO:12的CDR-L1。在一些实施方案中，CDR-H3与SEQ ID NO:11的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H2与SEQ ID NO:10的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H1与SEQ ID NO:9的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-L3与SEQ ID NO:14的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-L2与SEQ ID NO:13的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且CDR-L1与SEQ ID NO:12的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是SEQ ID NO:11的CDR-H3，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H2是SEQ ID NO:10的CDR-H2，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H1是SEQ ID NO:9的CDR-H1，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L3是SEQ ID NO:14的CDR-L3，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L2是SEQ ID NO:13的CDR-L2，具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且CDR-L1是SEQ IDNO:12的CDR-L1，具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，所述变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，所述变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:9的CDR-H1、SEQ ID NO:10的CDR-H2、SEQ ID NO:11的CDR-H3、SEQ ID NO:12的CDR-L1、SEQ ID NO:13的CDR-L2和SEQ IDNO:14的CDR-L1。
Fc区
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区域。所述术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。除非在本文中另外规定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用的二聚Fc的“Fc多肽”是指形成二聚Fc结构域的两个多肽中的一者，即包含免疫球蛋白重链的能够稳定自我缔合的C末端恒定区的多肽。举例来说，二聚IgG Fc的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域序列。Fc可具有类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可进一步分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述结合抗体的Fc区的受体。举例来说，FcR可为天然序列人FcR。通常，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括具有类似氨基酸序列，主要在它们的细胞质结构域方面不同的FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)。其他同种型的免疫球蛋白也可由某些FcR结合(参见例如Janeway等,Immuno Biology:the immune system in health and disease,(Elsevier ScienceLtd.,NY)(第4版,1999))。活化性受体FcγRIIA在它的细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在它的细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)(综述于Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中)。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。其他FcR，包括待在未来鉴定的那些，由本文术语“FcR”涵盖。所述术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)；以及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。
在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体。
在一些实施方案中，抗体是IgG3抗体。
在一些实施方案中，抗体是IgG2抗体。
在一些实施方案中，抗体是IgG4抗体。
CH2结构域中的修饰可影响FcR与Fc的结合。Fc区中用于选择性改变Fc对不同Fcγ(Fc-gamma)受体的亲和力的许多氨基酸修饰在本领域中是已知的。在一个实施方案中，Fc包含一个或多个用以促进对Fcγ受体的选择性结合的修饰。
在以下列出使FcR与Fc的结合改变的示例性突变：
S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y,Vernes JM,Chiang N等JImmunol Methods.2011年2月28日；365(1-2):132-41)；
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB,Gorlatov S,Tuaillon N等Cancer Res.2007年9月15日；67(18):8882-90；Nordstrom JL,Gorlatov S,Zhang W等Breast Cancer Res.2011年11月30日；13(6):R123)；
F243L(Stewart R,Thom G,Levens M等Protein Eng Des Sel.2011年9月；24(9):671-8.)、S298A/E333A/K334A(Shields RL,Namenuk AK,Hong K等J Biol Chem.2001年3月2日；276(9):6591-604)；
S239D/I332E/A330L、S239D/I332E(Lazar GA,Dang W,Karki S等Proc Natl AcadSci USA.2006年3月14日；103(11):4005-10)；
S239D/S267E、S267E/L328F(Chu SY,Vostiar I,Karki S等Mol Immunol.2008年9月；45(15):3926-33)；
S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D以及以引用的方式并入本文的WO2011/120134和WO2011/120135中所列的其他突变。Therapeutic AntibodyEngineering(由William R.Strohl和Lila M.Strohl所著,Woodhead生物医学出版丛书(Woodhead Publishing series in Biomedicine)第11辑,ISBN 1 907568 37 9,2012年10月)在第283页列出突变。
在一些实施方案中，本文所述的抗体包括用以改进它介导效应功能的能力的修饰。所述修饰在本领域中是已知的，并且包括无海藻糖基化，或工程改造Fc对活化性受体主要是FCGR3a(对于ADCC来说)以及对C1q(对于CDC来说)的亲和力。下表B概述文献中报道的用于进行效应功能工程改造的各种设计。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含具有一个或多个使ADCC改进的氨基酸取代的Fc区，所述氨基酸取代诸如是在Fc区的位置298、333和334中的一者或多者处的取代。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含具有在位置239、332和330处的一个或多个氨基酸取代的Fc区，如以引用的方式整体并入本文的Lazar等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2006,103:4005-4010中所述。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含一个或多个使C1q结合和/或CDC改进或减弱的改变。参见美国专利号6,194,551；WO 99/51642；以及Idusogie等,J.Immunol.,2000,164:4178-4184；所述专利和文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。
因此，在一个实施方案中，本文所述的抗体可包括包含一个或多个如表B中指示的赋予改进的效应功能的氨基酸修饰的二聚Fc。在另一实施方案中，可使抗体无海藻糖基化以改进效应功能。
表B：CH2结构域和效应功能工程改造
使FcγR和/或补体结合和/或效应功能降低的Fc修饰在本领域中是已知的。新近出版物描述已用于以效应活性得以降低或沉默来对抗体进行工程改造的策略(参见Strohl,WR(2009),Curr Opin Biotech 20:685-691；以及Strohl,WR和Strohl LM,“Antibody Fc engineering for optimal antibody performance”,TherapeuticAntibody Engineering,Cambridge:Woodhead Publishing(2012),第225-249页)。这些策略包括通过改变糖基化，使用IgG2/IgG4骨架，或在Fc的铰链或CH2区中引入突变来使效应功能降低。举例来说，美国专利公布号2011/0212087(Strohl)、国际专利公布号WO 2006/105338(Xencor)、美国专利公布号2012/0225058(Xencor)、美国专利公布号2012/0251531(Genentech)以及Strop等((2012)J.Mol.Biol.420:204-219)描述用以降低FcγR或补体与Fc的结合的特定修饰。
用以降低FcγR或补体与Fc的结合的已知氨基酸修饰的特定非限制性实例包括在下表C中标识的那些：
表C：用以降低FcγR或补体与Fc的结合的修饰
在不改变氨基酸序列的情况下产生在Fc糖基化位点(Asn 297，EU编号)上具有少许或不具有海藻糖的抗体的方法在本领域中是熟知的。技术(ProBioGen AG)基于将使细胞海藻糖生物合成路径偏转的酶的基因引入用于产生抗体的细胞中。这阻止由抗体产生性细胞向N连接的抗体碳水化合物部分添加糖“海藻糖”。(von Horsten等(2010)Glycobiology.2010年12月；20(12):1607-18。)能够产生去海藻糖基化抗体的细胞系的实例包括稳定过度表达细菌氧化还原酶GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)的CHO-DG44(参见Henning von Horsten等,Glycobiol 2010,20:1607-1618)或在蛋白质海藻糖基化方面具有缺陷的Lec13 CHO细胞(参见Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.,1986,249:533-545；美国专利公布号2003/0157108；WO 2004/056312；所述文献和专利中的每一者以引用的方式整体并入本文)，以及剔除细胞系诸如α-1,6-海藻糖基转移酶基因或FUT8剔除CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622；Kanda等,Biotechnol.Bioeng.,2006,94:680-688；以及WO 2003/085107；所述文献和专利中的每一者以引用的方式整体并入本文)。用以获得具有降低水平的海藻糖基化的抗体的另一方法可见于美国专利8,409,572中，所述专利教导选择能够在抗体上产生较低水平的海藻糖基化的用于产生抗体的细胞系。
抗体可为完全无海藻糖基化的(此意指它们不含有可检测海藻糖)，或它们可为部分无海藻糖基化的，此意指经分离抗体含有的海藻糖数量是通常对于由哺乳动物表达系统产生的类似抗体检测的海藻糖数量的小于95％、小于85％、小于75％、小于65％、小于55％、小于45％、小于35％、小于25％、小于15％或小于5％。
在一些方面，本文提供的抗体包含相较于天然存在的IgG1结构域，在位置Asn 297处具有降低的海藻糖含量的IgG1结构域。已知所述Fc结构域具有改进的ADCC。参见Shields等,J.Biol.Chem.,2002,277:26733-26740，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，所述抗体在位置Asn 297处不包含任何海藻糖。海藻糖的量可使用任何适合方法测定，例如如以引用的方式整体并入本文的WO 2008/077546中所述。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含二等分寡糖，诸如连接于抗体的Fc区的由GlcNAc二等分的双触角寡糖。所述抗体变体可具有降低的海藻糖基化和/或改进的ADCC功能。所述抗体变体的实例例如描述于WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；以及美国专利公布号2005/0123546中；所述专利中的每一者以引用的方式整体并入本文。
可并入本文提供的抗体中的其他说明性糖基化变体例如描述于美国专利公布号2003/0157108、2004/0093621、2003/0157108、2003/0115614、2002/0164328、2004/0093621、2004/0132140、2004/0110704、2004/0110282、2004/0109865；国际专利公布号2000/61739、2001/29246、2003/085119、2003/084570、2005/035586、2005/035778；2005/053742、2002/031140；Okazaki等,J.Mol.Biol.,2004,336:1239-1249；以及Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622中，所述专利和文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的Fc区。所述抗体变体可具有改进的CDC功能。所述抗体变体的实例例如描述于WO1997/30087；WO 1998/58964；以及WO 1999/22764中；所述专利中的每一者以引用的方式整体并入本文。
能够产生去海藻糖基化抗体的细胞系的实例包括稳定过度表达细菌氧化还原酶GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)的CHO-DG44(参见Henning von Horsten等,Glycobiol 2010,20:1607-1618)或在蛋白质海藻糖基化方面具有缺陷的Lec13 CHO细胞(参见Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.,1986,249:533-545；美国专利公布号2003/0157108；WO 2004/056312；所述文献和专利中的每一者以引用的方式整体并入本文)，以及剔除细胞系诸如α-1,6-海藻糖基转移酶基因或FUT8剔除CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622；Kanda等,Biotechnol.Bioeng.,2006,94:680-688；以及WO 2003/085107；所述文献和专利中的每一者以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，抗体具有抗体依赖性细胞性吞噬(ADCP)活性。ADCP可在抗体结合病原性或致肿瘤性靶标细胞的表面上的抗原时发生。在它们的细胞表面上携带Fc受体的吞噬细胞，包括单核细胞和巨噬细胞，识别并结合与靶标细胞结合的抗体的Fc区。在Fc受体与抗体结合的靶标细胞结合后，对靶标细胞的吞噬可被引发。ADCP可被视为ADCC的一种形式。
在一些实施方案中，抗体能够形成免疫复合物。举例来说，免疫复合物可为由抗体覆盖的肿瘤细胞。
在一些方面，抗TREM2抗体不实质上结合存在于癌症组织的外部的骨髓细胞。在一些方面，抗TREM2抗体不实质上结合存在于癌症组织中的刺激性骨髓细胞。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体由杂交瘤产生。在其他实施方案中，抗体由被工程改造来表达所需可变结构域和恒定结构域的重组细胞产生。
在一些实施方案中，抗体可为单链抗体或保留抗原特异性和下部铰链区或其变体的其他抗体衍生物。
在一些实施方案中，抗体可为多功能抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、它们的片段或变体。在特定实施方案中，抗体片段或其衍生物选自Fab片段、Fab′2片段、CDR和ScFv。
在一些实施方案中，抗体对表面抗原诸如TREM2蛋白具有特异性。在一些实施方案中，治疗性抗体对肿瘤抗原(例如由肿瘤细胞特异性表达的分子)具有特异性。在特定实施方案中，治疗性抗体可具有人或非人灵长类动物IgG1或IgG3 Fc部分。
结合
关于抗体与靶标分子的结合，术语“结合”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位、与特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位“特异性结合”、“特异性结合”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位、“对特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位具有特异性”、“选择性结合”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位和“对特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位具有选择性”意指结合在可测量程度上不同于非特异性或非选择性相互作用(例如与非靶标分子的相互作用)。特异性结合可例如通过测量与靶标分子的结合以及将它和与非靶标分子的结合进行比较来测量。特异性结合还可通过与模拟在靶标分子上识别的表位的对照分子的竞争来测定。在那个情况下，如果抗体与靶标分子的结合由对照分子竞争性抑制，那么指示特异性结合。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原或表位)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力可由解离平衡常数(KD)表示。以下更详细描述促成解离平衡常数的动力学分量。亲和力可通过本领域中已知的常用方法测量，所述方法包括本文所述的那些，诸如表面等离子体共振(SPR)技术(例如)或生物层干涉测量术(例如
如本文所用的术语“kd”(s-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。这个值也被称为k解离值。
如本文所用的术语“ka”(M-1×s-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。这个值也被称为k缔合值。
如本文所用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。KD＝kd/ka。在一些实施方案中，抗体的亲和力以关于所述抗体与它的抗原之间的相互作用的KD描述。为明晰起见，如本领域中所知，较小KD值指示较高亲和相互作用，而较大KD值指示较低亲和相互作用。
如本文所用的术语“KA”(M-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数。KA＝ka/kd。
当在本文中在两个或更多个抗体的情形下使用时，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”指示所述两个或更多个抗体竞争结合抗原(例如TREM2)。在一个示例性测定中，将TREM2包被在表面上，并且使其与第一TREM2抗体接触，此后，添加第二TREM2抗体。在另一示例性测定中，将第一TREM2抗体包被在表面上，并且使其TREM2与接触，接着添加第二TREM2抗体。如果在任一测定中，第一TREM2抗体的存在使第二TREM2抗体的结合降低，那么抗体彼此竞争。术语“与……竞争”还包括抗体的组合，其中一种抗体使另一抗体的结合降低，但其中在以相反顺序添加抗体时无竞争被观察到。然而，在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体抑制彼此的结合，无论添加它们的顺序如何。在一些实施方案中，一种抗体使另一抗体与它的抗原的结合降低至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。熟练技术人员可基于抗体对TREM2的亲和力以及抗体的效价来选择抗体的在竞争测定中使用的浓度。这个定义中所述的测定是说明性的，并且熟练技术人员可利用任何适合测定来确定抗体是否彼此竞争。适合测定例如描述于Cox等,“Immunoassay Methods”,Assay Guidance Manual[Internet],2014年12月24日更新(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/；2015年9月29日访问)；Silman等,Cytometry,2001,44:30-37；以及Finco等,J.Pharm.Biomed.Anal.,2011,54:351-358中；所述文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的抗体以小于或等于约0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、1.95、2、3、4、5、6、7、8、9或10x10-9M的KD结合人TREM2，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文提供的抗体的KD在约0.001-0.01、0.01-0.1、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-1、0.25-0.75、0.25-0.5、0.5-0.75、0.75-1、0.75-2、1.1-1.2、1.2-1.3、1.3-1.4、1.4-1.5、1.5-1.6、1.6-1.7、1.7-1.8、1.8-1.9、1.9-2、1-2、1-5、2-7、3-8、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、7-10、或5-10x10-9M之间，如通过Biacore测定所测量。
在一些实施方案中，本文提供的抗体以小于或等于约2、1.98、1.95、1.9、1.85、1.8、1.75、1.7、1.65、1.6、1.55、1.50、1.45或1.4x10-9M或更小的KD结合人TREM2，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文提供的抗体以在1.9-1.8、1.8-1.7、1.7-1.6、1.6-1.5、或1.9-1.5x10-9M之间的KD结合人TREM2，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文提供的抗体以小于或等于约10、9.56、9.5、9.0、8.88、8.84、8.5、8、7.5、7.32、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1x10-4(1/s)或更小的Kd结合人TREM2，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文提供的抗体以在7-10、7-8、8-9、9-10、7-7.5、7.5-8、8.-8.5、8.5-9、9-9,5、或9.5-10x10-4(1/s)之间的Kd结合人TREM2，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文提供的抗体以大于或等于约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、45、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、7、8、9或10x105(1/Ms)或更大的Ka结合人TREM2，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文提供的抗体以在4-7、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、或6.5-7、7-8、8-9、或9-10x105(1/Ms)之间的Ka结合人TREM2，如通过Biacore测定所测量。
在一些实施方案中，本文提供的抗体以小于或等于2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM的EC50结合人TREM2，如通过流式细胞计量术所测量。在一些实施方案中，抗体以在0.6-1.4nM之间的EC50结合人TREM2，如通过流式细胞计量术所测量。在一些实施方案中，抗体以约0.5、0.6、0.9、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5nM的EC50结合人TREM2，如通过流式细胞计量术所测量。
在一些实施方案中，本文提供的抗体以小于或等于2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM的EC50结合小鼠TREM2，如通过流式细胞计量术所测量。在一些实施方案中，抗体以在0.6-1.4nM之间的EC50结合小鼠TREM2，如通过流式细胞计量术所测量。在一些实施方案中，抗体以约0.5、0.6、0.9、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5nM的EC50结合小鼠TREM2，如通过流式细胞计量术所测量。
在一些实施方案中，本文提供的抗体不以大于或等于20nM或更大的EC50结合人TREM2，如通过流式细胞计量术所测量。在一些实施方案中，本文提供的抗体不以大于或等于3nM或更大的EC50结合小鼠TREM2，如通过流式细胞计量术所测量。
为筛选结合由目标抗体结合的靶标抗原(例如TREM2)上的表位的抗体，可进行常规交叉阻断测定，诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Harlow和David Lane编(1988)中所述的测定。或者或另外，可通过本领域中已知的方法进行表位定位。
抗体之间的竞争可通过其中所测试的抗体抑制或阻断参考抗体与共同抗原的特异性结合的测定来测定(参见例如Junghans等,Cancer Res.50:1495,1990；Fendly等Cancer Research 50:1550-1558；US 6,949,245)。如在竞争性结合测定中所测量，如果过量测试抗体(例如至少2倍、5倍、10倍、20倍或100倍)使参考抗体的结合抑制或阻断例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，那么测试抗体与参考抗体竞争。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和/或结合充分邻近于由参考抗体结合的表位的邻近表位以达成发生空间位阻的抗体。举例来说，可鉴定与本文所述的第一抗体竞争结合TREM2的第二竞争性抗体。在某些情况下，如在竞争性结合测定中所测量，第二抗体可使第一抗体的结合阻断或抑制例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在某些情况下，第二抗体可置换大于50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的第一抗体。
功能
在一些实施方案中，抗体具有抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)活性。ADCC可在抗体结合病原性或致肿瘤性靶标细胞的表面上的抗原时发生。在它们的细胞表面上携带Fcγ受体(FcγR或FCGR)的效应细胞，包括细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞或单核细胞，识别并结合与靶标细胞结合的抗体的Fc区。所述结合可触发细胞内信号传导路径的活化，从而导致细胞死亡。在特定实施方案中，抗体的免疫球蛋白Fc区亚型(同种型)包括人IgG1和IgG3。如本文所用，ADCC是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)识别结合在靶标细胞上的抗体，并且随后导致所述靶标细胞的溶解。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为评估目标分子的ADCC活性，可进行诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的体外ADCC测定。可用于所述测定的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可在体内，例如在诸如Clynes等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估目标分子的ADCC活性。
在一些实施方案中，抗体具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。抗体诱导的CDC通过经典补体级联的蛋白质介导，并且通过补体蛋白质Clq与抗体的结合触发。抗体Fc区与Clq的结合可诱导补体级联的活化。在特定实施方案中，抗体的免疫球蛋白Fc区亚型(同种型)包括人IgG1和IgG3。如本文所用，CDC是指分子在补体存在下使靶标溶解的能力。补体活化路径通过补体系统的第一组分(C1q)和与同源抗原复合的分子(例如多肽(例如抗体))的结合引发。为评估补体活化，可进行例如如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的CDC测定。
在一些实施方案中，抗体是激动性抗体。激动性抗体可在所述抗体结合在细胞上表达的TREM2蛋白之后诱导(例如增加)NSM的一种或多种活性或功能。激动性抗体可结合并活化NSM，从而导致细胞增殖的变化或改变抗原递呈能力。激动性抗体可结合并活化NSM，从而触发导致细胞生长或凋亡改变的细胞内信号传导路径。
在一些实施方案中，抗体是拮抗性抗体。拮抗性抗体可在所述抗体结合在细胞上表达的TREM2蛋白之后阻断(例如降低)NSM的一种或多种活性或功能。举例来说，拮抗抗体可结合一种或多种NSM蛋白并阻断配体与一种或多种NSM蛋白的结合，从而阻止细胞的分化和增殖或改变抗原递呈能力。拮抗抗体可结合TREM2蛋白并阻止由TREM2蛋白的配体对TREM2蛋白的活化，从而改变促进细胞生长和存活的细胞内信号传导路径。
在一些实施方案中，抗体是消减性抗体。消减性抗体是在接触后将通过抗体与具有各种分子的其他免疫细胞的相互作用来杀灭非刺激性骨髓细胞的抗体。举例来说，当结合于携带TREM2蛋白的细胞时，抗体可啮合补体蛋白质，并且诱导补体依赖性细胞溶解。当结合于携带TREM2蛋白的细胞时，抗体还可触发携带Fc受体的邻近细胞来通过抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)杀灭它们。
在一些实施方案中，抗体是中和抗体，并且所述抗体中和NSM的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，TREM2蛋白在非刺激性骨髓细胞的表面上表达，并且抗体识别TREM2蛋白的细胞外结构域。
在一些实施方案中，抗体对NSM具有选择性(优先结合TREM2)。在某些实施方案中，选择性结合NSM的抗体具有0.0001nM至1μM的范围的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合TREM2蛋白上在来自不同物种的蛋白质之间保守的表位。在另一实施方案中，选择性结合包括但不要求排他性结合。
在一个实施方案中，结合于它的靶标的抗TREM2抗体负责导致它所结合的非刺激性骨髓细胞在体内消减。在一些实施方案中，由簇集抗体诱导的效应蛋白可触发多种应答，包括释放炎症性细胞因子，调控抗原产生，胞吞，或细胞杀灭。在一个实施方案中，抗体能够在体内募集和活化补体或介导抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)，或在体内通过结合Fc受体来介导吞噬。抗体还可在结合后通过诱导非刺激性骨髓细胞的凋亡或坏死来使非刺激性骨髓细胞消减。
在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力在体外达成，并且通过以下方式实现：a)对非刺激性骨髓细胞进行杀灭；b)对非刺激性骨髓细胞进行磁珠消减；或c)使用荧光激活的细胞分选(FACS)对非刺激性骨髓细胞进行分选。
在一些实施方案中，抗体结合于或缀合于效应分子。在特定实施方案中，抗体缀合于至少一种选自由组成的组的治疗剂：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、第二抗体和第二抗体片段。
在某些实施方案中，抗体缀合于药物，例如毒素、化学治疗剂、免疫调节剂或放射性同位素。制备ADC(抗体药物缀合物)的若干方法在本领域中是已知的，并且描述于例如美国专利8,624,003(锅法)、8,163,888(一步)和5,208,020(两步法)中。抗体或其抗原结合片段可缀合于至少一种药剂，包括放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、第二抗体和具有抗原结合性的第二抗体片段。
非刺激性骨髓细胞(NSM)
本文提供了用于使非刺激性骨髓细胞(NSM)丧失能力和/或检测非刺激性骨髓细胞(NSM)，包括使用抗TREM2抗体的方法和组合物。本文还提供了用于靶向和/或检测表达NSM蛋白的非刺激性骨髓细胞的方法和组合物。
本文还提供了用于使非刺激性骨髓细胞丧失能力和/或检测非刺激性骨髓细胞，包括在那个非人个体中使用针对人NSM蛋白的非人同源物的抗体的方法和组合物。
如本文所用，非刺激性骨髓细胞是不足够有效刺激免疫应答(例如相较于刺激性骨髓细胞，在肿瘤微环境中不同样有效刺激抗肿瘤应答)的骨髓细胞。在一些实施方案中，相较于刺激性骨髓细胞，非刺激性骨髓细胞不同样有效向T细胞递呈抗原(例如肿瘤抗原)，或不同样有效刺激肿瘤特异性T细胞应答。在一些实施方案中，相较于刺激性骨髓细胞，非刺激性骨髓细胞可展示用以摄取肿瘤相关抗原、加工肿瘤相关抗原和/或向T细胞递呈肿瘤相关抗原的能力降低。非刺激性骨髓细胞可含有降低的用以对细胞毒性T淋巴细胞进行再致敏的能力或不含有所述能力，或在一些情况下，不能刺激有效肿瘤细胞杀灭。相较于刺激性骨髓细胞，非刺激性骨髓细胞可展示涉及于抗原加工、抗原递呈和/或抗原共刺激中的基因和细胞表面标志物的较低表达，所述基因和细胞表面标志物包括不限于CD80、CD86、MHCI和MHCII。
当相较于刺激性骨髓细胞时，非刺激性骨髓细胞可展示与交叉递呈、共刺激和/或刺激性细胞因子相关的基因的较低表达，所述基因包括不限于TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9、TAPBP、PSME2、CD24a、CD274、BTLA、CD40、CD244、ICOSL、ICAM1、TIM3、PDL2、RANK、FLT3、CSF2RB、CSF2RB2、CSF2RA、IL12b、XCR1、CCR7、CCR2、CCL22、CXCL9和CCL5中的任何一者或多者；以及消炎性细胞因子IL-10的增加表达。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞依赖于转录因子IRF4和细胞因子GM-CSF或CSF-1达成分化和存活。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞可通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)和一氧化氮合成酶(NOS)促进肿瘤血管生成，并且通过分泌表皮生长因子(EGF)支持肿瘤生长。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、嗜中性白细胞、单核细胞或树突细胞(DC)。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞不是树突细胞(DC)。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是嗜中性白细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。TAM是存在于癌性肿瘤附近或内部的巨噬细胞，并且源于循环单核细胞或驻留组织巨噬细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞基于它们表达的标志物或它们选择性表达的标志物加以区分。细胞表面标志物的表达可被描述为‘+’或‘阳性’。不存在细胞表面标志物可被描述为‘-’或‘阴性’。细胞表面标志物的表达可被进一步描述为‘高’(细胞表达高水平的标志物)或‘低’(细胞表达低水平的标志物)。标志物的水平可通过本领域中已知的各种方法测定，所述方法例如免疫染色和FACS分析、或凝胶电泳和Western印迹。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是树突细胞(DC)。在一些实施方案中，树突细胞可通过刺突或树突形态区分。在一个实施方案中，非刺激性树突细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+(也被称为DC1细胞)。在一个实施方案中，非刺激性树突细胞不是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+(也被称为DC2细胞)。在一个实施方案中，是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+的树突细胞是刺激性骨髓细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是肿瘤相关巨噬细胞。在一些实施方案中，例如在人中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于靶向其他哺乳动物中例如小鼠中的TAM和DC。在所述实施方案中，使小鼠TAM和DC与TREM2抗体接触。在一个实施方案中，例如在小鼠中，肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低(也被称为TAM1)。在一个实施方案中，例如在小鼠中，肿瘤相关巨噬细胞是至少CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高(也被称为TAM2)。如本文所用的术语“CD11b高巨噬细胞”涉及表达高水平的CD11b的巨噬细胞。如本文所用的术语“CD11b低巨噬细胞”涉及在它们的表面上表达相比于CD11b高巨噬细胞的CD11b水平，实质上更低水平的CD11b的巨噬细胞。如本文所用的术语“CD11c高”涉及巨噬细胞表达高水平的CD11c。如本文所用的术语“CD11c低巨噬细胞”涉及在它们的表面上表达相比于Cd11c高巨噬细胞的CD11c水平，实质上更低水平的CD11c的巨噬细胞。
在一些实施方案中，本发明的非刺激性骨髓细胞包括TAM和DC1细胞中的一者或多者。
在一些实施方案中，例如在小鼠中，本发明的非刺激性骨髓细胞包括TAM1、TAM2和DC1细胞中的一者或多者。在所述实施方案中，使本发明的非刺激性骨髓细胞与TREM2抗体接触。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是在肿瘤内的骨髓细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞定位在肿瘤病变的边缘内或在转化肿瘤导管中，在那里它们与同源T细胞接触。在一个实施方案中，非刺激性骨髓细胞的定位被改变，以致细胞不再定位在肿瘤边缘处，或不再与T细胞接触。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在仅包含非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。本发明的免疫细胞群体可为纯净的，同质的，异质的，源于多种来源(例如患病组织、肿瘤组织、健康组织、细胞库)，在原代细胞培养中维持，在永生化培养中维持，和/或在离体培养中维持。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是肿瘤相关巨噬细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是树突细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-和CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-和CD11c+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-和CD11c+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-和CD11c+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞不是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包含不是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+的细胞。
在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低的细胞。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低的细胞组成。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低的细胞组成。在所述实施方案中，使非刺激性小鼠骨髓细胞与TREM2抗体接触。
在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞包含是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高的细胞。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高的细胞组成。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞基本上由是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高的细胞组成。在所述实施方案中，使非刺激性小鼠骨髓细胞与TREM2抗体接触。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在癌症组织中。
在一些实施方案中，免疫细胞群体在癌症组织中。
在一些实施方案中，非刺激性细胞和刺激性骨髓细胞在癌症组织中。
在一些实施方案中，生物样品包含含有非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体。
NSM细胞可总体指代存在于肿瘤组织中，并且可根据它们的NSM细胞标志物表达来与其他细胞类型区分的DC1、TAM1和TAM2细胞。举例来说，相比于SDC的基因和相关蛋白质，在NSM细胞中以更大丰度表达或翻译的基因和相关蛋白质可充当NSM标志物。一示例性NSM标志物是CD11b。额外示例性NSM标志物列于表A中。NSM细胞可在它们的细胞表面上表达TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119。在一些方面，NSM细胞不表达KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1中的至少一者。
在一个实施方案中，NSM细胞表达表A中所列的NSM标志物基因中的一者或多者。在另一实施方案中，NSM细胞表达表D中所列的NSM标志物中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18者或更多者。在另一实施方案中，NSM细胞表达表D中所列的NSM标志物中的大多数或全部。在另一实施方案中，NSM细胞被鉴定为表达MRC1、MS4A7、C1QC、APOE、C1QB、C1QA和C5AR1。
表D
刺激性骨髓细胞
如本文所用，刺激性骨髓细胞(在某些方面也称为SDC)是有效刺激免疫应答的骨髓细胞(例如相较于非刺激性骨髓细胞，在肿瘤微环境中更有效刺激抗肿瘤应答)。在一些实施方案中，相较于非刺激性骨髓细胞，刺激性骨髓细胞有效向T细胞递呈抗原(例如肿瘤抗原)，或有效刺激肿瘤特异性T细胞应答。在一些实施方案中，相较于非刺激性骨髓细胞，刺激性骨髓细胞可展示用以摄取肿瘤相关抗原、加工肿瘤相关抗原和/或向T细胞递呈肿瘤相关抗原的能力增加。相对于非刺激性骨髓细胞，刺激性骨髓细胞可具有增加的用以对细胞毒性T淋巴细胞进行再致敏的能力，或在一些情况下，可刺激有效肿瘤细胞杀灭。相较于非刺激性骨髓细胞，刺激性骨髓细胞可展示涉及于抗原加工、抗原递呈和/或抗原共刺激中的基因和细胞表面标志物的较高表达，所述基因和细胞表面标志物包括不限于CD80、CD86、MHCI和MHCII。
示例性刺激性骨髓细胞标志物列于表A中。举例来说，在人SDC中，Xcr1、Clec9a和BDCA3(CD141)的表达是SDC身份的标志。应注意，在小鼠中，CD103也可用作SDC身份的强力标志物，但它不在人SDC中表达。
在一个实施方案中，SDC是具有树突细胞身份，并且还表达表A中所列的SDC标志物中的一者或多者的肿瘤浸润性骨髓细胞。在另一实施方案中，SDC是具有树突细胞身份，并且还表达表A中所列的SDC标志物中的两者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者或全部的肿瘤浸润性骨髓细胞。在另一实施方案中，SDC被鉴定为表达BDCA3、KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、XCR1和CLEC9A的肿瘤浸润性骨髓树突细胞。SDC细胞可表达KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1中的至少一者。在一些实施方案中，SDC不在它们的细胞表面上实质上表达TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和/或TMEM119。在一些实施方案中，SDC不实质上表达C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和/或LILRB4。流式细胞计量术和PCR以及其他本领域认可的测定可用于评估本文公开的标志物的表达。
刺激性骨髓细胞可为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+。刺激性骨髓细胞可为CD45+、HLA-DR+和BDCA3+。刺激性骨髓细胞可为CD45+、HLA-DR+、CD14-和BDCA3+。刺激性骨髓细胞可为CD45+、HLA-DR+、CD11c+和BDCA3+。
蛋白质、核苷酸和同源物
本文提供了用于使表达NSM蛋白的非刺激性人骨髓细胞丧失能力和/或检测表达NSM蛋白的非刺激性人骨髓细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明涉及使来自非人哺乳动物细胞的表达NSM蛋白同源物的非刺激性骨髓细胞丧失能力和/或检测所述非刺激性骨髓细胞。举例来说，小鼠中的NSM蛋白可表现与它的人同源物类似的限定表达样式。因此，在一个实施方案中，本文提供了用于使表达NSM蛋白的非刺激性小鼠骨髓细胞丧失能力和/或检测表达NSM蛋白的非刺激性小鼠骨髓细胞的方法和组合物。本文还提供了用于使来自表达NSM蛋白的具有类似表达样式的同源物的任何个体的非刺激性细胞丧失能力和/或检测所述非刺激性细胞的类似方法和组合物，所述细胞展现与所述NSM蛋白的表达样式类似的表达样式。
NSM蛋白或核苷酸可包括C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和LILRB4以及它们的同源物中的至少一者或多者。SDC蛋白或核苷酸可包括KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1以及它们的同源物中的至少一者或多者。细胞表面NSM蛋白可包括TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119中的至少一者或多者。细胞表面NSM蛋白可由单独或呈组合形式的一种或多种抗TREM2抗体。通常，NSM呈NSM蛋白或核苷酸阳性以及SDC蛋白或核苷酸阴性；相反地，SDC通常呈SDC蛋白或核苷酸阳性以及NSM蛋白或核苷酸阴性。
本文所述的抗体包含至少一个多肽，但它们通常包含HC/LC的二聚体，即四个多肽。还描述了编码本文所述的多肽的多核苷酸。抗体通常是经分离的。
如本文所用，“经分离”意指试剂(例如多肽或多核苷酸)已得以鉴定并与它的天然细胞培养环境的组分分离和/或从所述组分回收。它的天然环境的污染物组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。经分离还指试剂已以合成方式产生，例如通过人为干预来产生。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，涉及多肽的描述同等适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖具有任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基由共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构，即存在结合于氢、羧基、氨基和R基团的a碳的化合物，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫
氨基酸在本文中可通过它们的通常已知三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可通过它们的通常接受的单字母代码来提及。
本发明中还包括编码抗体的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”意图指示具有两个或更多个核苷酸分子的连续链段。核苷酸序列可具有基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源或它们的任何组合。
术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及它们的呈单链或双链形式的聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸与参考核酸具有类似结合性质，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式被代谢。除非另外明确限制，否则所述术语还指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、用于反义技术中的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另外指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。特别地，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等,NucleicAcid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
“经保守修饰变体”适用于氨基酸序列与核酸序列两者。关于特定核酸序列，“经保守修饰变体”是指编码同一或基本上同一氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上同一序列。由于遗传密码的简并性，所以许多在功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由某一密码子指定的每个位置处，所述密码子可改变成所述相应密码子中的任一者而不改变编码的多肽。所述核酸变异是作为一个种类的经保守修饰变异的“沉默变异”。本文每个编码多肽的核酸序列还描述核酸的每个可能的沉默变异。本领域普通技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)都可被修饰以产生在功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含于每个所述序列中。
关于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或小百分比的氨基酸的单个取代、缺失或添加是“经保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸的缺失，氨基酸的添加，或氨基酸被化学类似氨基酸取代。提供功能类似氨基酸的保守性取代表为本领域普通技术人员所知。所述经保守修饰变体是外加于本文所述的多态性变体、种间同源物和等位基因的经保守修饰变体，并且不排除本文所述的多态性变体、种间同源物和等位基因。
提供功能类似氨基酸的保守性取代表为本领域普通技术人员所知。以下八组各自含有是彼此的保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及[0139]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins:Structures andMolecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月))。
术语“同一”或“同一性”百分比在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下是指两个或更多个序列或子序列是相同的。如使用一种以下序列比较算法(或可为本领域普通技术人员所用的其他算法)或通过手动比对和目视检查所测量，如果序列在比较和对准以达成历经比较窗或指定区域具有最大对应时具有某一百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即历经指定区域约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％同一性)，那么它们是“大致上同一的”。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN(DNASTAR)、CLUSTALW、CLUSTAL OMEGA或MUSCLE软件。这个定义还涉及测试序列的互补序列。同一性可历经长度是至少约50个氨基酸或核苷酸的区域，或历经长度是75-100个氨基酸或核苷酸的区域，或当未指定时跨越多核苷酸或多肽的整个序列而存在。编码本发明的多肽(包括来自除人以外的物种的同源物)的多核苷酸可通过包括以下步骤的方法获得：在严格杂交条件下用具有本文所述的多核苷酸序列或其片段的经标记探针筛选文库，以及分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。所述杂交技术为熟练技术人员所熟知。
对于序列比较，通常一个序列充当测试序列与其进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用缺省程序参数，或可指定替代性参数。序列比较算法接着基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的“比较窗”包括提及具有选自由20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150组成的组的任一连续位置数目的区段，其中在最优对准两个序列之后，可将序列与具有相同连续位置数目的参考序列进行比较。对准序列以进行比较的方法为本领域普通技术人员所知。可包括但不限于通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的类似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行程序(Wisconsin Genetics软件包(Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手动比对和目视检查(参见例如Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(1995补编))来对用于比较的序列进行最优比对。
适于确定序列同一性百分比和序列类似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，所述算法分别描述于Altschul等(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402以及Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过在万维网上在ncbi.nlm.nih.gov处可用的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用字长(W)11、预期值(E)10、M＝5、N＝-4以及比较两个链作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和预期值(E)10、以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对值(B)50、预期值(E)10、M＝5、N＝-4和比较两个链作为缺省值。BLAST算法通常在关闭“低复杂性”过滤器下进行。
BLAST算法还进行两个序列之间的类似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种类似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供对在两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配所具有的概率的指示。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸比较时的最小总和概率小于约0.2，或小于约0.01，或小于约0.001，那么核酸被视为与参考序列类似。
短语“选择性(或特异性)杂交于”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下，分子仅与那个序列结合、双链化或杂交。
短语“严格杂交条件”是指DNA、RNA或其他核酸或它们的组合的序列在如本领域中所知的低离子强度和高温条件下杂交。通常，在严格条件下，探针将杂交于复杂核酸混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中它的靶标子序列，但不杂交于所述复杂混合物中其他序列。严格条件依赖于序列，并且在不同情况下将是不同的。较长序列在较高温度下特异性杂交。关于核酸杂交的一详尽指南见于Tijssen,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993)中。
如本文所用，术语“工程改造(engineer/engineered/engineering)”被视为包括对肽骨架的任何操作或对天然存在多肽或重组多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列的修饰、对糖基化样式的改变、或对单个氨基酸的侧链基团的修饰以及这些方法的组合。经工程改造蛋白质通过标准分子生物学技术来表达和产生。
就“经分离核酸分子或多核苷酸”来说，其意指已从它的天然环境移除的核酸分子,即DNA或RNA。举例来说，含于载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为是经分离的。经分离多核苷酸的其他实例包括在异源性宿主细胞中维持的重组多核苷酸，或于溶液中的纯化(部分地或实质上)多核苷酸。经分离多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的细胞中含有的所述多核苷酸分子，但所述多核苷酸分子存在于染色体外，或在与它的天然染色***置不同的染色***置处。经分离RNA分子包括体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式，和双链形式。本文所述的经分离多核苷酸或核酸还包括例如通过PCR或化学合成以合成方式产生的所述分子。此外，在某些实施方案中，多核苷酸或核酸包括调控元件诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
术语“聚合酶链式反应”或“PCR”通常是指一种用于在体外扩增所需核苷酸序列的方法，如例如美国专利号4,683,195中所述。一般来说，PCR方法涉及使用能够优先杂交于模板核酸的寡核苷酸引物进行的引物延伸合成的重复循环。
就核酸或多核苷酸具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列来说，此意指所述多核苷酸的所述核苷酸序列与所述参考序列是同一的，例外之处是对于所述参考核苷酸序列的每100个核苷酸，多核苷酸序列可包括多达五个点突变。换句话说，为获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，所述参考序列中多达5％的核苷酸可被缺失或被另一核苷酸取代，或可将多达参考序列中核苷酸总数的5％的数目的核苷酸***所述参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置处或在那些末端位置之间的任何地方，单个地散布在参考序列中的残基之中，或以一个或多个连续群组形式散布在参考序列内。实际上，任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一可使用已知计算机程序加以常规确定，所述计算机程序诸如以上关于多肽讨论的计算机程序(例如ALIGN-2)。
如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始肽的具有100个氨基酸的序列具有至少50％同一性，那么所述衍生物或变体被称为与所述肽共有“同源性”或是“同源的”。在某些实施方案中，衍生物或变体与和衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽的片段是至少75％相同的。在某些实施方案中，衍生物或变体与和衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽的片段是至少85％相同的。在某些实施方案中，衍生物的氨基酸序列与和衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽的片段是至少90％相同的。在一些实施方案中，衍生物的氨基酸序列与和衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽的片段是至少95％相同的。在某些实施方案中，衍生物或变体与和衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽的片段是至少99％相同的。
如本文所用的术语“修饰”是指对给定多肽进行的任何变化，诸如对多肽的长度、氨基酸序列、化学结构的变化，对多肽的共翻译修饰或翻译后修饰。“(经修饰)”形式术语意指所讨论的多肽任选地被修饰，即所讨论的多肽可被修饰或未被修饰。
在一些方面，多肽包含与本文公开的一个或多个表格中阐述或以本文公开的一个或多个登录号阐述的相关(例如多肽和/或抗体)氨基酸序列或其片段至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一的氨基酸序列。在一些方面，本文公开的经分离抗体或蛋白质包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸与本文公开的一个或多个表格中阐述或以本文公开的一个或多个登录号阐述的相关核苷酸序列或其片段至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一。在一些方面，核苷酸序列包括与本文公开的核苷酸序列诸如本文公开的一个或多个表格中阐述或以本文公开的一个或多个登录号阐述的那些至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一的核苷酸序列。
药物组合物
本申请提供了包含抗体的组合物，包括包含本文所述的抗体中的任何一者或多者以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，组合物是无菌的。药物组合物通常包含有效量的抗体。
除本文公开的抗体中的一者或多者之外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或为本领域技术人员所熟知的其他物质。所述物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、经皮肤或皮下、经鼻、肌肉内、腹膜内途径。
用于口服施用的药物组合物可呈片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可包括固体载体诸如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体诸如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内、经皮肤或皮下注射，或在病痛部位处的注射，活性成分将呈胃肠外可接受的水溶液形式，所述水溶液是无热原的，并且具有适合pH、等张性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等张媒介物诸如氯化钠注射液，林格氏注射液(Ringer'sInjection)、乳酸林格氏注射液来制备适合溶液。防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂可根据需要加以包括。
无论对个体给与的是多肽、抗体(例如抗TREM2抗体)、核酸、小分子还是其他药学上有用的化合物，施用都优选地以“治疗有效量”或“防治有效量”(视情况而定，尽管防治可被视为治疗)进行，这足以显示对所述个体的益处。实际施用量以及施用的速率和时程将取决于所治疗的蛋白质聚集疾病的性质和严重性。对治疗的指定例如关于剂量的决定等在普通从业者和其他医师的职责范围内，并且通常考虑待治疗的病症、单个受试者的状况、递送部位、施用方法以及为从业者所知的其他因素。以上提及的技术和方案的实例可见于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编),1980中。
视待治疗的疾患而定，组合物可单独施用，或与其他治疗进行组合，同时或依序加以施用。
方法
制备方法
本文所述的抗体可使用例如如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物来产生。
在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗体的经分离核酸。所述核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)或包含单结构域抗体的VHH的氨基酸序列。在另一实施方案中，提供了一种或多种包含所述核酸的载体(例如表达载体)。在一个实施方案中，核酸被提供在多顺反子载体中。在另一实施方案中，提供了一种包含所述核酸的宿主细胞。在一个所述实施方案中，宿主细胞包含(例如已用以下转化)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗原结合多肽构建体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了一种制备抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养如上提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
对于重组产生抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸，并且***一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。所述核酸可易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来分离和测序。
术语“实质上纯化”是指本文所述的构建体或其变体可实质上或基本上不含如见于它的天然存在的环境中的通常伴随蛋白质或与蛋白质相互作用的组分，所述天然存在的环境即天然细胞或在重组产生的异多聚体的情况下的宿主细胞，在某些实施方案中，本文所述的构建体或其变体实质上不含细胞物质，包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的污染性蛋白质的蛋白质制剂。当异多聚体或其变体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更低存在。当异多聚体或其变体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更低的细胞干重存在于培养基中。在某些实施方案中，通过本文所述的方法产生的“实质上纯化”异多聚体具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，特别地，具有至少约75％、80％、85％的纯度水平，并且更特别地，具有至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％或更大的纯度水平，如通过适当方法诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳所测定。
适于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源性多核苷酸而与用于***的方法无关的细胞，所述方法例如是直接摄取、转导、f交配或本领域中已知的用以创建重组宿主细胞的其他方法。外源性多核苷酸可以非整合载体例如质粒形式维持，或者，可整合至宿主基因组中。宿主细胞可包括CHO、CHO的衍生物、NS0、Sp2O、CV-1、VERO-76、HeLa、HepG2、Per.C6或BHK。
如本文所用，术语“真核生物”是指属于系统发生域真核域的生物体，诸如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文所用，术语“原核生物”是指原核生物体。举例来说，非真核生物体可属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等)系统发生域或古细菌(包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、盐杆菌(Halobacterium)(诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和盐杆菌属种NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷气热菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发生域。
举例来说，抗体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。)在表达之后，抗体可于可溶性级分中从细菌细胞糊状物分离，并且可进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，以及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞还源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定可与昆虫细胞联合使用的众多杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(所述专利描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。举例来说，适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系可为有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是通过SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7)；人胚肾株系(293或293细胞，如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(sertoli cell)(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR- CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)。
在一个实施方案中，通过包括以下的方法来在稳定哺乳动物细胞中产生本文所述的抗体：用编码抗体的核酸以预定比率转染至少一种稳定哺乳动物细胞；以及在至少一种哺乳动物细胞中表达核酸。在一些实施方案中，在短暂转染实验中确定核酸的预定比率以确定输入核酸的导致所表达产物中的抗体的百分比最高的相对比率。
在一些实施方案中的是在如本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生抗体的方法，其中至少一种稳定哺乳动物细胞的表达产物包含相较于单体重链或轻链多肽或其他抗体，处于更大百分比的所需糖基化抗体。
在一些实施方案中的是在本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化抗体的方法，所述方法包括鉴定和纯化所需糖基化抗体。在一些实施方案中，所述鉴定通过液相色谱法和质谱测定法中的一者或两者达成。
如果需要，那么可在表达之后纯化或分离抗体。蛋白质可以为本领域技术人员所知的多种方式分离或纯化。标准纯化方法包括使用诸如FPLC和HPLC的系统在常压下或在高压下进行的色谱技术，包括离子交换、疏水性相互作用、亲和、尺寸分级或凝胶过滤和反相色谱技术。纯化方法还包括电泳、免疫、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和透滤技术与蛋白质浓缩联合也是有用的。如本领域中所熟知，多种天然蛋白质结合Fc和抗体，并且这些蛋白质可在本发明中用于纯化抗体。举例来说，细菌蛋白A和蛋白G结合Fc区。同样，细菌蛋白L结合一些抗体的Fab区。纯化可经常通过特定融合配偶体来实现。举例来说，如果采用GST融合，那么可使用谷胱甘肽树脂纯化抗体，如果采用His标签，那么可使用Ni+2亲和色谱法纯化抗体，或如果使用flag标签，那么可使用固定化抗flag抗体纯化抗体。对于在适合纯化技术方面的一般性指导，参见例如以引用的方式整体并入本文的Protein Purification:Principles and Practice,第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY,1994，其以引用的方式整体并入本文。必要的纯化程度将视抗体的用途而变化。在一些情况下，不必要纯化。
在某些实施方案中，使用包括但不限于以下的阴离子交换色谱法纯化抗体：Q-琼脂糖、DEAE琼脂糖、poros HQ、poros DEAF、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、Toyopearl DEAE、Resource/Source Q和DEAE、Fractogel Q和DEAE柱色谱法。
在特定实施方案中，使用包括但不限于以下的阳离子交换色谱法纯化本文所述的蛋白质：SP-琼脂糖、CM琼脂糖、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱以及它们的等同物和类似物。
此外，可使用本领域中已知的技术来化学合成本文所述的抗体(例如参见Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman&Co.,N.Y以及Hunkapiller等,Nature,310:105-111(1984))。举例来说，对应于多肽的片段的多肽可通过使用肽合成仪合成。此外，如果需要，那么非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可作为取代或添加引入多肽序列中。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、丙氨酸、氟代氨基酸、设计氨基酸，诸如甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸以及一般来说氨基酸类似物。此外，氨基酸可为D(右旋)或L(左旋)氨基酸。
使用方法
在一个方面，本申请提供了使非刺激性骨髓细胞与抗TREM2抗体诸如人抗体接触的方法，所述接触导致使所述非刺激性骨髓细胞丧失能力。
在另一方面，本申请提供了使非刺激性骨髓细胞与抗TREM2小鼠抗体接触的方法，所述接触导致使所述非刺激性骨髓细胞丧失能力。
在一些实施方案中，非刺激性细胞是DC1细胞和TAM细胞中的一者或多者。
在一些实施方案中，本申请提供了使非刺激性骨髓细胞丧失能力的方法，所述方法包括使所述非刺激性骨髓细胞与TREM2抗体接触，由此杀灭所述非刺激性骨髓细胞。使……丧失能力是指致使细胞是部分或完全非功能性的。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致诱导细胞中的生长阻滞。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致细胞的凋亡。在一些实施方案中，使非刺激性细胞丧失能力导致如例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)使细胞溶解。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致细胞的坏死。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致诱导细胞中的生长阻滞。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致使细胞失活。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致中和细胞中TREM2蛋白的活性。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致细胞的增殖降低。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致细胞的分化。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致细胞充当抑制性抗原递呈细胞的能力降低，或导致细胞充当活化性抗原递呈细胞的能力增加。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致肿瘤组织或肿瘤微环境(TME)内的细胞的错误定位。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致肿瘤组织或肿瘤微环境内的细胞的空间组织改变。在一些实施方案中，使非刺激性骨髓细胞丧失能力导致肿瘤组织或TME内的细胞的时间表达改变。在一些实施方案中，方法还包括移除非刺激性骨髓细胞。
在使如本文所述的非刺激性骨髓细胞丧失能力的任何和所有方面，一种或多种特征或一种或多种功能的某一方面的任何增加或降低或改变都相较于未与抗TREM2抗体接触的细胞而言。
在另一方面，本申请提供了使非刺激性骨髓细胞与抗TREM2抗体接触的方法，所述接触导致对所述非刺激性骨髓细胞的功能的调节。调节可为以下中的任何一者或多者。在一些实施方案中，非刺激性细胞是DC1细胞、TAM1细胞和TAM2细胞中的一者或多者。在一些实施方案中，对功能的调节导致使非刺激性骨髓细胞丧失能力。在一些实施方案中，对非刺激性骨髓细胞的功能的调节导致细胞刺激天然CD8+ T细胞与经活化CD8+ T细胞两者的能力增加，例如通过使非刺激性细胞向原初CD8+ T细胞交叉递呈MHCI分子上的肿瘤抗原的能力增加。在一些实施方案中，调节使非刺激性骨髓细胞的T细胞刺激功能增加，包括例如细胞触发T细胞受体(TCR)信号传导、T细胞增殖或T细胞细胞因子产生的能力。在一个实施方案中，非刺激性细胞的存活得以降低，或非刺激性细胞的增殖得以降低。在一个实施方案中，刺激性骨髓细胞与非刺激性骨髓细胞的比率得以增加。
在使如本文所述的非刺激性骨髓细胞的功能降低的任何和所有方面，一种或多种特征或一种或多种功能的某一方面的任何增加或降低或改变都相较于未与抗TREM2抗体接触的细胞而言。
在一些实施方案中，本申请提供了杀灭(也被称为诱导细胞死亡)非刺激性骨髓细胞的方法，所述方法包括使所述非刺激性骨髓细胞与抗TREM2抗体接触，由此杀灭所述非刺激性骨髓细胞。在一些实施方案中，相对于尚未与抗TREM2抗体接触的非刺激性骨髓细胞，杀灭得以增加。在一些实施方案中，接触诱导非刺激性骨髓细胞的凋亡。在一些实施方案中，接触诱导非刺激性骨髓细胞的凋亡。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在包含非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。在一些实施方案中，方法还包括移除非刺激性骨髓细胞。在一些实施方案中，细胞中的10％-80％被杀灭。在一些实施方案中，细胞中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％被杀灭。
在一些实施方案中，本申请提供了使包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中刺激性骨髓细胞与非刺激性骨髓细胞的比率增加的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与抗TREM2抗体接触。在一些实施方案中，相对于尚未与抗TREM2抗体接触的细胞群体，比率得以增加。在一些实施方案中，DC2细胞与DC1细胞的比率得以增加。在一些实施方案中，DC2细胞与TAM1细胞的比率得以增加。在一些实施方案中，DC2细胞与TAM2细胞的比率得以增加。在一些实施方案中，DC2细胞与TAM1+TAM2细胞的比率得以增加。在一些实施方案中，DC2细胞与TAM1+DC1细胞的比率得以增加。在一些实施方案中，DC2细胞与DC1+TAM2细胞的比率得以增加。在一些实施方案中，DC2细胞与DC1+TAM1+TAM2细胞的比率得以增加。在一些实施方案中，至少，比率增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一些实施方案中，在接触之前，刺激性骨髓细胞与非刺激性骨髓细胞的比率在0.001:1–0.1:1的范围内。在一些实施方案中，在接触之后，刺激性骨髓细胞与非刺激性骨髓细胞的比率在0.1:1-100:1的范围内。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在数目方面降低。在一些实施方案中，刺激性骨髓细胞是DC2细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞例如由于坏死或凋亡而被杀灭。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞被诱导来经受生长阻滞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞不再增殖。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的空间定位得以改变，并且在TME的特定区域中的比率得以增加。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的时间表达得以改变，并且在肿瘤发展期间在特定时间期间的比率得以增加。
在一些实施方案中，接触在体外进行。在一些实施方案中，接触在体内进行。在一些特定实施方案中，接触在体内在人中进行。在一些实施方案中，接触通过施用抗TREM2抗体来实现。在一些实施方案中，接受抗体的个体(诸如人)患有癌症。
在另一方面，本发明提供了治疗个体的免疫相关疾患(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含抗TREM2抗体的组合物。在另一方面，本发明提供了使个体中的免疫应答增强的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含抗TREM2抗体的组合物。在一些实施方案中，这些方法还与其他共同疗法组合提供，所述共同疗法诸如PDL阻断疗法、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、CTLA4阻断疗法、抗CTLA-4抗体、其中T细胞上的抑制性分子被阻断的广泛性检查点阻断疗法、过继性T细胞疗法、CAR T细胞疗法、树突细胞或其他细胞疗法、以及常规化学疗法。
在一些实施方案中，方法还包括测定来自个体的生物样品中的TREM2蛋白的表达水平。在一些实施方案中，生物样品包括但不限于体液、组织样品、器官样品、尿、粪便、血液、唾液、CSF以及它们的任何组合。在一些实施方案中，生物样品源于肿瘤组织。在一些实施方案中，表达水平包括编码TREM2蛋白的mRNA的mRNA表达水平。在一些实施方案中，TREM2蛋白的表达水平包括NSM的蛋白质表达水平。在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的方法检测样品中的TREM2蛋白的表达水平：FACS、Western印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学分析、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱法、质谱测定法、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多路qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH以及它们的组合。
在另一方面，本申请提供了用于确定一般来说的非刺激性骨髓细胞的存在性或不存在性，或用于确定特定非刺激性骨髓细胞(例如DC1细胞、TAM1细胞和/或TAM2细胞)的存在性或不存在性的方法，所述方法包括：使包含非刺激性骨髓细胞的细胞群体与抗TREM2抗体接触；以及对非刺激性骨髓细胞的数目进行定量。在另一方面，本申请提供了用于确定非刺激性骨髓细胞的存在性或不存在性的方法，所述方法包括：使包含非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体与抗TREM2抗体接触；检测指示所述抗体与细胞的结合的复合物或部分，以及任选地，对所述群体中的非刺激性骨髓细胞的数目进行定量。在另一方面，提供了确定非刺激性骨髓细胞与刺激性骨髓细胞的相对比率的方法，所述方法包括：使包含非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体与抗TREM2抗体接触；对刺激性骨髓细胞的数目和非刺激性骨髓细胞的数目进行定量；以及确定非刺激性骨髓细胞与刺激性骨髓细胞的所述相对比率。
在本文所述的用于检测和/或定量的实施方案中，抗TREM2抗体结合TREM2蛋白，但未必必须影响生物应答诸如ADCC，尽管它可能对生物应答具有影响。
在另一方面，本发明提供了用于鉴定可对用于治疗免疫相关疾患(例如癌症)的免疫疗法(例如采用抗TREM2抗体)起响应的个体的方法，所述方法包括：检测来自所述个体的生物样品中的TREM2蛋白的表达水平；以及基于TREM2蛋白的所述表达水平确定所述个体是否可对免疫疗法起响应，其中相对于健康个体中的TREM2蛋白水平，所述个体中的TREM2蛋白的水平升高指示所述个体可对免疫疗法起响应。在一些实施方案中，这些方法还可用于诊断个体的免疫相关疾患(例如癌症)，并且基于TREM2蛋白的表达水平，其中相对于健康个体中的TREM2蛋白水平，个体中的TREM2蛋白的水平升高指示个体罹患癌症。在一些实施方案中，表达水平包括编码TREM2蛋白的mRNA的mRNA表达水平。在其他实施方案中，TREM2蛋白的表达水平包括TREM2蛋白的蛋白质表达水平。在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的方法检测样品中的TREM2蛋白的表达水平：FACS、Western印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学分析、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱法、质谱测定法、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多路qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH以及它们的组合。在这些实施方案中，抗TREM2抗体结合TREM2蛋白，但未必必须影响生物应答诸如ADCC。在一些实施方案中，生物样品源于肿瘤组织。在一些实施方案中，生物样品包括但不限于体液、组织样品、器官样品、尿、粪便、血液、唾液、CSF以及它们的任何组合。
本文还公开一种使受试者对肿瘤的免疫应答增强或使免疫疗法治疗的功效增强的方法。一般来说，使SDC的丰度增加的治疗将改进受试者结果，诸如无复发存活时间，并且将使癌症免疫疗法治疗的功效增强。治疗可使受试者的肿瘤中的SDC细胞的相对或绝对丰度增加。治疗可使受试者的肿瘤中的NSM细胞的相对或绝对丰度降低。
一般性治疗策略的示例性方法包括通过全身性引入Flt3L来使SDC的数目增加。另一方法是用Flt3L处理受试者的自体骨髓或血液细胞，同时阻断CSF1。例如通过逆转录病毒在骨髓或血液祖细胞群体中表达SDC转录因子诸如IRF8、Mycl1或BATF3或ZBTB46也可用于驱动SDC发育。另一治疗策略包括系统性消除NSM细胞，同时选择性赦免SDC。这可在这些群体的比率方面产生总体有利变化。消除NSM细胞可通过任何手段实现，包括施用(全身性施用或向肿瘤局部化施用)针对TREM2表面蛋白的抗体。
在一些实施方案中，增强SDC的治疗作为治疗性治疗施加以更好地使得受试者的天然免疫系统能够控制或根除癌症。在另一实施方案中，本发明的增强SDC的治疗与治疗性治疗诸如免疫疗法治疗组合施加(所述施加在所述免疫疗法治疗之前，与所述免疫疗法治疗并行，或在所述免疫疗法治疗之后)，其中增强SDC的治疗充当用以使所述治疗性治疗的功效增加的辅助或辅佐治疗。
施用方法
在一些实施方案中，本文提供的方法可用于治疗个体的免疫相关疾患。在一个实施方案中，个体是人，并且抗体是TREM2抗体。在另一实施方案中，个体是小鼠，并且抗体是TREM2抗体。
在一些实施方案中，对于体内施用本文所述的抗TREM2抗体，视施用途径而定，正常剂量可从每天每kg个体的体重约10ng直至约100mg或更多，优选地，从约1mg/kg/天至10mg/kg/天进行变化。对于历经数天或更久的重复施用，视待治疗的疾病或病症的严重性而定，持续治疗直至实现对症状的所需抑制。一示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量的抗TREM2抗体，继之以每隔一周的约1mg/kg的每周维持剂量。视医师希望实现的药物代谢动力学衰变样式而定，其他剂量方案可为有用的。举例来说，本文涵盖一周一次至二十一次对个体给药。在某些实施方案中，可使用在约3μg/kg至约2mg/kg的范围内(诸如约3μg/kg、约10μg/kg、约30μg/kg、约100μg/kg、约300μg/kg、约1mg/kg和约2mg/kg)的给药。在某些实施方案中，给药频率是每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、或每月一次、每两个月一次、每三个月一次，或更久。疗法的进展易于通过常规技术和测定来监测。给药方案，包括施用的抗TREM2抗体，可独立于所用剂量而随时间变化。
在一些实施方案中，本文提供的方法(诸如使免疫应答增强或实现使非刺激性骨髓细胞丧失能力的方法)可用于治疗癌症，因此，接受抗TREM2抗体或抗TREM2抗体的个体患有癌症。
任何适合癌症都可用本文提供的抗体治疗。癌症可为医学领域中已知的任何癌瘤、腺癌、软组织癌、肉瘤、畸胎瘤、黑素瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤或脑癌。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，癌症是液体癌症。在一些实施方案中，癌症是免疫逃避性的。在一些实施方案中，癌症是免疫应答性的。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、肾癌、肝胆癌、头颈部鳞状癌(HNSC)、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、***癌、肺癌、乳腺(***)癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、食道癌、肾脏癌、黑素瘤、白血病、淋巴瘤或间皮瘤。在一些实施方案中，癌症是结肠癌、胰腺癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，免疫相关疾患是与TREM2蛋白在非刺激性骨髓细胞上的表达(在人中)或TREM2蛋白的同源物在非人物种中的表达相关的免疫相关疾患。在一些实施方案中，免疫相关疾患是与相较于刺激性骨髓细胞，TREM2蛋白在非刺激性骨髓细胞上的过度表达相关的免疫相关疾患。在一些实施方案中，相较于刺激性骨髓细胞，TREM2 mRNA或TREM2蛋白的过度表达是约至少2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍高的。
在一些实施方案中，治疗使受试者中的免疫应答增强。在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天性免疫应答。
在一些实施方案中，在静脉内、在肌肉内、以皮下方式、以表面方式、以口服方式、以经皮方式、在腹膜内、在眶内、通过植入、通过吸入、在鞘内、在室内或在鼻内施用抗体。可施用有效量的抗TREM2抗体以治疗癌症。抗TREM2抗体的适当剂量可基于待治疗的癌症的类型、抗TREM2抗体的类型、癌症的严重性和进程、个体的临床状况、个体的临床史和对治疗的响应、以及主治医师的判断来确定。
组合疗法
在一些实施方案中，本文提供的抗体与至少一种额外治疗剂一起施用。任何适合额外治疗剂都可与本文提供的抗体一起施用。在一些实施方案中，免疫疗法选自检查点抑制剂；T细胞的检查点抑制剂；抗PD1抗体；抗PDL1抗体；抗CTLA4抗体；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞与抗原递呈细胞两者的抗原结合蛋白；BiTE双抗原结合蛋白；toll样受体配体；细胞因子；细胞毒性疗法；化学疗法；细胞抑制剂；放射疗法；小分子抑制剂；小分子激动剂；免疫调节剂；和表观遗传调节剂，它们的组合。
在一些实施方案中，额外治疗剂是抗体。在一些实施方案中，额外治疗剂是结合肿瘤细胞表面上的一种或多种蛋白质的抗体。
对于治疗癌症，抗TREM2抗体可与一种或多种抑制免疫检查点蛋白的抗体组合。受到特别关注的是在肿瘤细胞的表面上展示的免疫检查点蛋白。已在临床癌症免疫疗法的情形下受到最活跃研究的免疫检查点受体即细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4；也被称为CD152)和程序化细胞死亡蛋白1(PD1；也被称为CD279)均是抑制性受体。阻断这些受体中的任一者的抗体的临床活性暗示抗肿瘤免疫性可在多种水平上加以增强，并且组合策略可被智能地设计，由机理考虑事项和临床前模型加以引导。
PD-1的两种配体是PD-1配体1(PD-L1；也被称为B7-H1和CD274)和PD-L2(也被称为B7-DC和CD273)。PD-L1在癌细胞上表达，并且通过结合它的在T细胞上的受体PD-1，它抑制T细胞活化/功能。阻断PD-1与它的在癌细胞上的同源配体PD-L1和PD-L2的相互作用的抑制剂可导致T细胞活化与功能两者均增加，并且阻止癌细胞逃避免疫系统。
在一些实施方案中，免疫疗法是干扰PD-1和PD-L1或PD-L2结合的药剂。在一些实施方案中，免疫疗法是抗PD1抗体。在一些实施方案中，免疫疗法是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，免疫疗法是抗PD-L2抗体。
各种PD-1、PD-L1和PD-L2抗体在本领域中是已知的。在一些实施方案中，额外治疗剂是以下中的至少一者：阿特珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、阿维鲁单抗(Avelumab)(PD-L1)、度伐鲁单抗(Durvalumab)(PD-L1)、尼鲁单抗(Nivolumab)(PD-1)、帕母单抗(Pembrolizumab)(PD-1)、西米普利单抗(Cemiplimab)(PD-1)、易普利单抗(Ipilimumab)(CTLA-4)、曲美木单抗(Tremelimumab)(CTLA-4)或它们的任何组合。
额外治疗剂可通过任何适合手段施用。在一些实施方案中，本文提供的抗体和额外治疗剂被包括在同一药物组合物中。在一些实施方案中，本文提供的抗体和额外治疗剂被包括在不同药物组合物中。
在其中本文提供的抗体和额外治疗剂被包括在不同药物组合物中的实施方案中，所述抗体的施用可发生在所述额外治疗剂的施用之前，同时，和/或之后。在一些实施方案中，本文提供的抗体和额外治疗剂的施用在彼此的约一个月内发生。在一些实施方案中，本文提供的抗体和额外治疗剂的施用在彼此的约一周内发生。在一些实施方案中，本文提供的抗体和额外治疗剂的施用在彼此的约一天内发生。在一些实施方案中，本文提供的抗体和额外治疗剂的施用在彼此的约十二小时内发生。在一些实施方案中，本文提供的抗体和额外治疗剂的施用在彼此的约一小时内发生。
药盒和制品
本申请提供了包括本文所述的抗体组合物中的任何一者或多者的药盒。在一些实施方案中，药盒还含有选自二级抗体、用于免疫组织化学分析的试剂、药学上可接受的赋形剂和说明手册以及它们的任何组合中的任一者的组成部分。在一个特定实施方案中，药盒包括包含本文所述的抗体组合物中的任何一者或多者以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本申请还提供了包括本文所述的抗体组合物或药盒中的任一者的制品。制品的实例包括小瓶(包括密封小瓶)。
实施例
以下是用于进行本发明的特定实施方案的实施例。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如数量、温度等)的准确性，但当然应虑及一些实验误差和偏差。
除非另外指示，否则本发明的实施将采用属于本领域的技能的常规蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。所述技术充分说明于文献中。参见例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,当前版本)；Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A和B卷(1992)。
实施例1：抗TREM2抗体的人源化。
克隆#237920的人源化
对小鼠TREM2和人TREM2具有特异性的单克隆大鼠IgG2B克隆#237920(R&D Systems目录号MAB17291)用于序列测定和人源化。简要来说，抗体中的二硫键用二硫苏糖醇(DTT)还原，并且游离硫氢基用碘乙酰胺加以烷基化。烷基化抗体用测序级内切蛋白酶消化，使用旋转柱加以纯化，并且通过LC-MS/MS分析来测定序列。以下显示序列。
将VH和VL序列与NCBI网站上的已知人种系序列的文库进行比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/；Ye,J.等Nucleic Acids Research 41:W34-W40(2013))。所用数据库是IMGT人VH基因(F+ORF，273个种系序列)和IMGT人VLκ基因(F+ORF，74个种系序列)。
对于237920VH，选择人种系IGHV3-23(等位基因1)作为接受体序列，并且人重链IGHJ4(等位基因1)接合区(J基因)选自在
对于237920VL，选择人种系IGKV1-39(等位基因1)作为接受体序列，并且人轻链IGKJ2(等位基因1)接合区(J基因)选自在the international ImMunoGeneTicsinformationwww.imgt.org(创建者和领导者：Marie-Paule Lefranc,Montpellier,France)处汇编的人接合区序列。
根据AbM定义确定CDR(对于将CDR定义进行比较的表格，参见Andrew C.R.Martin博士的网站www.bioinf.org.uk/abs/)。使人种系框架(即VH和VL中的非CDR残基)位置改变成相应亲本鼠序列例如用于使人源化抗体的结合最优化。
表1A显示mAb 237920的所创建人源化形式的VL、VH和完全重链和轻链序列。37017是通过额外突变从其创建其他人源化形式的亲本人源化克隆。表1B显示CDR序列。
表1B–人源化抗体的CDR
人源化抗体的框架的比对
在VL结构域中，在CDR中，基于序列和构象，Asn28、Asn31、Asn32和Asn53具有低下的脱酰胺潜力。Asn93具有低下至中等脱酰胺潜力，并且可显示低水平的这个翻译后修饰。在VH结构域中，基于序列和构象，Asn31具有低下的脱酰胺潜力。在CDR-H2中，Asn53具有中等脱酰胺潜力；为阻止翻译后修饰，可将Asn53改变成Gln、Ser或Ala，并且结合的维持得到以实验方式确定。在CDR-H3中，Trp100可暴露于溶剂，并且具有氧化潜力，尤其是在应激条件下。
溶液中内切蛋白酶消化
进行对单克隆抗体(mAb)的溶液中内切蛋白酶消化以进行mAb测序分析。将50μg抗体用DTT还原，使用碘乙酰胺加以烷基化，进行丙酮沉淀，并且在1μg/μL的浓度下在水中复原。通过遵循制造商说明，使用5种单种酶消化：Asp-N、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，进行对抗体样品的溶液中消化。接着使样品冻干，再混悬于0.1％TFA中，并且使用C18 Zip-Tip来纯化。接着通过真空离心来干燥样品，并且保持冷冻直至质谱测定法分析。
质谱测定法
完整质量测量
使mAb样品变性，还原，并且酸化。接着使用连接于Waters QToF Ultima Global质谱仪的Agilent 1100 HPLC(LC-ESI-TOF MS)分析蛋白质。使用Waters MassLynx 4.1软件处理(组合、减除、平滑和去卷积)适当LC-MS图谱。
LC-MS/MS分析
将纯化肽再混悬于0.1％甲酸中，并且将每种消化物的一半在装配有纳米喷雾源和EASY-nLC 1000系统(Thermo Fisher Scientific)的Orbitrap分析器(Q-Exactive，Thermo Fisher Scientific)上分析。在800巴的压力下将肽上样于装填有
表2概述人源化克隆的生物物理学特征。估计了四级结构中起作用的蛋白质链的总和的分子量和消光系数。作为默认，计算假定来自每个链的贡献都相等并且由单体达成。消光系数是每体积摩尔浓度蛋白质在280nm下的预测吸光度，以M-1cm-1的单位表示。潜在翻译后修饰诸如糖基化、磷酸化和蛋白水解未在分子量或消光系数估计中加以考虑。
实施例2：抗TREM2抗体的产生和表征
抗体产生和表征
使用标准方法将标准蛋白质表达载体转染至HEK293中，在此之后，使细胞生长7天，并且收集。除HEK293之外，抗体还在通过CRISPR/Cas9编辑使得缺乏哺乳动物a1,6-海藻糖基转移酶(FUT8)的293细胞(Alexander Weiss，University of Toronto)中产生。用1MHepes(pH 7.4)调整上清液pH，并且添加叠氮化钠以阻止微生物生长。KanCap A树脂用于捕集蛋白质，并且在用PBS和含有1M氯化钠的PBS洗涤之后，用50mM柠檬酸盐(pH3.5)、100mMNaCL洗脱抗体。在洗脱之后立刻，用含有0.5M精氨酸的1M Tris(pH 8)中和溶液。使用标准技术对缓冲液交换成PBS的蛋白质进行生物物理学表征。蛋白质通过OD280来定量，使用计算消光系数确定数量和浓度。还原和非还原SDS-PAGE(Biorad准则Tris/甘氨酸/SDS，4-20％)或Perkin Elmer GXII毛细管电泳系统用于测定纯度和近似分子质量。聚集状况通过HPLC来确定，其中使用Sepax Zenix-C SEC-300，3um，4.6*150mm尺寸排阻柱和PBS运行缓冲液，在280nm下进行检测。
使用表面等离子体共振(SPR)进行的抗体亲和力测量
使用Biacore T200(GE Healthcare,UK)，采用通过抗His捕集而被人工捕集在S系列CM5芯片上的人TREM2 His(Sino Biological,Beijing,P.R.China)，或通过胺偶联直接固定于芯片的TREM2人IgG1 Fc融合蛋白(内部SEC纯化至>95％纯度)，通过表面等离子体共振来测定结合动力学。持续2分钟在30ul/分钟下注射所指示抗体的连续稀释液。接着持续400秒在30ul/分钟下注射PBS或系统缓冲液以观察解离。结合响应通过减去在空白流动池上的响应来修正。对于动力学分析，使用k缔合值和k解离值的整体拟合的1:1朗缪尔(Langmuir)模型。Kd值由k缔合和k解离的比率确定。
表3显示通过SPR测量的抗体对人TREM2-His的结合亲和力。
表4显示通过SPR测量的抗体对人TREM2-Fc的结合亲和力。
在低配体密度(RL＝500RU)下，PI37017对人TREM2-Fc的结合动力学不导致良好拟合。这个数据指示在大鼠IgG2B克隆#237920的人源化后，存在于SEQ ID NO:31的序列(克隆37017)的位置97处的A和存在于位置98处的K可能导致人TREM2结合实质性丧失。这些框架残基的突变(A97T和K98R)导致由人源化克隆达成的人TREM2结合增加。参见例如克隆37012。
实施例3：抗TREM2抗体的细胞结合
细胞结合(EC50测量)：
将100,000至500,000个Expi 293亲本细胞或过度表达人或小鼠TREM2的Expi 293细胞涂铺在96孔板中，并且用Zombie Near Infrared(Biolegend)对死细胞进行染色。使所指示未缀合抗体的滴定液与这些细胞一起孵育，所述滴定液处于0ug/ml至10ug/ml的范围内，跨越8-10个点以1:3稀释范围获得。视它们的同种型(hIgG1或mIgG2a)而定，用AlexaFluor 647缀合的抗人Fc二级抗体或抗小鼠Fc二级抗体(Jackson Immunoresearch)检测这些初级未缀合抗体。Alexa Fluor 647信号通过流式细胞计量术(BD Fortessa X-14，BDBiosciences)测量。在Graphpad Prism(Graphpad Software)中，通过超过由HEK293亲本细胞产生的背景荧光的由抗体结合过度表达性细胞产生的曲线拟合信号来计算EC50值。
这个数据指示在大鼠IgG2B克隆#237920的人源化后，存在于SEQ ID NO:31的序列(克隆37017)的位置97处的A和存在于位置98处的K可能导致人TREM2结合实质性丧失。这些框架残基的突变(A97T和K98R)导致由人源化克隆达成的人TREM2结合增加。参见例如克隆37012。
表5显示抗TREM2抗体与细胞表面TREM2的半数最大饱和结合。
实施例4：PI-7012与抗PD-1抗体组合使抗肿瘤活性改进
材料和方法
CT26.WT(CRL-2638)细胞从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)购买。供在体内使用的抗体全都关于内毒素加以测试，并且以处于或低于0.2EU/mg蛋白质加以使用。来自克隆RMP1-14(Absolute Antibody Inc.目录号Ab00813-7.1)的抗小鼠PD-1抗体的氨基酸序列通过质谱测定法(LC-MS/MS)来测定。将单点突变[D265A]引入小鼠IgG1形式的RMP1-14抗体的Fc区中以消除与FcgR的结合，如文献(Nimmerjahn和Ravetch 2005 Science 310:1510-15121)中所述。小鼠IgG1[克隆MOPC-21]和小鼠IgG2a[克隆C1.18.4]同种型对照从BioXCell购买。PI-7012和Afuc-PI-7012(具有PI37012的CDR序列，并且用小鼠IgG2a形式加以鼠源化)分别以小鼠IgG2a形式在Expi293细胞(Thermo Fisher Scientific)或293/FUT8剔除细胞(University of Toronto)中产生，并且使用MabSelect蛋白A树脂(GE Life Sciences)纯化。将抗体用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱，并且在使用之前交换缓冲液。
涉及活体动物的所有实验程序都由Murigenics的机构动物护理和使用委员会核准。6-8周龄雌性BALB/c小鼠从Taconic购买，并且在关于动物设施进行一周驯化之后使用。CT26细胞在从液氮储备物解冻之后在3至7次次培养内收集，接着用于体内实验。提前一天将雌性Balb/C小鼠的右腹侧区域剃毛，并且准备用于注射。在肿瘤接种的当天，收集细胞，并且在30分钟内使用。为建立皮下肿瘤，植入1x106个CT26细胞，并且接着监测小鼠的肿瘤生长。使用公式(L×W2)/2由测径规对肿瘤尺寸的测量结果计算肿瘤体积，其中L是较长测量结果。当肿瘤达到80-100立方毫米的平均尺寸时，将小鼠随机分至如表6中所示的治疗组中：
每周两次监测肿瘤体积和体重，并且绘图以通过单因素ANOVA进行组群比较分析。当肿瘤体积达到约2000立方毫米时，当体重在研究期间降低超过15％时，或由于其他健康相关顾虑，使小鼠安乐死。
结果
我们通过糖基化工程改造(即通过产生抗TREM2 mAb的无海藻糖基化形式)确定了mAb与某些FcgR结合的亲和力是否可使抗肿瘤活性增加。PI-7012和afuc-PI-7012与抗PD-1抗体组合在CT26肿瘤模型中加以测试。PI-7012和afuc-PI-7012展示类似水平的肿瘤生长抑制(79％相对于88％TGI)。用afuc-PI-7012治疗导致30％治愈率。如图1A中所见，相比于PI-7012，afuc-PI-7012在与抗PD-1抗体组合时具有增加的抗肿瘤活性。PI-7012的无海藻糖基化对抗肿瘤活性的影响在对单个小鼠肿瘤体积的分析中得以更清楚地观察到(图1B和图1C)。这证明抗TREM2抗体的无海藻糖基化提供超过核心海藻糖基化抗体的显著治疗优势。
在研究的过程期间，在任何治疗组中都不存在显著体重减轻(图2)。体重减轻通常用作与治疗相关的毒性的替代量度。这个数据指示用作为单一药剂或与抗PD-1抗体组合的抗TREM2抗体进行的短期或长期治疗得以良好耐受，并且在无任何显著毒性被观察到的情况下发生。
实施例5：无与抗TREM2疗法相关的明显毒性
材料和方法
使来自在以上实施例中治疗的小鼠的组织(肺、肝、脑、肾和心脏)在10％中性缓冲化***中保存至少24小时，以组织学常规方式处理，在5-6μm下切割，并且用苏木精和伊红对切片进行染色。使用低效力(40-100倍)光学显微术考查经染色载片，并且通过HistoWiz获得图像。使用抗CD68抗体(AbD Serotec)检测CD68阳性细胞，并且使用光学显微镜对40倍切片的8-9个视野进行定量。
结果
相较于同种型对照治疗小鼠，通过对治疗后小鼠组织(肺、肝、心脏、肾和脑)的H&E染色进行的总体形态分析未揭示PI-7012、afuc-PI-7012和抗PD-1抗体组合治疗小鼠中的任何形态变化(图3显示对肺组织的染色)。
除H&E染色之外，还使用抗CD68抗体对组织的巨噬细胞进行染色。细胞内标志物CD68已在文献中作为可靠细胞化学标志物用于对发炎组织和肿瘤中的单核细胞/巨噬细胞进行免疫染色。在肺(图4A)中，以及在分析的其他组织中，相较于对照，在任何治疗组中都未观察到CD68+巨噬细胞数目的可辨别变化(图4B)，从而指示抗TREM2介导的消减特异性地发生在TME中。
实施例6：健康小鼠组织中的有限TREM2表达
材料和方法
所有动物研究都由Murigenics动物研究委员会核准。C57BL/6J-Trem2em2Adiuj/J(下文被称为TREM2KO)和对照C57BL/6J小鼠来自The Jackson Laboratory。收集完整肺、脾和骨，并且立刻处理以进行流式细胞计量术。并行地通过心脏穿刺收集血液。使用MiltenyiMACS组织解离试剂盒将组织处理成单细胞混悬液。使用1x红血细胞溶解缓冲液(Biolegend)使红血细胞溶解。将细胞用可固定活力染料(ThermoFisher Scientific)染色，随后处理以进行细胞表面染色。将抗小鼠免疫表型分析抗体连同Fc阻断剂一起在FACS缓冲液(2％FBS、2mM EDTA、1×PBS)中稀释，并且在冰上染色30分钟。在染色之后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，接着在含2％多聚甲醛的PBS中固定15分钟。所有数据都在LSRFortessa流式细胞仪(BD)或Attune流式细胞仪(Thermo Fisher)上收集，并且使用FlowJo软件分析。TREM2KO细胞染色显示于阴影化图中，野生型细胞染色显示于空心图中。
结果
TREM2在经活化巨噬细胞、不成熟树突细胞、破骨细胞和小神经胶质细胞上表达2,3。表达高水平的TREM2的细胞被认为参与免疫监视、细胞–细胞相互作用、组织碎片清除以及潜在炎症性反应的消退4。通过基因敲低或剔除使这些细胞上不存在TREM2表达会损害它们吞噬细胞碎片的能力，并且还使它们对调控性细胞因子的产生增加5。在生理环境中，在外周血液、脾、肝或肺中存在极低至不存在可检测TREM2表达，如FACS图(图5)中所见。然而，如果分离肺或肝驻留巨噬细胞，并且作为纯净细胞群体关于TREM2加以染色，那么TREM2表达变得可检测。
实施例7：TREM2主要在小鼠TAM上表达
材料和方法
通过标准方法处理肿瘤组织以分离单细胞混悬液。简要来说，用剃刀刀片将肿瘤精细切碎，并且在含有来自Miltenyi MACS解离试剂盒的酶的RPMI-1640培养基中消化。根据制造商推荐在GentleMACs中处理肿瘤，并且在37℃下孵育约40分钟。将消化混合物用含有2mM EDTA和2％胎牛血清的PBS淬灭。接着使单细胞混悬液穿过70um过滤器，然后用FACS缓冲液冲洗细胞。在离心之后，将细胞集结块再混悬于FACS缓冲液中，并且用抗体混合物染色以鉴定肿瘤相关巨噬细胞和其他免疫细胞群体6。TREM2KO细胞染色显示于阴影化图中，野生型细胞染色显示于空心图中。
结果
T细胞、B细胞、NK细胞和其他非骨髓细胞群体以及CD45阴性细胞不在细胞表面上表现可检测TREM2表达。然而，包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和骨髓源性抑制细胞(MDSC)的骨髓细胞子组在细胞表面上在不同程度上表达TREM2。在肿瘤微环境中呈TREM2阳性的细胞类型之中，TAM上的受体表达的密度显著高于其他细胞类型，而与肿瘤来源无关(CT26和MC38显示于图6中)。
实施例8：人外周血液白细胞中的有限TREM2表达
材料和方法
从正常人志愿者获得的外周血液单核细胞(PBMC)和经负性分选CD14+单核细胞由AllCells Inc提供。使用标准方案5使CD14+单核细胞在体外分化。CD14+单核细胞在由RPMI-1640培养基补充以2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素和10％热失活FBS所组成的完全培养基中培养。为触发向巨噬细胞的分化，将50ng/mL M-CSF添加至培养基中。每2–3天补充培养基。在7天之后，通过吸移来收集巨噬细胞，并且通过后续胰蛋白酶消化来收集粘附细胞。接着使细胞离心，并且再混悬于补充以抗生素、2％FBS和重组人IFN-g以及100ng/mL LPS的RPMI-1640中。使用标准骨髓性混合物将这些巨噬细胞与PBMC并行加以表面染色以评估细胞子组中TREM2的细胞表面染色。用对照mAb染色的细胞显示于阴影化图中。用抗TREM2 mAb染色的细胞显示于空心图中。
结果
如图7中所见，相较于评估的任何基于PBMC的细胞类型，离体分化的巨噬细胞展示显著更高的TREM2细胞表面受体密度。类似于文献中报道的观察结果，单核细胞和一些嗜中性白细胞表达较低水平的TREM2。
实施例9：TREM2主要在人TAM上表达
材料和方法
人肿瘤组织从合作人组织网络(Cooperative Human Tissue Network，CHTN)获得。使用Miltenyi MACS解离试剂盒和gentleMACS方案，将新鲜人肿瘤组织解离成单细胞混悬液。使用预先验证的多色FACS组套对人肿瘤组织的单细胞混悬液进行表面染色。所有数据都在LSR Fortessa流式细胞仪(BD)或Attune流式细胞仪(Thermo Fisher)上收集，并且使用FlowJo软件分析。数字指示每个群体的染色指数，定义为抗TREM2染色减去同种型对照染色。
结果
在肿瘤微环境内，相对于其他细胞，TREM2表达在TAM上在高水平下差异性表现(图8)，从而使得它成为TAM的翻译相关标志物。显示了在粘液性腺癌中的各种细胞群体中进行TREM2抗体(空心)或同种型对照(阴影化)染色的代表性直方图。总之，这个数据支持TREM2靶向剂将在对外周细胞或其他组织驻留免疫子组具有相对较低至不具有并行影响的情况下辅助进行特异性TAM消减的假设。
实施例10：抗TREM2抗体与抗PD-1抗体组合在多个同种同基因肿瘤模型中的抗肿瘤功效
材料和方法
CT26.WT(CRL-2638)、Py8119(CRL-3278)、4T1(CRL-2539)和EMT6(CTL-2755)细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购买。Panc-02细胞在AJES Life Sciences(StonyBrook,NY)处使用。供在体内使用的抗体全都处于或低于0.2EU/mg蛋白质。来自克隆RMP1-14的抗小鼠PD-1抗体的氨基酸序列通过质谱测定法(LC-MS/MS)来测定。将单点突变D265A引入RMP1-14抗体的Fc区中以消除与FcgR的结合。小鼠IgG1克隆MOPC-21和小鼠IgG2a克隆C1.18.4同种型对照从BioXCell购买。两者均呈小鼠IgG2a形式的PI-7012和afuc-PI-7012分别在Expi293细胞(Thermo Fisher Scientific)或293/FUT8剔除细胞中产生，接着使用MabSelect蛋白A树脂(GE Life Sciences)纯化。将mAb用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱，并且在使用之前交换缓冲液。
涉及活体动物的所有实验程序都由Murigenics的机构动物护理和使用委员会核准。雌性BALB/c或C57BL/6小鼠(6-8周龄)从Taconic或The Jackson Laboratory购买，并且在动物设施处驯化一周之后加以使用。肿瘤细胞在从液氮储备物解冻之后在3至7次次培养内收集，接着用于体内实验。在肿瘤细胞接种之前一天将雌性小鼠的右腹侧区域剃毛，并且准备用于注射。在肿瘤接种的当天，收集细胞，并且在30分钟内使用。为建立皮下肿瘤，将1x106个CT26、EMT6或Panc-02细胞或1x105个4T1细胞植入小鼠的适当品系中，接着监测动物的肿瘤生长。使相等体积的Py8119细胞的单细胞混悬液与基质胶(Corning目录号354248或354263)混合，随后每只小鼠植入2x106个细胞。
使用公式(L×W2)/2，利用测径规对肿瘤尺寸的测量结果计算肿瘤体积，其中L是较长测量结果。当肿瘤达到80-100立方毫米的平均尺寸时，将小鼠随机分至如表7中所示的治疗组中。
一周两次监测肿瘤体积和体重，并且绘图以通过单因素ANOVA进行组群比较分析。当肿瘤体积达到约2,000立方毫米时，或当体重在研究期间降低超过15％时，使小鼠安乐死。
结果
结果概述于表8中。通过公式：TGI％＝(1-{Tt/T0/Ct/C0}/1-{C0/Ct})X 100，在给药时期(t)结束时确定肿瘤生长抑制(TGI％)，其中Tt＝组合治疗者在时间t时的中值肿瘤体积，T0＝组合治疗者在时间0时的中值肿瘤体积，Ct＝同种型对照在时间t时的中值肿瘤体积，并且C0＝同种型治疗者在时间0时(在开始治疗之前)的中值肿瘤体积。
图9A-图9F显示抗TREM2 PI-7012或afuc-PI7012与抗PD-1抗体组合在多个同种同基因小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性。抗TREM2 mAb afuc-PI7012与抗PD-1 mAb组合在Panc-02胰腺肿瘤模型中导致显著抗肿瘤活性。图9A显示每个组中10只小鼠的平均肿瘤体积的平均值+/-标准偏差。图9B、图9C、图9D和图9E显示来自每个治疗组中单个动物的随着时间推移的肿瘤体积。图9F显示对在植入之后第32天的群组平均肿瘤体积的统计分析。使用GraphPad Prism软件中可用的统计分析评估群组之间的肿瘤体积差异。对研究数据依次进行单因素ANOVA和斯达克氏多重比较检验(Sidak’s multiple comparison test)。
如图9A和图9D中所见，皮下Panc-02肿瘤不对抗PD-1 mAb单一药剂免疫检查点阻断疗法或单独抗TREM2 mAb afuc-PI-7012疗法起响应。然而，用抗TREM2 mAb afuc-PI-7012和抗PD-1 mAb对携带Panc-02肿瘤的动物进行组合治疗导致显著肿瘤生长抑制。
在多个同种同基因肿瘤模型中测试骨髓性调谐以及免疫检查点介导的对CD8 T细胞耗竭的逆转的组合治疗策略。如表8中所示，抗TREM2 mAb和抗PD-1 mAb的组合导致显著肿瘤生长抑制，以及在若干测试肿瘤模型中导致完全消退。重要的是应注意，这些同种同基因模型在两种不同小鼠品系背景(原型Th-1 C57BL/6和Th-2 BALB/c品系)中生长，已知所述背景在体内生长于这些品系中的肿瘤中的免疫浸润物的组成方面具有显著差异。
实施例11：长期抗肿瘤免疫记忆在对抗TREM2 mAb加抗PD-1 mAb组合治疗起响应的小鼠中被引发
材料和方法
来自先前研究的在实施例9中所述的抗TREM2 mAb加抗PD-1 mAb治疗之后无肿瘤的BALB/c小鼠在三个月后用1x106个CT26肿瘤细胞再激发。在植入后持续25天测量肿瘤体积。年龄匹配的治疗原初性小鼠接受等同数目的CT26细胞，并且在研究时期期间追踪肿瘤生长。在研究时期期间不对小鼠提供额外治疗。
结果
在用抗TREM2 mAb afuc-PI-7012和抗PD-1 mAb的组合治疗之后治愈了它们的CT26肿瘤的小鼠建立了有效抗肿瘤记忆应答(图10)。经治愈小鼠即使在不存在额外疗法下也能够排斥任何新肿瘤生长，从而指示具有针对原始植入肿瘤的长期免疫记忆。这个形式的长期免疫记忆利用对剧烈CD8+效应记忆应答的维持。
参考文献
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尽管本发明已参考优选实施方案和各种替代性实施方案加以特定显示和描述，但相关领域技术人员将了解可在不脱离本发明的精神和范围下在其中进行各种形式和细节变化。
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序列
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